專利名稱：鑒別中國地方豬抗F4ac仔豬腹瀉的分子標(biāo)記及選育應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，尤其是涉及一個(gè)鑒別中 國地方豬種新生和斷奶仔豬F4ac腹瀉易感性/抗性的分子標(biāo)記及其在中國 地方豬種豬遺傳改良選育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的常見傳染病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì) 損失。丹麥養(yǎng)豬業(yè)大規(guī)模的場間調(diào)查表明6%-7%的新生仔豬患有腹瀉病， 使斷奶前仔豬的死亡率達(dá)2.7%,占此期間整個(gè)死亡率的11.9%。即使是病 愈個(gè)體，也會(huì)嚴(yán)重影響生長發(fā)育，有的形成僵豬，導(dǎo)致飼養(yǎng)成本增加，銷 售收入下降。
產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Esc/ m.c/nVat co//, ETEC ) F4是引 發(fā)新生和斷奶前仔豬腹渴病的最主要致病菌，以我國和丹麥為例，分別有 約35%和40%的仔豬腹瀉病是因ETECF4侵染而引起的。在我國，其致死 率在10%-30%之間，在個(gè)別地方甚至比這個(gè)比例更高。
ETEC F4根據(jù)免疫學(xué)特征分為ab， ac和ad三種亞型，其中F4ac是最 主要的致病原，在美國、西班牙和韓國，ETEC仔豬腹瀉病例中只分離到 F4ac亞型。ETEC F4入侵豬腸道后，通過其特異性黏附素附著于小腸上皮 細(xì)胞表面的受體，大量繁殖產(chǎn)生腸毒素，致使腸上皮細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)， 大量水和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔，造成腸腔中大量液體積蓄，超過了腸壁重吸收 能力而引起腹瀉。由此可見，仔豬小腸上皮細(xì)胞有無ETECF4受體，特別 是有無F4ac受體是仔豬被ETEC F4感染時(shí)是否發(fā)病的關(guān)鍵。無受體豬表現(xiàn) 為抵抗型，有受體豬則表現(xiàn)為易感型。分離和鑒別豬ETEC F4ac受體基因 及其抗性位點(diǎn)因而成為豬ETEC F4ac腹瀉抗病育種的關(guān)鍵。
1995年，瑞典LeifAndersson小組利用歐洲野豬x大白豬資源家系群體 為材料，經(jīng)過三代系i普的連鎖分析，首次將ETEC F4ac受體定位于13號(hào)染 色體，與Tf基因緊密連鎖。2002年，瑞士 Peter Vogeli小組以大白豬和大 白x長白三代家系為材料，利用13號(hào)染色體更多的微衛(wèi)星標(biāo)記信息，將F4ac 受體進(jìn)一步定位于S0068和Swl030之間，與其中的S0075和Sw225高度連鎖(0=0.00 )。這一結(jié)果在一年后瑞典Leif Andersson小組和丹麥J0rgensen 小組聯(lián)合開展的基因定位研究中得到了驗(yàn)證，他們還利用FISH和輻射雜種 細(xì)胞克隆板技術(shù)揭示F4ac受體位于13號(hào)染色體q41區(qū)(SSC13q41 )，分別 與人3號(hào)染色體的q28-29和q21區(qū)同源。最近，Joller等通過精細(xì)定位進(jìn)一 步將ETECF4ac受體基因定位于q41區(qū)域SW207與S0283之間。t研究小 組通過利用大規(guī)模白色杜洛克x二花臉資源家系群體在13號(hào)染色體上采用 高密度微衛(wèi)星標(biāo)記將F4ac受體基因精細(xì)定位于S0283鄰近區(qū)域。
此外，Grange等對(duì)F4受體的性質(zhì)做了一系列詳細(xì)的研究，在豬小腸上 皮細(xì)胞分離到兩種粘液型唾液酸津唐蛋白(Intestine mucus glycoprotein, IMTGP),分子量分別為210 kDa (IMTGP畫1)和240 kDa (IMTGP國2 )，這兩 種蛋白被認(rèn)為是豬對(duì)F4ac易感性和抗性重要的決定因子。而研究表明表達(dá) 粘液素蛋白的Aff/O/基因位于豬13號(hào)染色體S0283鄰近區(qū)域，結(jié)合其生理 生化功能分析，認(rèn)為Aft/0/基因極有可能是腸毒素大腸桿菌F4ac受體的一 個(gè)重要候選基因。
鑒于以上背景情況，申請人深入開展了豬Mt/OZ基因及其鄰近區(qū)域多 態(tài)性的搜尋、鑒別及其影響仔豬ETEC F4ac腹瀉病性狀的研究，以期建立 標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開展斷奶仔豬腹瀉病的抗病育種工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)鑒別中國地方豬種斷奶仔豬F4ac腹瀉 易感性/抗性的分子標(biāo)記，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測該多態(tài)位點(diǎn)，利用 標(biāo)記輔助選擇(MAS)選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以顯著提高中國地 方豬種種群斷奶仔豬的抗腹瀉病能力，大大減少仔豬死亡率。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是該分子標(biāo)記在選育改良中國地方豬種種豬抗腹 瀉病性狀中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 (1) Mt/C4基因鄰近區(qū)域大規(guī)模多態(tài)位點(diǎn)(SNP)搜尋 自ENSEMBLE網(wǎng)站(http:〃www.ensembl.org/index.html)上搜尋到孩i 衛(wèi)星標(biāo)記S0283在豬13號(hào)染色體位置為94,369,614 bp - 94,369,755 bp。以 S0283為中心，前后延伸5 Mb，即以chromosome 13: 89,369,614 bp -99,369,755 bp為查詢號(hào)，提交到ENSEMBLE網(wǎng)站上，下載得到豬13號(hào)染 色體S0283附近10 Mb的DNA序列。同時(shí)自NCBI網(wǎng)站(National Center for Biotechnology Information, http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ )下載S'J 29369 bp的豬Mt/C4基因的部分DNA序列(序列號(hào)DQ848681 )。用該29369 bp序 列錨定下載的SSC13序列，前后再分別延伸約50 kb，則得到一段130 kb 的DNA序列，嚢括了豬MUO/基因的全部DNA序列。
選取白色杜洛克和二花臉8個(gè)ETEC F4ac祐附表型極端的個(gè)體，其中 4個(gè)為強(qiáng)黏附型，4個(gè)為不黏附型。在已獲得的130kb的DNA片段中共設(shè) 計(jì)34對(duì)引物，其中MUC4基因外的側(cè)翼序列每5kb設(shè)計(jì)一對(duì)引物， 基因內(nèi)每2kb設(shè)計(jì)一對(duì)引物，均對(duì)以上8個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用比較 測序法鑒別多態(tài)性位點(diǎn)，以大規(guī)才莫搜尋單核苷酸多態(tài)標(biāo)記(SNPs )。
在130kb范圍內(nèi)共鑒別到了 104個(gè)SNPs。選擇其中分布均勻和具有代 表性的70個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，在12個(gè)中國地方豬種的148頭遠(yuǎn)》彖群體中進(jìn)行基 因分型，有64個(gè)SNP位點(diǎn)成功分型。隨后利用分型成功的基因型數(shù)據(jù)開展 大規(guī)模SNP位點(diǎn)多態(tài)性與ETEC F4ac黏附表型之間的單點(diǎn)和多點(diǎn)關(guān)聯(lián)性分 析。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，M70/基因鄰近區(qū)域的SNPA183G位點(diǎn)多態(tài)性 與中國地方豬ETEC F4ac黏附表型關(guān)聯(lián)性最顯著(i^2.68E-12 )。
(2) SNPA183G的具體鑒別過程
利用上述來自ENSEMBLE網(wǎng)站(http:〃www.ensembl.org/index.html) 的嚢括了豬Mf/C4基因的一段130 kb的DNA序列，使用公用的Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物F1和R1 (Fl: 5'-G CTT AGA CAG TGA GAC ATC AAC ATC-3，和Rl: 5，- AAT TAC AGG TGA CAC GCT TCC -3，)擴(kuò)增豬基因組 DNA (脫氧核糖核酸)。25 pl的聚合ilM式反應(yīng)(PCR)反應(yīng)體系中，包括 25ng豬基因組DNA, 1.0mMMgCl2, 100 mM dNTP (合成DNA的四種脫 氧核苷酸底物)，正反向引物各10 pmol， 2單位DNA聚合酶(Taq酶)及 1 xPCR buffer(緩沖液)(上海生物工程公司，中國)。擴(kuò)增條件為94 。C 4 min; 94 。C 30 s， 58 。C 30 s, 72 。C 60 s,共34個(gè)循環(huán)；最后在72 。C延伸10 min。 擴(kuò)增片段采用QIAquickPCR產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN，德國)純化，由 華大基因上海測序中心測序。采用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information, http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov) 網(wǎng)站公用的BLAST軟件，將測序后獲得的DNA序列與上述130 kb的DNA 序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示該序列與已公布序列同源性在99%以上， 由此說明此段序列為目的序列。然后選取8個(gè)ETEC F4ac黏附表型極端個(gè) 體，其中4個(gè)為強(qiáng)l占附型，4個(gè)為不黏附型。采用上述引物F1和R1對(duì)以 上8個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用比較測序法測序，使用公用的DNAStar軟
5件包中的SeqMan軟件分析測序結(jié)果時(shí)，發(fā)現(xiàn)在該序列的第183個(gè)核苷酸處 存在一個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNPs),即SNPA183G位點(diǎn)。
(2)位于豬13號(hào)染色體Mt/OZ基因鄰近區(qū)域、包含183bp處突變位 點(diǎn)(SNPA183G)的部分基因序列如下
tccttgggcttssc3ctgctgtaactttsasggggscttt60
ttttt3ttC3gasttatgsatsgstttgtttctsggsctctssgtcctstscctgctccc120
tcctcagtaaagttcataaacttcgtttctctagctaaggtttagattgg180
ccrtgs33ttattattsagctt3tttcctcttcctasgaasgcsacgctc240
tgtcttctggctttgsgtc3ccagatagaagct3gttsc3tgCC333Ctt300
ttsttatsgsttcttggcsstt33t3t3Cttttggsgcctgcstcacctctgtt3333tC360
33t3tt3gC3gc3333gtttcstgsttgc3csgtcc33gttttttaasgt33sgstttgt420
stttgtttgttC3t3333gtagtacagctct3ctcccsgcaatatggcag480
CCttt33Ct3gsgsscstgctaatgtgtaat333t3ttttctgsaitgctg540
3gctgagatc33gggagacgctcsggsgtgasggsgttgs600
tgctctcstscsstttggsgatttctgagatctsgsgtttggcatttt3a660
tggctgc3tg3C33tCtt3gtgtagsctgsatattttctg720
cataaagctggaaacctcsgtgaaaaggtggtctsg3333780
3gg3gg3gttccctggtggctcagtgggtt33ggstcc3gcgttttcsctgctggggctc840
tggttactgc tgag
(3) SNPA183G的基因分型
使用SNaPshot試劑盒(ABI公司，美國)開展基因分型。方法如下
1) 引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)引物對(duì)F2和R2 (F2: 5，- ACG TTG GAT GCT TAG GAA GAG GAA ATA AGC -3'和R2:5，國ACG TTG GAT GCT TCG TTT CTC TAG CTA AGG _3，)擴(kuò)增包含要檢測SNP A183G位點(diǎn)的DNA片^爻以及一條 SNaPshot延伸引物(5，-A AAA AAA AAA AAA GGA AAT AAG CTT AAT AATAATTTC -3,)。
2) PCR擴(kuò)增條件及產(chǎn)物純化
使用上述引物對(duì)F2和R2擴(kuò)增豬基因組DNA。 25 pi的PCR反應(yīng)體系 中，包括25ng豬基因組DNA， 1.0mMMgCl2， 100 mM dNTP，正反向引 物各10pmo1， 2單位Taq酶及l(fā)xPCR buffer (上海生物工程公司，中國)。 擴(kuò)增條件為94。C4min; 94 °C 30 s， 56 。C 30 s, 72 。C 30 s,共35個(gè)循環(huán)；最后在72 。C延伸10 min。 PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。 取3pl PCR產(chǎn)物，加入lpl ExoSAP-IT酶(上海國藥集團(tuán)公司，中國)37。C 醉育15min,然后80。C處理15min滅活酶。PCR產(chǎn)物純化后稀釋4倍備用。
3 ) SNaPshot反應(yīng)及產(chǎn)物純化
SNaPshot反應(yīng)體系為SNaPshot反應(yīng)混合物(Multiplex Ready Reaction Mix) 2^1; SNaPshot延伸引物0.5|xl (引物終濃度為0.2nmol/L );上述純 化稀釋PCR產(chǎn)物1.5nl;去離子水1^1。SNaPshot循環(huán)參數(shù)為96°C 10s,50°C 5 s， 60°C 30 s，共25循環(huán)。取5pil SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物加入0.57^1 lOxbuffer 和O.lnlCIP (SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物純化酶)在37。C下孵育lh,然后75。C處 理15min滅活酶達(dá)到產(chǎn)物純化效果，-20°(:保存?zhèn)溆谩?br> 4 ) 3130XL遺傳分4/H義電泳
電泳混合體系包括9.25nlHi-Diformamide (曱酰胺變性劑)；0.5|il上 述經(jīng)純化后的SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物；0.25jil GeneScan 120 LIZ size standard (電泳分子內(nèi)標(biāo))。體系混合后于95。C變性5min然后立即置于冰上處理 2min。離心上樣。
具體判型方法如附圖2所示。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用這個(gè)多態(tài)位點(diǎn)及側(cè)翼 DNA序列信息，采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒別個(gè)體基因型，針對(duì)抗腹瀉病性狀 選育中國地方豬種種豬。
本發(fā)明鑒別了一個(gè)影響中國地方豬種斷奶仔豬抗腹瀉病性狀的單核苷 酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測該多態(tài)位點(diǎn)，利用標(biāo) 記輔助選擇(MAS)選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以顯著提高中國地方 豬種種群斷奶仔豬的抗腹瀉病能力，大大減少仔豬死亡率。


圖1為本發(fā)明鑒別的豬SNPA183G突變位點(diǎn)的序列峰圖2為SNPA183G位點(diǎn)的SNaPshot判型圖，其中a為GG型；b為爿G 型；c為^4型；
圖3為ETECF4ac與刷狀緣的黏附檢測結(jié)果，(a)為不l占附型，(b)為黏 附型。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 選擇中國地方豬種種豬核心群個(gè)體，利用上述的SNaPshot方法鑒別豬 13號(hào)染色體Mf/OZ基因鄰近區(qū)域SNP A183G位點(diǎn)的基因型，選擇有利的 基因型個(gè)體(^4型)留種，群體繼代選育后改良中國地方豬種種群的抗仔 豬腹瀉病性能。實(shí)施例
利用148頭代表我國6個(gè)生態(tài)類型(包括華北、華南、華中、江海、西 南、高原型等)的12個(gè)地方豬種純種仔豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每個(gè)豬種選取至 少3個(gè)父系家系，每個(gè)家系選擇3-4個(gè)l-2月齡個(gè)體；148頭純種仔豬屠宰 后，取小腸空腸部分，提取小腸上皮細(xì)胞刷狀緣，利用￡.co// F4ac菌林#占 附豬小腸上皮細(xì)胞刷狀緣，通過相差顯微鏡檢測細(xì)菌的黏附結(jié)果。每個(gè)樣 品檢測20個(gè)以上的刷狀緣,若有10。/o以上的刷狀緣上至少有2個(gè)細(xì)菌勦附， 判該樣品為勦附型，若至少有2個(gè)細(xì)菌黏附的刷狀緣不到10%， <旦有1-2 個(gè)細(xì)菌黏附的刷狀緣多于10%,判該樣品為弱黏附型，否則判為不翻附型。 黏附效果圖如附圖3所示 ' ， ，
采用SHE在線7>用軟件分析這個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性與實(shí)-驗(yàn)豬只ETEC F4ac 勦附表型性狀之間的關(guān)聯(lián)性(見表1 )。結(jié)果表明SNP A183G多態(tài)性與ETEC F4ac的侵染易感性呈極顯著相關(guān)(P=2.68E-12; LogP=11.57), G等位基因 為易感基因，J等位基因?yàn)榭剐曰?；基因型GG和」G個(gè)體對(duì)ETEC F4ac 的侵染易感，^4型個(gè)體對(duì)ETECF4ac的侵染具有抵抗性(表2)。 A4型個(gè) 體是抗腹瀉病型豬的選育改良所需的基因型個(gè)體。在商業(yè)種豬核心群中， 繼代選育型個(gè)體，可以進(jìn)一步改良中國地方豬種種群的抗腹瀉病性狀， 減少仔豬的死亡率。
表1 SNPA183G多態(tài)性與ETEC F4ac黏附表型的關(guān)聯(lián)分析
SNP位點(diǎn)P值LogP值
SNPA183G2.68E-1211.57
表2 SNPA183G位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)豬群體中的基因型和ETEC F4ac翁附表型分布
— _____ 黏附表型
標(biāo)記位點(diǎn)
基因型 一
黏附(+)不點(diǎn)附(一)
AA26100
AG171
GG40
SNPA183G
權(quán)利要求
1、一種鑒別中國地方豬抗F4ac仔豬腹瀉的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記的DNA序列如下所示tgttagaaag tccttgggct ttaacccaaa taacactgct gtaactttaa aggggacttt60tttttattca gaattatgaa tagatttgtt tctaggactc taagtcctat acctgctccc 120tcctcagtaa agttcataaa cttcgtttct ctagctaagg tttagattgg aagacataca 180ccrtgaaatt attattaagc ttatttcctc ttcctaagaa cataaataaa agcaacgctc 240tgtcttctgg ctttgagtca ccagatagaa gctagttaca tgccaaactt actaataaac 300ttattataga ttcttggcaa ttaatatact tttggagcct gcatcacctc tgttaaaatc 360aatattagca gcaaaagttt catgattgca cagtccaagt tttttaaagt aaagatttgt 420atttgtttgt tcataaaagt agtacagctc tactcccagc aatatggcag aagagacaaa 480cctttaacta gagaacatgc aaatgccaga taatgtgtaa taaatatttt ctgaatgctg 540agctgagatc cgaagaaaga aagggagacg ctcaggagtg aaggagttga aaactaagat 600gataagtaag tgctctcata caatttggag atttctgaga tctagagttt ggcattttaa 660tggctgcatg gagaaaggaa acaatcttag atcaggacac tgtagactga atattttctg 720cataaagctg gaaacctcag tgaaaaggtg gtctagaaaa atcaaaaaga aaaaagaaaa 780aggaggagtt ccctggtggc tcagtgggtt aaggatccag cgttttcact gctggggctc 840tggttactgc tgag
2、 4財(cái)居權(quán)矛J^求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于所述DNA序列第183個(gè)核 苷^t^在一個(gè)A183-G183的4tt突變。
3、 才財(cái)居權(quán)矛J^求2所述的分子標(biāo)記，其特征在于檢頂'j4tt突變的正、反向引 物以及一條SNaPshot延伸引物的核苦^列如下所示正向5，- ACG TTG GAT GCT TAG GAA GAG GAA ATA AGC誦3' 反向5 ，- ACG TTG GAT GCT TCG TTT CTC TAG CTA AGG畫3' SNaPshot延伸引物5 ， -A AAA AAA AAA AA AGG AAA TAA GCT TAA TAATAATTTC -3,。
4 、鑒別中國地方豬抗F4ac仔豬腹竭的分子標(biāo)記在選育改良中國地方豬種種 豬抗腹瀉病性狀中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別中國地方豬種新生和斷奶仔豬F4ac腹瀉易感性/抗性的分子標(biāo)記及其在中國地方豬種種豬遺傳改良中的應(yīng)用，它通過克隆得到如序列表中所示的DNA片段，并在該序列的第183bp處鑒別到一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)A183G，再采用SNaPshot方法對(duì)SNPA183G進(jìn)行基因分型。本發(fā)明還公開了獲得上述分子標(biāo)記及相關(guān)引物的制備方法以及利用本發(fā)明克隆的分子標(biāo)記進(jìn)行中國地方豬腹瀉性狀關(guān)聯(lián)分析的方法。本發(fā)明通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測該多態(tài)位點(diǎn)，利用標(biāo)記輔助選擇(MAS)選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以顯著提高中國地方豬種種群斷奶仔豬的抗腹瀉病能力，大大減少仔豬死亡率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101603089SQ20091011571
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日
發(fā)明者軍 任, 晏學(xué)明, 艾華水, 黃路生 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)