專利名稱：赭曲霉毒素a的高密度分子模擬表位肽的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種模擬表位肽的制備方法及應(yīng)用，具體說(shuō)涉及一種赭曲霉毒素A高 密度分子模擬表位肽的制備方法及其作為競(jìng)爭(zhēng)抗原在赭曲霉毒素A免疫學(xué)檢測(cè)方法中 的應(yīng)用。 技術(shù)背景當(dāng)前，大量有毒有害物質(zhì)如黃曲霉毒素B,、赭曲霉毒素A等對(duì)人體健康和環(huán)境造 成了嚴(yán)重危害，以酶聯(lián)免疫吸附分析方法為代表的免疫學(xué)檢測(cè)方法具有較高的靈敏度 和特異性，對(duì)樣品的純度要求不高，且搡作簡(jiǎn)單，特別適合于大批量樣本的檢測(cè)，已 被廣泛應(yīng)用黃曲霉毒素Bi、赭曲霉毒素A等有毒有害物質(zhì)的快速檢測(cè)。大多數(shù)有毒有害物質(zhì)屬小分子物質(zhì)，沒(méi)有供二株不同抗體結(jié)合的表位，必須采用 竟?fàn)幟庖叻治龇椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。因此，需要制備用于竟?fàn)幟庖叻治龅母?jìng)爭(zhēng)抗原。常規(guī)制 備竟?fàn)幙乖没瘜W(xué)方法將這些有毒有害物質(zhì)與載體偶聯(lián)，該方法存在以下弊病①試 劑本身含有毒有害物質(zhì)，若操作不慎，會(huì)對(duì)生產(chǎn)和搡作人員的健康造成極大的危害， 并可導(dǎo)致二次污染等環(huán)保隱患。②大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品依賴進(jìn)口，部份標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得且價(jià)格昂貴，使檢測(cè)試劑的成本居高不下。③偶聯(lián)反應(yīng)的重復(fù)性差，部份標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定， 致使檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)量難以控制。由此，科學(xué)家們?cè)O(shè)想用有毒有害物質(zhì)的替代品參與免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，建立無(wú)毒的免 疫學(xué)檢測(cè)方法。新興的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)可高效挑選出能與靶分子相結(jié)合的噬 菌體，并利用這些噬菌體再感染大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，即可獲得大量的能模擬該靶分子 表位的肽。展示用噬菌體的基因組編碼ll種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白，與噬菌 體展示密切相關(guān)的是二種不同的結(jié)構(gòu)蛋白pVHl和pIII。 pVlll是噬菌體的主要衣殼蛋白， 單鏈DNA被包裹在大約2700-3000個(gè)pVIII分子組成的管狀結(jié)構(gòu)中。展示在pVIIl上的外源 蛋白或多肽由于PVIH拷貝數(shù)量大，特別適用于制備基因藥物等需要大量表達(dá)的抗原。 次要衣殼蛋白pffl其前體由424個(gè)氨基酸殘基組成，形成3-5個(gè)拷貝，位于噬菌體的 尾部，是噬菌體感染宿主所必需的。展示在次要衣殼蛋白PIII上的展示肽庫(kù)由于拷貝 數(shù)少，特別適用于篩選與靶分子有高度親和力的配體分子，如抗原表位研究等。有文獻(xiàn)報(bào)道(劉仁榮，隨機(jī)肽庫(kù)篩選赭曲霉毒素A模擬表位及其應(yīng)用，中國(guó)公共 衛(wèi)生，2005, 21 ( 8 ): 944-946 ):用抗赭曲霉毒素A單克隆抗體淘選融合到M13噬菌 體次要衣殼蛋白(pIII)上的Ph.D,7噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)，并公布了赭曲霉毒素A的 模擬表位肽序列。然而，這些與抗體有高度親和力的模擬表位肽都是表達(dá)在次要衣殼 蛋白上，拷貝數(shù)量太少，無(wú)法將其直接應(yīng)用于竟?fàn)幙乖闹苽?。其原因在于竟?fàn)幟?疫分析方法對(duì)競(jìng)爭(zhēng)抗原上的小分子半抗原表位的密度有一定的要求，若密度太低，競(jìng) 爭(zhēng)抗原上能結(jié)合的抗體數(shù)量就太少，導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物無(wú)法被檢測(cè)。因此，在獲得 模擬表位的氨基酸序列后，通常釆用化學(xué)方法合成模擬表位肽，再通過(guò)化學(xué)方法將其偶聯(lián)到載體分子上，形成具有一定密度的模擬表位竟?fàn)幙乖梢蕴娲髑苟舅谹 競(jìng)爭(zhēng)抗原用于免疫學(xué)檢測(cè)分析，毒性較赭曲霉毒素A競(jìng)爭(zhēng)抗原極大降低，但其不可擴(kuò)增，成本較使用赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品有所下降但仍然較高，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種赭曲霉毒素A模擬表位肽的制備方法，得到 的模擬表位肽模擬表位密度高，無(wú)需偶聯(lián)載體蛋白即可直接替代赭曲霉毒素A竟?fàn)幙?原用于競(jìng)爭(zhēng)免疫分析。為解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，它包括如下步驟(1) 模擬表位核苷酸序列合成用化學(xué)方法合成二條包含赭曲霉毒素A模擬表位 及5'端分別有核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI和BamHI的互補(bǔ)核苷酸序列，退火；(2) 序列導(dǎo)入噬菌體載體擴(kuò)增將序列與經(jīng)相同酶切的噬菌體載體PC89在連接 酶作用下連接(如圖l),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，挑單菌落進(jìn) 行陽(yáng)性克隆鑒定；(3) 高密度模擬表位肽的表達(dá)和純化。步驟(1)中所述的所述的互補(bǔ)核苷酸序列最好為T1: 5 ' - GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3 ' ( EcoRI )和T" 5 ' -GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3 ' (BaraHI)。本發(fā)明還涉及到所述方法制備出的赭曲霉毒素A高密度分子模擬表位肽作為竟 爭(zhēng)抗原在赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析中的應(yīng)用。還涉及到以赭曲霉毒素A高密度模擬表位蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)抗原替代赭曲霉毒素A人 工抗原，合成模擬表位多肽替代赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品用于ELISA檢測(cè)。本發(fā)明還涉及到一種赭曲霉毒素A免疫層析檢測(cè)試紙的制作方法，包括如下步驟， (A)赭曲霉毒素A抗原的制備，包括單克隆抗體的免疫抗原和赭曲霉毒素A檢測(cè)抗原的 制備；(B)硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線的制備；(C)示蹤粒子結(jié)合物墊的制備；(D) 組裝試紙條。具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的赭曲霉毒素A免疫層析檢測(cè)試紙(參見(jiàn)跗圖2),包括襯 墊[l]，樣品墊[2]，示蹤粒子結(jié)合物墊[3],硝酸纖維素膜[4]，吸水墊[5]，檢測(cè)線[6]， 質(zhì)控線[7]，在襯墊[1]上按順序有樣品墊[2],示蹤粒子結(jié)合物墊[3],硝酸纖維素膜 [4],吸水墊[5];示蹤粒子結(jié)合物墊[3]上有示蹤粒子標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A的抗體 [9],硝酸纖維素膜[4]上還設(shè)有檢測(cè)線[6]和質(zhì)控線[7]，檢測(cè)線[6]上有赭曲霉毒素A 檢測(cè)抗原[8],質(zhì)控線[7]上有抗抗體[10]，其中抗抗體[10]是抗赭曲霉毒素A的抗體 [9]的抗體。本發(fā)明所述的示蹤粒子，可選用膠體金顆粒、乳膠顆粒、膠體硒顆粒、明膠顆粒 或者磁性顆粒。本發(fā)明所述的示蹤粒子若選用常用的顯色標(biāo)記，當(dāng)檢測(cè)線、質(zhì)控線正常顯色，肉 眼可直接分辨，若采用磁性顆粒作為示蹤粒子，則需儀器判讀。儀器分辨磁性顆粒的4靈敏度更高。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明制備出的赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽，模擬表位密度高，無(wú)需偶聯(lián)載體蛋白可直接提純后作為竟?fàn)幙乖瓘V泛應(yīng)用于赭曲霉毒素A的免疫學(xué)檢測(cè)中，并且可以擴(kuò)增，使成本大為降低，且安全無(wú)毒保護(hù)了搡作人員的身體健康，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和巿場(chǎng)前景。


圖1為PC"噬菌體載體的構(gòu)建。 圖2為間接競(jìng)爭(zhēng)ELSEA標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為赭曲霉毒素A免疫層析檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。l為襯墊，2為樣品墊，3 為示蹤粒子結(jié)合物墊，4為硝酸纖維素膜，5為吸水墊，6為檢測(cè)線，7為質(zhì)控線，8 為赭曲霉毒素A檢測(cè)抗原，9為抗赭曲霉毒素A的抗體。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但所述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明。 實(shí)施例1。赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽的制備方法 (1 )模擬表位表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定根據(jù)赭曲霉毒素A的序列，用化學(xué)方法合成二條包含赭曲霉毒素A模擬表位及核 酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的核苷酸序列，以其中 一模擬表位肽為例，合成T1: 5 ' - GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3 ' ( EcoRI ).和T2 : 5 ' -GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3 ' (BamHI)，加dd H20分別配成 20pmol/jul的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10nl混合后，置于PCR儀，65°C保溫10 min，然后緩慢降溫至室溫，-20°C保存。(2) 序列導(dǎo)入、鑒定取PC89質(zhì)粒DM 32 ul (30 jag),加10 x酶切buf f er 4|al， EcoRI (10 U/ |i 1) 2 |i 1, BamHI (10 U/ n 1) 2 n 1, 37°C酶切2 h， 65°C 20 min滅活，2. 5 °/。瓊 脂糖電泳觀察結(jié)果。在紫外燈下迅速切下目的條帶，用UNIQw膠回收試劑盒回收。將 回收后的PC89DNA片段與雙鏈寡聚核苷酸連接。連接反應(yīng)體系雙鏈寡聚核苷酸4 y 1, PC89載體DNA4jn 1, T4DM ligase (10U/ju 1) 1 |a 1， 10xT4 DNA 1 igation buffer lyl，總體積lOnil， 16'C連接過(guò)夜。連接液全量轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，熱激后 涂布已加入40jul X-gal (4 mg/ ml)及4 u 1 ITPG(40 mg/ml)的含Amp的LB平板, "。C培養(yǎng)過(guò)夜，挑單菌落擴(kuò)增細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定。(3) 高密度模擬表位蛋白的表達(dá)經(jīng)鑒定后的陽(yáng)性克隆挑單菌落接種于2ml Amp + Tet雙抗SOC培養(yǎng)液中，37'C振 蕩培養(yǎng)2h,轉(zhuǎn)移至400ml Amp + Tet雙抗SOC培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至A600約 0.4時(shí)，加入lxl012 PFU的VCSM13, 37。C振蕩培養(yǎng)1 h，再加入終濃度為70mg/ L 的卡那霉素以及終濃度為lmmo1/ L的ITPG， 37。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。5(4)高密度模擬表位蛋白的純化將培養(yǎng)液4"C10000rpm離心10min，上清液加入PEG/ NaCl， 4'C沉淀過(guò)夜；4°C 10000rpm離心15min,去上清，再用1 mL TBST懸浮喧菌體,加入PEG /NaCl冰上孵 育60 min; 4。C離心15min,去上清，沉淀用200 m 1 TBST懸浮并測(cè)滴度，4。C保存。實(shí)施例2。赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽的在赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法 中的應(yīng)用U)取實(shí)施例1中純化的高密度模擬表位蛋白，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在280nm 的吸光值(A280mn)，根據(jù)Warburg-christian公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml ) =1. 55A280nm-0. 76A260線確定其蛋白濃度。(2 )采用方陣滴定確定高密度模擬表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗體的最佳使用濃 度。具體如下A、 用磷酸緩沖溶液(PBS, pH7.2)將高密度模擬表位蛋白配制成40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25和0.625 jug/ml的濃度，按每條酶標(biāo)板一個(gè)濃度(每條8個(gè)孔)，每孔 lOOjnL加入酶標(biāo)板中，4'C過(guò)夜。B、 傾去包被液，PBST(PBS加0.2%的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣 干，每孔加入300 yL3。/。的脫脂牛奶(溶于PBST)作為封阻液，37'C保溫保濕1小時(shí)； 傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣干。C、 將抗赭曲霉毒素A抗體用PBS倍比稀釋成1: 1000、 1: 2000、 1: 4000、 1: 8000、 1: 16000、 1: 32000和1: 64000的濃度，依次加入各條處理好的酶標(biāo)板板孔 中，最后一孔加入PBS作空白對(duì)照，37。C保溫保濕l小時(shí)。D、 PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干。每孔加lOO)aL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記的抗抗體(酶標(biāo)二抗)，37'C，保溫保濕l小時(shí)。E、 PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干。每孔加OPD或TMB底物液100nL, 37。C保溫保濕避光反應(yīng)IO分鐘后，每孔加入50pL 2M H2S04終止反應(yīng)，以空白對(duì)照 孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定酶標(biāo)板492nm (OPD)或"Onm (TMB)的吸光值，根據(jù)所有孔 吸光值進(jìn)行比較選擇吸光值在1. 5左右最低的高密度模擬表位蛋白包被濃度和最大的 抗體稀釋度即為高密度模擬表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗體的最佳使用濃度。(3)通過(guò)化學(xué)合成模擬表位多肽(IRPMDVP),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線確定合成模擬表位多 肽(IRPMDVP)與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的劑量關(guān)系，以之替代赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品。具體實(shí)施如下A、 根據(jù)方陣滴定確定的赭曲霉毒素A高密度模擬表位蛋白的濃度。高密度模擬表 位蛋白溶于O. 1M pH8. 6的NaHCO" 100jliL/孔，4°C包被過(guò)夜。B、 PBST洗板四次，3"/。脫脂牛奶300juL /孔4°C封閉2h。C、 PBST洗板四次，各孔分別加入不同濃度的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品、合成模擬表 位多欣50mL,再全部加入方陣滴定確定的抗赭曲霉毒素A抗體50hL，振蕩混勻，37。c保溫保濕lh。d、 pbst洗滌6次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體(100)jL/孔)，37。c作用lh。E、 洗滌6次。聯(lián)苯二胺(OPD)顯色，2M H2S04終止反應(yīng)，測(cè)定492nm波長(zhǎng)光密度 (OD值)，計(jì)算各濃度的結(jié)合率，結(jié)合率(％) = B/B。xlOOy。(Bo為不加赭曲霉毒素A或 不加合成多肽的OD值，B為加赭曲霉毒素A或加入合成多肽的OD值)。F、 根據(jù)赭曲霉毒素A的濃度和結(jié)合率繪制赭曲霉毒素A競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，根據(jù)合成模擬表位多肽的濃度和結(jié)合率繪制多肽竟?fàn)幰种魄€，通過(guò)參照標(biāo)準(zhǔn)曲線中相同結(jié)合 率可得出標(biāo)準(zhǔn)品赭曲霉毒素A與合成模擬表位多肽的劑量關(guān)系。(4)高密度模擬表位蛋白作為竟?fàn)幙乖娲髑苟舅谹人工抗原，合成模擬表 位多肽替代赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品用于ELISA檢測(cè)，具體步驟如下A、 根據(jù)方陣滴定確定的最佳高密度模擬表位蛋白濃度，用磷酸緩沖溶液(PBS， pH7.2)稀釋，在酶標(biāo)板中每孔加lOOjiiL高密度模擬表位蛋白，4'C過(guò)夜。B、 傾去包被液，PBST(PBS加0.2%的吐溫20)洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣 干，每孔加入300(aL3yn的脫脂牛奶(溶于PBST)作為封阻液，37。C保溫保濕l小時(shí)； 傾去封阻液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣干。C、 在酶標(biāo)板各孔中加入濃度為40000, 20000, 10000， 5000， 2500， 1250, 625, 312.5, 156， 100, 50和0pg/mL的合成模擬表位多肽或待測(cè)樣品(溶于35。/。甲醇PBS) 50jliL,再全部加入以PBS稀釋的抗赭曲霉毒素A抗體50jliL,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(以 PBST代替抗體)，37°C,保溫保濕l小時(shí)；D、 PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干。每孔加100juL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記的抗抗體(酶標(biāo)二抗)，37°C，保溫保濕l小時(shí)E、 PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干。每孔加OPD或TMB底物液100juL, 37'C保溫保濕避光反應(yīng)10分鐘后，每孔加入50|aL 2M H2S04終止反應(yīng)，以空白對(duì)照 孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定酶標(biāo)板492認(rèn)(OPD)或450nm(TMB)的吸光值，計(jì)算各濃度 的結(jié)合率，結(jié)合率(％) = B/B。^100y。(B。為合成模擬表位多肽濃度為0時(shí)的吸光值，B 為合成模擬表位多肽各濃度的吸光值)，同樣計(jì)算各待測(cè)樣品孔的結(jié)合率(B為待測(cè)樣 品孔的吸光值)，以各合成模擬表位多肽濃度的常用對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)，各濃度 合成模擬表位多肽相應(yīng)的結(jié)合率(B/B。y。)為縱坐標(biāo)制作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(如圖2 )。F、 以各待測(cè)樣品孔的結(jié)合率對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo)，查標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)，再通過(guò)步 驟(3)確定的合成模擬表位多肽與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的劑量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可 得出樣品中赭曲霉毒素A的含量，或可用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法專用分析軟件對(duì)數(shù)據(jù) 進(jìn)行分析得出結(jié)果。實(shí)施例3將實(shí)施例2中的合成模擬表位多肽替換成高密度模擬表位肽，其余同實(shí)施例2。 實(shí)施例4。赭曲霉毒素A免疫層析檢測(cè)試紙
一種赭曲霉毒素A免疫層析檢測(cè)試紙(圖3),包括襯墊l,樣品墊2，示蹤粒子 結(jié)合物墊3，硝酸纖維素膜4，吸水墊5，檢測(cè)線6，質(zhì)控線7，在襯墊l上按順序有 樣品墊2，示蹤粒子結(jié)合物墊3，硝酸纖維素膜4，吸水墊5;示蹤粒子結(jié)合物墊3上 有示蹤粒子標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A的抗體9，硝酸纖維素膜4上還設(shè)有檢測(cè)線6和質(zhì) 控線7，檢測(cè)線6上有赭曲霉毒素A檢測(cè)抗原8，質(zhì)控線7上有抗抗體10,其中抗抗 體10是抗赭曲霉毒素A的抗體9的抗體。
檢測(cè)原理是這樣的在樣品墊2上滴加樣品，如果樣品中有赭曲霉毒素A，則赭 曲霉毒素A經(jīng)層析作用移動(dòng)到示蹤粒子結(jié)合物墊3,與限量的抗赭曲霉毒素A的抗體9 結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)到檢測(cè)線6時(shí)，示蹤粒子標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A的抗體9已無(wú)多余的結(jié) 合位點(diǎn)與檢測(cè)線6上的檢測(cè)抗原(高密度模擬表位蛋白)8結(jié)合，檢測(cè)線6不顯色或 不出現(xiàn)磁性增強(qiáng)。示蹤粒子標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A的抗體9繼續(xù)向前移動(dòng)到質(zhì)控線7, 與質(zhì)控線7上的抗抗體10反應(yīng)，質(zhì)控線7顯色或出現(xiàn)磁性增強(qiáng)。若樣品中無(wú)赭曲霉毒 素A8，則示蹤粒子結(jié)合物墊3上的示蹤粒子標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A的抗體9和檢測(cè)線 6上的檢測(cè)抗原8結(jié)合，檢測(cè)線6顯色或出現(xiàn)磁性增強(qiáng)，質(zhì)控線7顯色或出現(xiàn)磁性增 強(qiáng)。
本實(shí)施例選用的示蹤粒子為膠體金顆粒。
8
權(quán)利要求
1、一種赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽的制備方法，其特征是(1)用化學(xué)方法合成二條包含赭曲霉毒素A模擬表位及5′端分別有核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI和BamHI的互補(bǔ)核苷酸序列，退火；(2)將序列與經(jīng)相同酶切的噬菌體載體PC89在連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，挑單菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定；(3)表達(dá)和純化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是所述的互補(bǔ)核苷酸序列為 T1: 5 ' - GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3 '和T" 5 ' -GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3 '。
3、 權(quán)利要求1所述的模擬表位肽作為競(jìng)爭(zhēng)抗原在赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析 中的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是以高密度模擬表位蛋白作為竟?fàn)幙乖?代赭曲霉毒素A人工抗原，合成模擬表位多肽替代赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品用于ELISA檢 測(cè)。
5、 權(quán)利要求1所述的模擬表位肽制作赭曲霉毒素A免疫層析檢測(cè)試紙。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試紙，其特征是所用示蹤粒子，為膠體金顆粒、乳膠顆 粒、膠體硒顆粒、明膠顆?；蛘叽判灶w粒。
全文摘要
赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽的制備方法及應(yīng)用，其特征是先用化學(xué)方法合成二條包含赭曲霉毒素A模擬表位及5′端分別有核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI和BamHI的互補(bǔ)核苷酸序列，退火；然后將序列與經(jīng)相同酶切的噬菌體載體PC89在連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，挑單菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定；再表達(dá)和純化；本發(fā)明制備出的赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽，模擬表位密度高，無(wú)需偶聯(lián)載體蛋白可直接提純后作為競(jìng)爭(zhēng)抗原廣泛應(yīng)用于赭曲霉毒素A的免疫學(xué)檢測(cè)中，并且可以擴(kuò)增，使成本大為降低，且安全無(wú)毒保護(hù)了操作人員的身體健康。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101633932SQ200910115449
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者華 劉, 劉仁榮 申請(qǐng)人:江西科技師范學(xué)院