專利名稱：米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度l-乳酸新工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物與發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說涉及米根霉半連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸工藝。
背景技術(shù)：
乳酸是一種常見的結(jié)構(gòu)簡單的羥基羧酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物體內(nèi)。 乳酸按構(gòu)象分為D型和L型，人體只能代謝L-乳酸，因此世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī) 藥行業(yè)使用L-乳酸取代目前廣泛使用的DL-乳酸。L-乳酸、L-乳酸鹽及其衍生物廣泛應(yīng)用 于食品、醫(yī)藥、飼料、化工等領(lǐng)域。尤其是近年來，人們利用乳酸聚合生產(chǎn)出的可生物 降解塑料、綠色包裝材料及農(nóng)用薄膜，可以有效的解決日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。隨著聚 乳酸的發(fā)展和應(yīng)用，生產(chǎn)聚乳酸的原料一L-乳酸的需求量越來越大；由于乳酸相對于其他 酸有無可比擬的安全性，已經(jīng)在多方面替代了檸檬酸等在啤酒等生產(chǎn)中的應(yīng)用，隨著乳酸 應(yīng)用范圍的不斷拓寬及其需求量的不斷增大，乳酸的生產(chǎn)研究就顯得越來越重要。
乳酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。其中無毒無害的發(fā)酵生產(chǎn)法被廣 泛推廣。根據(jù)發(fā)酵菌種的不同又分為細菌發(fā)酵和霉菌(主要為根霉)發(fā)酵，由于根霉發(fā)酵 生產(chǎn)乳酸具有光學(xué)純度高，菌體易與發(fā)酵液分離等特點，因此利用米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸 成為該領(lǐng)域大規(guī)模生產(chǎn)L-乳酸的趨勢。但是目前L-乳酸的生產(chǎn)普遍采用分批發(fā)酵工藝，一 方面米根霉菌體處于游離或者固定化狀態(tài)，發(fā)酵結(jié)束時大量健壯的菌體得不到有效的重復(fù) 利用，菌體利用時間低， 一般僅利用60 72小時；另一方面發(fā)酵罐中菌體濃度不高， 一般 為5g/L 7g/L;由此使得分批發(fā)酵時間延長，發(fā)酵強度很低，在2.5g/(h七)以下；同時由 于米根霉的菌絲發(fā)達，在罐內(nèi)易纏繞在攪拌軸上，使攪拌阻力增大，甚至形成結(jié)團，包埋 碳酸鈣和碳源，使得原料轉(zhuǎn)化率不能提高， 一般在75%左右。因此對米根霉進行半連續(xù)高 密度發(fā)酵具有重要理論和現(xiàn)實意義。
目前，國內(nèi)外對米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究開展廣泛。YuRC等對米根霉直接轉(zhuǎn)化 農(nóng)產(chǎn)品原料生產(chǎn)L(+)-乳酸進行了研究，以碳酸鈣為中和劑，每千克粗淀粉原料(玉米)可生 成350g以上的L(+)-乳酸。蔣明珠采用自行選育的米根霉R-47菌株，35'C搖瓶培養(yǎng)48h， 初始葡萄糖質(zhì)量分數(shù)15。/。時產(chǎn)乳酸118.4g/L,糖轉(zhuǎn)化率達78.9%。 Yu等研究了用米根霉直 接發(fā)酵農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)L(+)-乳酸的動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)玉米和大米的產(chǎn)酸性能高于大麥、燕麥和木薯等，探討了適宜的底物濃度、發(fā)酵溫度、碳酸鈣加入量對乳酸生產(chǎn)過程的影響。姜紹通、 鄭志等在對米根酶菌株誘變的基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵控制參數(shù)，深入分析和討論了代謝途徑。 潘利軍等研究了米根霉發(fā)酵代謝關(guān)鍵酶——乳酸脫氫酶的催化特性，通過金屬離子調(diào)控其 活性，取得了很好的實際效果。李興江等研究了米根霉As3.819發(fā)酵甘薯淀粉生產(chǎn)L-乳酸 的最適條件。羅水忠、肖小發(fā)等利用同步輻射軟X射線對米根霉As3.819進行誘變，并研 究了誘變菌株的發(fā)酵特性。
建立在無載體固定化技術(shù)基礎(chǔ)上的半連續(xù)發(fā)酵，是在每批罐發(fā)酵終點時，分離取出發(fā) 酵液，保留成熟、代謝旺盛的無載體固定化菌體細胞，添加新鮮的培養(yǎng)基，使菌體連續(xù)發(fā) 酵。D. Hekmat等指出細胞循環(huán)使用的主要優(yōu)點是在生物反應(yīng)器的時間和空間上增加活性 生物量，實現(xiàn)更高效率的轉(zhuǎn)化率。Ja'nMarta'k等利用少根根霉在機械攪拌式發(fā)酵罐中實現(xiàn) 了半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L一乳酸，使發(fā)酵時間延長至240h，平均乳酸生產(chǎn)率為2.31kg/(m3h)， 總收率為67.3% ,平均pH值為5.30。
高密度培養(yǎng)技術(shù)(High-cell-density cultivation, HCDC)，也就是高密度發(fā)酵技術(shù)，提高 菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)。D. Riesenberg等提出高密度發(fā)酵不僅可以減少培養(yǎng)體積、強化下游分離提取，還可以縮短生 產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高產(chǎn)品在市場上的競爭力。ChoiJH 等用重組大腸桿菌HBIOI和KS272生產(chǎn)堿性磷酸酶時，采取了 pH-stat的補料策略，設(shè)定 pH為6.8，當(dāng)由于葡萄糖的消耗導(dǎo)致pH升高一定值時，就會自動流加補料液以增加培養(yǎng) 液中的葡萄糖濃度，實驗中兩種菌株所達到的最大細胞量分別約為55gDCW/L和 45gDCW/L。
在米根霉的半連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸工藝中，菌體密度是影響發(fā)酵效率的關(guān)鍵因素，通過 控制菌體密度和菌體形態(tài)達到高強度發(fā)酵，有利于提高乳酸的產(chǎn)量，為緩和當(dāng)前嚴(yán)峻的享L 酸需求有非常重要的意義。產(chǎn)物和菌體的分離常常是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵和難點，米根霉深層 發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，菌體形態(tài)復(fù)雜，多以絲狀、片狀、球體、團狀、絮狀、結(jié)塊等形 態(tài)生長，通過控制菌體組成，使菌體大部分由菌絲球組成，調(diào)控粒徑大小，減輕菌液分離 負擔(dān)，有利于成功實現(xiàn)半連續(xù)高密度發(fā)酵。因此米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵對L-乳酸產(chǎn)業(yè)意 義重大。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決提高乳酸的產(chǎn)量中產(chǎn)物和菌體的分離的關(guān)鍵和難點問題，本發(fā)明提供一種運 行成本低、發(fā)酵強度高、適于工業(yè)化生產(chǎn)的米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸新工藝。
具體的工藝步驟如下
米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸新工藝方法包括下列操作步驟
A、 制備米根霉孢子懸液
用接種環(huán)挑取保藏的米根霉3.819菌絲一環(huán)，接種至裝在100ml三角瓶里由50mlPDA 培養(yǎng)基制成的固體斜面上，在320C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌 絲一瓶，加入40ml無菌蒸餾水，用玻璃棒打成熟米根霉孢子，得到成熟米根霉孢子濃度 在5X10"M0"個/L的孢子懸液；
上述PDA培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂 20g/L;
B、 制備高密度種子培養(yǎng)液
將孢子懸液40ml接種至裝有4L種子培養(yǎng)基的7L磁力攪拌發(fā)酵罐，控制通氣流量1.75 L/ (L'min)，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，溫度32°C培養(yǎng)24h，得到4L種子培養(yǎng)液；
上述種子培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨4g/L、磷酸二 氫鉀0.45 g/L、硫酸鋅0. 44 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、碳酸鈣20g/L;
C、 高密度菌體的擴增
將4L種子培養(yǎng)液，在無菌操作的條件下轉(zhuǎn)接至裝有35L菌體擴增培養(yǎng)基的50L磁力 攪拌發(fā)酵罐，控制通氣流量1.0 L/ (L'min)，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min,溫度32°C，發(fā)酵培養(yǎng)36h， 得到35L高密度菌體培養(yǎng)液；
上述菌體擴增培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨2g/L、磷 酸二氫鉀(Ug/L、磷酸二氫鈉0.2g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂0.25 g/L、碳酸鈣40g/L;
D、 500L發(fā)酵罐首批發(fā)酵
將35L高密度菌體培養(yǎng)液，在無菌操作的條件下轉(zhuǎn)接至裝有375L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 L 機械攪拌罐，控制通氣流量至2.0L/ (Iymin)，攪拌速度300 r/min，溫度32°C，發(fā)酵培養(yǎng) 36h，實現(xiàn)菌體細胞的更新與擴增，得到的發(fā)酵液中菌體干重達到10g/L;再控制通氣2.517 (L-min)繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵，溫度32°C,發(fā)酵培養(yǎng)60h，得到首批發(fā)酵液，首批發(fā)酵液L-乳 酸濃度為102g/L,葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%,發(fā)酵液中菌體干重為15g/L;
首批發(fā)酵結(jié)束進行取料，取料步驟為將首批發(fā)酵液靜置20min，保持發(fā)酵罐壓力O.l 個大氣壓，發(fā)酵液中的菌體由于自重沉降至發(fā)酵罐底部，通過發(fā)酵罐內(nèi)的壓力壓出發(fā)酵上 清液360L，菌體保留在發(fā)酵罐底部；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲
6球，直徑在0.5mm 4.0mm;
上述發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二 氫鉀0.2 g/L、磷酸二氫鈉0.2 g/L、硫酸鋅0. 22 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、碳酸鈣60g/L;
E、 500L罐半連續(xù)高密度發(fā)酵-前5次增殖菌體重復(fù)發(fā)酵
補料將360L補料培養(yǎng)基，在無菌操作的條件下補入步驟D取料結(jié)束后含有菌體的 發(fā)酵罐中；
重復(fù)發(fā)酵補料步驟之后的發(fā)酵罐，控制通氣3.0L/(Lmin)，控制攪拌速度350r/min， 溫度32T，發(fā)酵24h，得到發(fā)酵液及菌體；
重復(fù)取料重復(fù)上述步驟D中的取料步驟將重復(fù)發(fā)酵24h得到的發(fā)酵液及菌體靜置 20min，保持發(fā)酵罐壓力0.1個大氣壓，發(fā)酵液中的菌體由于自重沉降至發(fā)酵罐底部，通過 發(fā)酵罐內(nèi)的壓力壓出發(fā)酵上清液360L，菌體保留在發(fā)酵罐底部；得到保留在發(fā)酵罐底部的 菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑在0.5mm 4.0mm;
如此反復(fù)補料、重復(fù)發(fā)酵、重復(fù)取料共五次，每次得到發(fā)酵液，該發(fā)酵液L-乳酸濃度 為85g/L 卯g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%以上，得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部 分為菌絲球，直徑在0.5mm 4.0mm,其中第一次重復(fù)發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中L-乳酸濃度為 90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%，菌體干重為17g/L,第5次重復(fù)發(fā)酵得到的發(fā)酵液中菌體干 重為25g/L;
上述補料培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖100g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二 氫鉀0.1g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂(X25g/L、碳酸鈣50g/L; F、 500L罐進行半連續(xù)后20次高密度高強度重復(fù)發(fā)酵
重復(fù)上述步驟E，培養(yǎng)基為高強度發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中的通氣量為2.5L/(L，min)， 攪拌速度改為250r/min，溫度32。C，每次重復(fù)發(fā)酵時間為18h，每次重復(fù)發(fā)酵結(jié)束時得到 發(fā)酵液及菌體，該發(fā)酵液L-乳酸濃度為85g/L~90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%以上，發(fā)酵強 度穩(wěn)定在4.7-5.0 g/(h丄)；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑 在0.5mm 4.0mm,其中第25次取料前發(fā)酵液中菌體干重為35g/L;
上述高強度發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖100g/L、硫酸銨lg/L、 磷酸二氫鉀0.05 g/L、硫酸鋅0.11 g/L、硫酸鎂0.15g/L、碳酸鈣50g/L。
本發(fā)明的米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵與傳統(tǒng)固定化及游離發(fā)酵相比，具有菌體濃度高、 發(fā)酵強度高、菌體可反復(fù)使用等優(yōu)點，并可得到高的目標(biāo)產(chǎn)量和原料轉(zhuǎn)化率，易于實現(xiàn)細 胞與產(chǎn)物分離，有利于實現(xiàn)工藝過程的自動化、連續(xù)化，降低生產(chǎn)成本，具體表現(xiàn)在(1)
7生物反應(yīng)器內(nèi)菌體密度高，最高可達35g/L，單批次發(fā)酵周期縮短為18~24h，發(fā)酵強度可 以達到5.0g/ (h丄)，有效地提高了生物反應(yīng)器的使用效率；(2)菌體利用時間可以延長， 并在保持高強度發(fā)酵的同時菌體不斷增殖更新，避免了由于菌體的更新推遲發(fā)酵周期，大 大縮短了由于菌體增殖使用的時間，在新老菌體交替中使得菌體使用時間延長至120h甚 至更長時間；(3)較之游離發(fā)酵操作，發(fā)酵液中菌體殘留量減少80%，減輕后續(xù)分離工作， 且菌體從發(fā)酵液中分離十分容易；(4)菌絲球呈單個分離狀態(tài)，避免在生物反應(yīng)器內(nèi)部的 纏繞及包埋碳源等營養(yǎng)物質(zhì)，有利于菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，提高原料利用率，葡萄 糖轉(zhuǎn)化率達到85%左右，穩(wěn)定保持在80%以上；(5)半連續(xù)發(fā)酵操作簡單，易于實現(xiàn)自動 化生產(chǎn)。


圖1為米根霉半連續(xù)發(fā)酵從第1次到第25次重復(fù)發(fā)酵的葡萄糖轉(zhuǎn)化率情況，從圖中 可以看出在最后幾個批次發(fā)酵過程中，葡萄糖轉(zhuǎn)化率仍然很高，達到85%。
圖2為米根霉半連續(xù)發(fā)酵前5次重復(fù)發(fā)酵得到菌體的形態(tài)，通過圖中可以看出菌體大 部分為菌絲球，含有少量的菌絲體、及菌絲碎片。
圖3為米根霉半連續(xù)發(fā)酵第18次重復(fù)發(fā)酵得到菌體的形態(tài)，通過圖中可以看出菌體 中含有部分菌絲球、部分菌絲碎片和少量新生菌絲。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖，通過實施例對本發(fā)明作進一步地描述。 實施例
米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸新工藝方法包括下列操作步驟-
(1) 制備米根霉孢子懸液
用接種環(huán)挑取保藏的米根霉3.819菌絲一環(huán)，接種至裝在100ml三角瓶里由50mlPDA 培養(yǎng)基制成的固體斜面上，在32。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌 絲一瓶，加入40ml無菌蒸餾水，用玻璃棒打成熟米根霉孢子，得到成熟米根霉孢子濃度 在5 X 101^1011個/L的孢子懸液。
上述PDA培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂 20g/L。
(2) 制備高密度種子培養(yǎng)液
將孢子懸液40ml接種至裝有4L種子培養(yǎng)基的7 L磁力攪拌發(fā)酵罐，控制通氣流量1.75 L/ (L'min)，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，溫度32°C培養(yǎng)24h，得到4L種子培養(yǎng)液。上述種子培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨4g/L、磷酸二 氫鉀0.45 g/L、硫酸鋅0. 44 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、碳酸鈣20g/L。
(3) 高密度菌體的擴增
將4L種子培養(yǎng)液，在無菌操作的條件下轉(zhuǎn)接至裝有35L菌體擴增培養(yǎng)基的50L磁力 攪拌發(fā)酵罐，控制通氣流量1.0 L/ (L'min)，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，溫度32°C，發(fā)酵培養(yǎng)36h， 得到35L高密度菌體培養(yǎng)液。
上述菌體擴增培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨2g/L、磷 酸二氫鉀0.2g/L、磷酸二氫鈉0.2g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂0.25 g/L、碳酸鈣40g/L。
(4) 500L發(fā)酵罐首批發(fā)酵
將35L高密度菌體培養(yǎng)液，在無菌操作的條件下轉(zhuǎn)接至裝有375L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 L 機械攪拌罐，控制通氣流量至2.0L/ (LTnin)，攪拌速度300 r/min，溫度32°C，發(fā)酵培養(yǎng) 36h，實現(xiàn)菌體細胞的更新與擴增，得到的發(fā)酵液中菌體干重達到10g/L;再控制通氣2.5L/ (L-min)繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵，溫度32°C，發(fā)酵培養(yǎng)60h，得到首批發(fā)酵液，首批發(fā)酵液L-乳 酸濃度為102g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%，發(fā)酵液中菌體干重為15g/L。
首批發(fā)酵結(jié)束進行取料，取料步驟為將首批發(fā)酵液靜置20min，保持發(fā)酵罐壓力O.l 個大氣壓，發(fā)酵液中的菌體由于自重沉降至發(fā)酵罐底部，通過發(fā)酵罐內(nèi)的壓力壓出發(fā)酵上 清液360L，菌體保留在發(fā)酵罐底部；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲 球，直徑在0.5mm 4.0mm。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二 氫鉀0.2g/L、磷酸二氫鈉0.2g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂0.25g/L、碳酸鈣60g/L。
(5) 500L罐半連續(xù)高密度發(fā)酵-前5次增殖菌體重復(fù)發(fā)酵
補料將360L補料培養(yǎng)基，在無菌操作的條件下補入步驟D取料結(jié)束后含有菌體的 發(fā)酵罐中。
重復(fù)發(fā)酵補料步驟之后的發(fā)酵罐，控制通氣3.0L/(L'min)，控制攪拌速度350 r/min， 溫度32。C，發(fā)酵24h，得到發(fā)酵液及菌體，該發(fā)酵液L-乳酸濃度為90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率 為85%，發(fā)酵液中菌體干重為17g/L。
重復(fù)取料:重復(fù)上述步驟D中的取料步驟:將發(fā)酵24h得到的發(fā)酵液及菌體靜置20min， 保持發(fā)酵罐壓力0.1個大氣壓，發(fā)酵液中的菌體由于自重沉降至發(fā)酵罐底部，通過發(fā)酵罐 內(nèi)的壓力壓出發(fā)酵上清液325L，菌體保留在發(fā)酵罐底部；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體， 該菌體大部分為菌絲球，直徑在0.5mm 4.0mm。如此反復(fù)補料、重復(fù)發(fā)酵、重復(fù)取料共五次，每次得到發(fā)酵液，該發(fā)酵液L-乳酸濃度 為85g/L~90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%以上，得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部 分為菌絲球，直徑在0.5mm 4.0mm，其中第5次取料前發(fā)酵液中菌體干重為25g/L。
上述補料培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖100g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二氫 鉀0.1 g/L、硫酸鋅0. 22 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、碳酸鈣50g/L。
(6) 500L罐進行半連續(xù)后20次高密度高強度重復(fù)發(fā)酵
重復(fù)上述步驟E，培養(yǎng)基為高強度發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中的通氣量為2.5L/(LTiiin), 攪拌速度改為250r/min，溫度32°C，每次重復(fù)發(fā)酵時間為18h，每次重復(fù)發(fā)酵結(jié)束時得到 發(fā)酵液及菌體，該發(fā)酵液L-乳酸濃度為85g/L~90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85%以上，發(fā)酵強 度穩(wěn)定在4.7 5.0g/ (h丄)；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑 在0.5mm 4.0mm，其中第25次取料前發(fā)酵液中菌體干重為35g/L。
上述高強度發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖100g/L、硫酸銨lg/L、 磷酸二氫鉀0.05 g/L、硫酸鋅0. 11 g/L、硫酸鎂0.15 g/L、碳酸鈣50g/L。
權(quán)利要求
1、米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸新工藝方法，其特征在于包括下列操作步驟A、制備米根霉孢子懸液用接種環(huán)挑取保藏的米根霉3.819菌絲一環(huán)，接種至裝在100ml三角瓶里由50mlPDA培養(yǎng)基制成的固體斜面上，在32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌絲一瓶，加入40ml無菌蒸餾水，用玻璃棒打成熟米根霉孢子，得到成熟米根霉孢子濃度在5×1010～1011個/L的孢子懸液；上述PDA培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L；B、制備高密度種子培養(yǎng)液將孢子懸液40ml接種至裝有4L種子培養(yǎng)基的7L磁力攪拌發(fā)酵罐，控制通氣流量1.75L/(L·min)，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，溫度32℃培養(yǎng)24h，得到4L種子培養(yǎng)液；上述種子培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨4g/L、磷酸二氫鉀0.45g/L、硫酸鋅0.44g/L、硫酸鎂0.25g/L、碳酸鈣20g/L；C、高密度菌體的擴增將4L種子培養(yǎng)液，在無菌操作的條件下轉(zhuǎn)接至裝有35L菌體擴增培養(yǎng)基的50L磁力攪拌發(fā)酵罐，控制通氣流量1.0L/(L·min)，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，溫度32℃，發(fā)酵培養(yǎng)36h，得到35L高密度菌體培養(yǎng)液；上述菌體擴增培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、磷酸二氫鈉0.2g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂0.25g/L、碳酸鈣40g/L；D、500L發(fā)酵罐首批發(fā)酵將35L高密度菌體培養(yǎng)液，在無菌操作的條件下轉(zhuǎn)接至裝有375L發(fā)酵培養(yǎng)基的500L機械攪拌罐，控制通氣流量至2.0L/(L·min)，攪拌速度300r/min，溫度32℃，發(fā)酵培養(yǎng)36h，實現(xiàn)菌體細胞的更新與擴增，得到的發(fā)酵液中菌體干重達到10g/L；再控制通氣2.5L/(L·min)繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵，溫度32℃，發(fā)酵培養(yǎng)60h，得到首批發(fā)酵液，首批發(fā)酵液L-乳酸濃度為102g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85％，發(fā)酵液中菌體干重為15g/L；首批發(fā)酵結(jié)束進行取料，取料步驟為將首批發(fā)酵液靜置20min，保持發(fā)酵罐壓力0.1個大氣壓，發(fā)酵液中的菌體由于自重沉降至發(fā)酵罐底部，通過發(fā)酵罐內(nèi)的壓力壓出發(fā)酵上清液360L，菌體保留在發(fā)酵罐底部；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑在0.5mm～4.0mm；上述發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖120g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、磷酸二氫鈉0.2g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂0.25g/L、碳酸鈣60g/L；E、500L罐半連續(xù)高密度發(fā)酵-前5次增殖菌體重復(fù)發(fā)酵補料將360L補料培養(yǎng)基，在無菌操作的條件下補入步驟D取料結(jié)束后含有菌體的發(fā)酵罐中；重復(fù)發(fā)酵補料步驟之后的發(fā)酵罐，控制通氣3.0L/(L·min)，控制攪拌速度350r/min，溫度32℃，發(fā)酵24h，得到發(fā)酵液及菌體；重復(fù)取料重復(fù)上述步驟D中的取料步驟將重復(fù)發(fā)酵24h得到的發(fā)酵液及菌體靜置20min，保持發(fā)酵罐壓力0.1個大氣壓，發(fā)酵液中的菌體由于自重沉降至發(fā)酵罐底部，通過發(fā)酵罐內(nèi)的壓力壓出發(fā)酵上清液360L，菌體保留在發(fā)酵罐底部；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑在0.5mm～4.0mm；如此反復(fù)補料、重復(fù)發(fā)酵、重復(fù)取料共五次，每次得到發(fā)酵液，該發(fā)酵液L-乳酸濃度為85g/L～90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85％以上，得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑在0.5mm～4.0mm，其中第一次重復(fù)發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中L-乳酸濃度為90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85％，菌體干重為17g/L，第5次重復(fù)發(fā)酵得到的發(fā)酵液中菌體干重為25g/L；上述補料培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖100g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀0.1g/L、硫酸鋅0.22g/L、硫酸鎂0.25g/L、碳酸鈣50g/L；F、500L罐進行半連續(xù)后20次高密度高強度重復(fù)發(fā)酵重復(fù)上述步驟E，培養(yǎng)基為高強度發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中的通氣量為2.5L/(L·min)，攪拌速度改為250r/min，溫度32℃，每次重復(fù)發(fā)酵時間為18h，每次重復(fù)發(fā)酵結(jié)束時得到發(fā)酵液及菌體，該發(fā)酵液L-乳酸濃度為85g/L～90g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85％以上，發(fā)酵強度穩(wěn)定在4.7～5.0g/(h·L)；得到保留在發(fā)酵罐底部的菌體，該菌體大部分為菌絲球，直徑在0.5mm～4.0mm，其中第25次取料前發(fā)酵液中菌體干重為35g/L；上述高強度發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成葡萄糖100g/L、硫酸銨1g/L、磷酸二氫鉀0.05g/L、硫酸鋅0.11g/L、硫酸鎂0.15g/L、碳酸鈣50g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了米根霉半連續(xù)高密度發(fā)酵產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸新工藝，涉及如下步驟(1)制備米根霉孢子懸液，(2)制備種子培養(yǎng)液，(3)高密度菌體的擴增，(4)500L發(fā)酵罐首批發(fā)酵，(5)500L罐半連續(xù)高密度發(fā)酵-前5次增殖菌體重復(fù)發(fā)酵，(6)500L罐半連續(xù)后20次高密度高強度重復(fù)發(fā)酵。本發(fā)酵工藝中通過重復(fù)利用米根霉菌體，成功實現(xiàn)了半連續(xù)發(fā)酵，提高了原料利用率；通過菌體高密度的構(gòu)建，使發(fā)酵周期縮短至18h，發(fā)酵強度提高到5.0g/(h·L)，工業(yè)生產(chǎn)具有很好的前景；發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸光學(xué)純度在99.5％以上，滿足食品醫(yī)藥的要求，工業(yè)化生產(chǎn)后能夠很大程度上緩解當(dāng)前對高光學(xué)純度L-乳酸的需求。
文檔編號C12P7/40GK101497901SQ20091011626
公開日2009年8月5日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日
發(fā)明者模 劉, 靖 劉, 吳學(xué)鳳, 姜紹通, 張巧蘭, 李興江, 威 杜, 潘麗軍, 羅水忠, 志 鄭 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)