專利名稱：使用納米脂質(zhì)體免疫佐劑制備抗小分子物質(zhì)抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及制備抗小分子物質(zhì)抗體的方法。
背景技術(shù)：
抗原是能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的外源性物質(zhì)。免疫佐劑又稱非特異性免 疫增生劑，本身不具抗原性，但同抗原一起注射到機(jī)體內(nèi)能增強(qiáng)免疫效果。免疫佐劑 的生物作用包括(1)改變了抗原的物理性狀，使抗原物質(zhì)緩慢地釋放，延長(zhǎng)抗原的 作用時(shí)間；(2)增加了抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細(xì)胞吞噬；(3)佐劑能刺激 吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的處理；(4)佐劑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)輔助T細(xì)胞的作 用。
脂質(zhì)體生物靶向技術(shù)因其"人工生物膜"與細(xì)胞膜的高度親和性，以極強(qiáng)的穿透 力進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，已被世界醫(yī)藥界稱為"二十一世紀(jì)生物導(dǎo)彈"。在疫苗研究 領(lǐng)域，脂質(zhì)體由于其在體內(nèi)能夠迅速被免疫細(xì)胞捕獲，體現(xiàn)出令人矚目的高效乾向作 用，已經(jīng)被看作一種頗具前景的新型免疫佐劑而被業(yè)界寄以厚望。脂質(zhì)體包封抗原可 使抗原延緩釋放，并且脂質(zhì)體顆粒有刺激機(jī)體免疫反應(yīng)的作用。作為一種新型佐劑， 脂質(zhì)體在疫苗領(lǐng)域獲得了成功。
能夠刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)稱為抗原，抗原一般需要有大于10000Da 的分子量和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。分子量小于1000的物質(zhì)只能被抗體識(shí)別而不能刺激產(chǎn)生抗 體，這樣的物質(zhì)稱為半抗原。要產(chǎn)生針對(duì)小分子半抗原物質(zhì)的抗體，必須把其共價(jià)偶 聯(lián)到大分子載體上構(gòu)成人工免疫抗原，免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)小分子物質(zhì)的抗體。而有的 小分子物質(zhì)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后不穩(wěn)定或容易受其它因素的干擾，釆用傳統(tǒng)的乳化佐劑難 以產(chǎn)生高滴度的抗體。
把抗原包埋在納米脂質(zhì)體內(nèi)部，通過(guò)靜脈注射對(duì)動(dòng)物進(jìn)行全身系統(tǒng)免疫，刺激動(dòng) 物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。脂質(zhì)體雙分子層隔絕生物體內(nèi)酸、酶、金屬離 子等因素對(duì)所包埋抗原的作用，有效防止其的分解、變性、失活；通過(guò)靜脈注射，脂 質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)迅速匯集到動(dòng)物中樞免疫系統(tǒng)，能夠快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答；這些優(yōu)點(diǎn)很適 合制備針對(duì)小分子物質(zhì)的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是把偶聯(lián)小分子物質(zhì)的人工免疫抗原包埋在脂質(zhì)體內(nèi)，注射到動(dòng)物 體內(nèi)進(jìn)行免疫。脂質(zhì)體雙分子層隔絕生物體內(nèi)酸、酶、金屬離子等因素對(duì)所包埋抗原 的作用，有效防止其的分解、變性、失活；通過(guò)靜脈注射，脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)迅速匯集 到動(dòng)物中樞免疫系統(tǒng)，能夠快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答；這些優(yōu)點(diǎn)很適合制備針對(duì)小分子物質(zhì) 的單克隆抗體。
在制備小分子物質(zhì)(獸藥、真菌毒素等)抗體的過(guò)程中，需要把小分子化學(xué)偶聯(lián) 到蛋白質(zhì)載體上，合成人工抗原增加小分子物質(zhì)的免疫原性，然后免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)小分子物質(zhì)的抗體。
一些小分子物質(zhì)經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾連接到蛋白質(zhì)后，穩(wěn)定性降低。另一方面，當(dāng)人工 抗原進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，PH、酶、'金屬離子等因素會(huì)對(duì)一些小分子物質(zhì)產(chǎn)生影響。傳統(tǒng)的 免疫途徑使用乳化佐劑與抗原混合，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，需要較長(zhǎng)時(shí)間抗 原才能被捕獲、加工、提呈，繼而刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體。如果縮短抗原提呈過(guò)程， 穩(wěn)定性低的小分子物質(zhì)分解可能性降低，人工抗原受pH、酶、金屬離子等因素影響減
少，產(chǎn)生特異性抗體的機(jī)會(huì)增加。 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
使用納米脂質(zhì)體作為新型免疫佐劑，包埋偶聯(lián)小分子物質(zhì)的人工抗原免疫動(dòng)物， 進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后快速實(shí)現(xiàn)抗原提呈產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。使用脂質(zhì)體免疫佐劑包埋小
分子人工免疫抗原，免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體的各個(gè)步驟如下
(1)將包埋材料大豆卵磷脂和膽固醇以1.8-2.5/1的重量比混勻，再以W/V為 1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶劑中，加入到圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上35-40 'C減壓蒸干，使大豆卵磷脂和膽固醇貼在容器壁上形成雙分子層薄膜；
(2 )在圓底燒瓶中加入濃度為1. 5-2. 0 mg/mL、與包埋材料的物料比為2. 0-2. 5/1 的抗原溶液，強(qiáng)烈晃動(dòng)，包埋材料分散到溶液中并在表面張力作用下收縮成球狀脂質(zhì) 體，把部分的抗原包埋到脂質(zhì)體內(nèi)部，其中緩沖液用pH=6.8-7.2的20mM的PBS;使 脂質(zhì)體的粒徑控制在合適范圍并獲得高抗原包封效率。粒徑和對(duì)小分子人工免疫抗原 的包封效率，是影響免疫效率的兩個(gè)關(guān)鍵的因素，脂質(zhì)體的粒徑控制在50-100nm，以 包封在脂質(zhì)體的小分子人工免疫抗原的比例為35-50%。
(3)以包封在脂質(zhì)體的小分子人工免疫抗原計(jì)算，以每次200-300嗎/只小鼠的 量進(jìn)行靜脈注射免疫；在初次免疫之后第3-4周，以同樣免疫劑量對(duì)小鼠靜脈注射脂 質(zhì)體包封的抗原，進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫；在與第一次加強(qiáng)免疫相隔大于2-4周的時(shí)間 段里，以同樣免疫劑量對(duì)小鼠靜脈注射脂質(zhì)體包封的抗原，進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫；選 擇特異性抗體效價(jià)高的小鼠用于細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，篩選所需要的單克隆抗體。
抗原包封率的計(jì)算將上述條件所制備的包埋了小分子人工免疫抗原的脂質(zhì)體， 以"00-5000rpm的速度進(jìn)行離心，檢測(cè)上清溶液的蛋白質(zhì)濃度并計(jì)算上清液中的蛋白
量，推算出被包埋的人工免疫抗原.的量，除以人工免疫抗原的總投料量，就是人工免 疫抗原包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部的包封率。
抗原免疫量的計(jì)算人工免疫抗原的總量，乘以人工免疫抗原包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部 的包封率，就是包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部的人工免疫抗原的量。
本發(fā)明的有益效果是①包埋材料大豆卵磷脂、膽固醇生物相容性好，能夠在動(dòng) 物體內(nèi)被降解、無(wú)毒性；②脂質(zhì)體進(jìn)入外周血分布到淋巴結(jié)和中樞免疫器官，迅速被 免疫細(xì)胞捕獲實(shí)現(xiàn)抗原提呈；③抗原被包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部，能夠避免受pH、酶、金屬 離子等因素的影響，增加抗原的穩(wěn)定性，確保免疫效果。


圖1為脂質(zhì)體(liposome)結(jié)構(gòu)示意圖。其中 圖1A磷脂在水中形成單層結(jié)構(gòu)，親水端向下，疏水端向上； 圖1B在表面張力的作用下，磷脂單層收縮成為疏水端向內(nèi)的球體； 圖1C在一定條件下，磷脂形成雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體；
圖1D脂質(zhì)體內(nèi)部是親水層，中間是疏水層，分別包埋不同的物質(zhì)，a為疏水性物 質(zhì)，b為疏水層，c為親水性物質(zhì)。
圖2為在金屬離子螯合作用下，喹諾酮藥品母核抗原表位被金屬離子遮蔽的情況 的示意圖。其中d為載體蛋白，e為喹諾酮藥品母核，f為喹諾酮藥品母核抗原表位被 金屬離子遮蔽。
圖3為制備抗羥氨芐青霉素抗體時(shí)，羥氨辛青霉素分子中四元環(huán)不穩(wěn)定的情況示 意圖。其中g(shù)為羥氨芐青霉素，h為載體蛋白，i為羥氨芐青霉素的羧基于蛋白質(zhì)氨 基結(jié)合，J為P內(nèi)酰胺環(huán)容易開(kāi)環(huán)降解。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1。使用脂質(zhì)體免疫途徑制備抗氟喹諾酮抗生素母核單克隆抗體。 如附圖2左所示，方框部分是氟喹諾酮抗生素母核，是幾十中氟喹諾酮類藥品的 共同結(jié)構(gòu)，得到抗氟喹諾酮抗生素母核的抗體，就能夠檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥品的 總殘留量。但是，如附圖2右所示，氟喹諾酮抗生素母核會(huì)在體內(nèi)會(huì)與金屬離子發(fā)生 螯合，繼而與其它蛋白發(fā)生結(jié)合而被掩蔽，難以順利產(chǎn)生抗氟喹諾酮抗生素母核的特 異性抗體。
使用傳統(tǒng)的弗氏佐劑進(jìn)行免疫，要先將抗原溶液與弗氏佐劑等量混合，充分振動(dòng) 乳化之后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。在皮下注射到活化特異性B細(xì)胞的漫長(zhǎng)過(guò)程中， 抗原、抗原-MH,CII復(fù)合物一直被血液、淋巴液中的4丐、鎂、鐵、鋅等金屬離子包圍， 喹諾酮母核位點(diǎn)隨時(shí)會(huì)與這些金屬離子螯合而被遮蔽。
利用本發(fā)明技術(shù)，使用逆向蒸發(fā)法，包埋材料大豆卵磷脂和膽固醇以2.0/1的重 量比混句，再以W/V為1/500的比例溶解于二氯甲烷溶劑中，加入到圓底燒瓶，在旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上35。C減壓蒸干，使大豆卵磷脂和膽固醇貼在容器壁上形成雙分子層薄膜； 在圓底燒瓶中加入濃度為1.5mg/mL、與包埋材料的物料比為2. 0/1的抗原溶液，強(qiáng)烈 晃動(dòng)，包埋材料分散到溶液中并在表面張力作用下收縮成球狀脂質(zhì)體，把突出氟喹諾 酮抗生素母核的人工抗原(如圖2)包埋在脂質(zhì)體中，其中緩沖液用pH=6.8的20mM 的PBS;以每只小鼠200ng的抗原量，采取靜脈注射的方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，初免第 21天進(jìn)行二免，第35天進(jìn)行三免，第50天進(jìn)行融合前加強(qiáng)免疫，3-5天后進(jìn)行融合。 在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下，抗原直接進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞，避免了與體液過(guò)多接觸，減少了氟 喹諾酮抗生素母核抗原表位被螯合遮蔽的概率，有利于動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)基團(tuán)表 位的免疫應(yīng)答。
與傳統(tǒng)弗式佐劑相比，通過(guò)脂質(zhì)體免疫途徑免疫小鼠，獲得的小鼠血清抗氟喹諾酮抗生素母核抗體的效價(jià)提高了io倍，為制備抗氟喹諾酮抗生素母核單克隆抗體創(chuàng)造
了非常有利的條件。
實(shí)施例2。使用脂質(zhì)體免疫途徑制備抗羥氨芐青霉素單克隆抗體。
如附圖3所示，羥氨芐青霉素通過(guò)羧基與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，連接到載體蛋 白上合成人工抗原免疫動(dòng)物，希望能夠得到抗羥氨芐青霉素的抗體。
但是，羥氨芐青霉素結(jié)構(gòu)中的P-內(nèi)酰胺四元環(huán)由于鍵角張力大，容易水解開(kāi)環(huán)。 用傳統(tǒng)的乳化佐劑混合人工抗原，注射到動(dòng)物皮下進(jìn)行免疫，產(chǎn)生免疫應(yīng)答需要的時(shí) 間較長(zhǎng)，在這過(guò)程中羥氨芐青霉素的P-內(nèi)酰胺四元環(huán)可能發(fā)生開(kāi)環(huán)降解，得不到針對(duì) 羥氨芐青霉素的特異性抗體。
利用本發(fā)明技術(shù)，使用逆向蒸發(fā)法，包埋材料大豆卵磷脂和膽固醇以1.8/1的重 量比混勻，以W/V為1/800的比例溶解于二氯甲烷溶劑中，加入到圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器上35-4(TC減壓蒸干，使大豆卵磷脂和膽固醇貼在容器壁上形成雙分子層薄膜。 在圓底燒瓶中加入濃度為2. 0mg/mL、與包埋材料的物料比為2. 5/1的抗原溶液，強(qiáng)烈 晃動(dòng)，包埋材料分散到溶液中并在表面張力作用下收縮成球狀脂質(zhì)體，把偶聯(lián)羥氨節(jié) 青霉素的人工抗原(如圖3)包埋在脂質(zhì)體中，其中緩沖液用pH-7.2的20mM的PBS; 以每只小鼠300^ig的抗原量，釆取靜脈注射的方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，初免第21天進(jìn)行 二免，第35天進(jìn)行三免，第50天進(jìn)行融合前加強(qiáng)免疫，3-5天后進(jìn)行融合。在脂質(zhì) 體的介導(dǎo)下，抗原直接進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞，大大縮短了產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時(shí)間，減少了 羥氨節(jié)青霉素的P-內(nèi)酰胺四元環(huán)發(fā)生開(kāi)環(huán)降解的可能，有利于動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì) 基團(tuán)表位的免疫應(yīng)答。
使用傳統(tǒng)弗式佐劑產(chǎn)生特異性抗羥氨芐青霉素抗體效價(jià)不高，通過(guò)脂質(zhì)體免疫途 徑免疫小鼠，順利獲得了高效價(jià)特異性抗羥氨芐青霉素抗體。
權(quán)利要求
1、使用納米脂質(zhì)體免疫佐劑制備抗小分子物質(zhì)抗體的方法，其特征是(1)將大豆卵磷脂和膽固醇以1.8-2.5/1的重量比混勻，再以W/V為1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶劑中，加入到圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上35-40℃減壓蒸干，使大豆卵磷脂和膽固醇貼在容器壁上形成雙分子層薄膜；(2)在圓底燒瓶中加入濃度為1.5-2.0mg/mL、與包埋材料的物料比為2.0-2.5/1的抗原溶液，強(qiáng)烈晃動(dòng)，其中緩沖液用pH＝6.8-7.2的20mM的PBS；脂質(zhì)體的粒徑控制在50-100nm，包封在脂質(zhì)體的小分子人工免疫抗原的比例為35-50％；(3)以包封在脂質(zhì)體的小分子人工免疫抗原計(jì)算，以每次200-300μg/只小鼠的量進(jìn)行靜脈注射免疫；在初次免疫之后第3-4周，以同樣免疫劑量對(duì)小鼠靜脈注射脂質(zhì)體包封的抗原，進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫；在與第一次加強(qiáng)免疫相隔2-4周的時(shí)間段里，以同樣免疫劑量對(duì)小鼠靜脈注射脂質(zhì)體包封的抗原，進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫；選擇特異性抗體效價(jià)高的小鼠用于細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，篩選所需要的單克隆抗體。
全文摘要
使用納米脂質(zhì)體免疫佐劑制備抗小分子物質(zhì)抗體的方法，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，先將大豆卵磷脂和膽固醇以1.8-2.5/1的重量比混勻，再以W/V為1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶劑中，加入燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上35-40℃減壓蒸干；然后加入濃度為1.5-2.0mg/mL、與包埋材料的物料比為2.0-2.5/1的抗原溶液，強(qiáng)烈晃動(dòng)，其中緩沖液用pH＝6.8-7.2的20mM的PBS；以每次200-300μg/只小鼠的量進(jìn)行靜脈注射免疫；二次加強(qiáng)免疫；選擇特異性抗體效價(jià)高的小鼠用于細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，篩選所需要的單克隆抗體。本發(fā)明①包埋材料物相容性好，在動(dòng)物體內(nèi)易被降解、無(wú)毒性；②脂質(zhì)體進(jìn)入外周血分布到淋巴結(jié)和中樞免疫器官，迅速被免疫細(xì)胞捕獲實(shí)現(xiàn)抗原提呈；③抗原被包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部，增加抗原的穩(wěn)定性，確保免疫效果。
文檔編號(hào)C12P21/08GK101565726SQ20091011545
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者何慶華, 李燕萍, 楊 許, 郭杰標(biāo), 黃志兵 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)