專利名稱：聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵l-乳酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的改進方法。
背景技術：
乳酸(Lactic acid)，又名2 —羥基丙酸，分子式CH3CH(OH)COOH，是重要
的有機酸之一，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中，是食品工業(yè)中常用的酸味劑和防腐劑，也是醫(yī)藥、化工、皮革、香料等工業(yè)的重要的原料。L-乳酸做為環(huán)境友好的生物可降解材料聚L-乳酸(PLA)的原料，國內(nèi)外對乳酸的需求量日益增加，發(fā)展前景十分廣闊。乳酸的來源主要是化學法合成和微生物發(fā)酵生產(chǎn)。由于采用發(fā)酵法生產(chǎn)，碳源利用率很高，甚至可以達到100%，并且可以轉(zhuǎn)化利用作物秸稈以及林業(yè)廢料等可再生資源，因此國內(nèi)外普遍使用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)乳酸。
米根霉(i /^c^^oo;zM)由于具有產(chǎn)物光學純度高、營養(yǎng)消耗簡單、產(chǎn)物易于分離等特點而成為生產(chǎn)高光學純度L-乳酸的理想菌株。但是由于米根霉菌絲比較發(fā)達，在通常的攪拌發(fā)酵罐中容易糾結成團和纏住攪拌軸，從而增加了傳質(zhì)阻力和動力消耗。許多工藝方法如表面生物轉(zhuǎn)盤法、電滲析法和離子樹脂等用于解決上述問題，但大都較復雜或成本太高，不利于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。相對而言，固定化技術是一種有利于發(fā)酵與分離耦合的生物反應技術，能提高微生物的耐性和利用率，能減少后期分離的工藝過程。目前適用于米根霉固定化的方法有吸附法、自絮集法和包埋法。吸附法中的菌絲體易脫落，自絮集法不易控制固定化細胞的大小。因此包埋法具有更廣泛的用途。包埋法所用的固定化載體有聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉、聚丙烯酰氨(ACAM)、聚乙烯乙二醇(PEG)、瓊脂、聚胺酯泡沫、角叉菜膠和聚丙稀酸等凝膠。海藻酸鈉是最普遍的固定化載體，但其機械強度不高易破碎。聚丙烯酰氨等對細胞毒性比較大。聚乙烯醇(PVA)具有強度高，化學穩(wěn)定性好，抗微生物分解性強，且價格低廉等一系列優(yōu)點，是一種較為理想的包埋固定化載體，已應用于多種微生物的固定化。但常規(guī)的PVA —硼酸法制得的凝膠珠的通透性差，凝膠顆粒間易結團成塊，且硼酸對生物毒性大，細胞活性會受到影響。因此，對常規(guī)的PVA—硼酸固定化米根霉方法進行改進是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有的聚乙烯醇球狀載體以及通透性差的缺點，提供一種改進的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法。
為解決上述問題，本發(fā)明的技術方案為
一種聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特征在于將聚乙烯醇和海藻酸鈉于沸水浴加熱共溶于水，與米根霉孢子懸液混合，將混合液滴入含有3-5%氯化鈣的飽和硼酸溶液中，同時不停攪拌，使顆粒成球形，好的固定化顆粒于低溫下硬化，然后用磷酸二氫鈉溶液浸泡處理，然后用水洗滌除去顆粒內(nèi)生成的海藻酸鈣，得到的聚乙烯醇固定化米根霉細胞進行增殖培養(yǎng)生長后，用蒸餾水洗凈，用于L-乳酸的分批和重復分批發(fā)酵。
所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特征在于米根霉孢
子懸液中聚乙烯醇的濃度為4-10%，海藻酸鈉的濃度為0.4-2%;所述的飽和硼酸溶液中含有2%氯化鈣，其pH值為5. 0-6. 0;接入米根霉孢子懸液與聚乙烯
醇和海藻酸鈉混合液的體積比為1: 2-10;磷酸二氫鈉溶液的濃度是
0. 2-0. 4mol/L，浸泡處理時間是0. 5-2小時。
所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特征在于米根霉孢子懸液中聚乙烯醇的濃度為6%，海藻酸鈉的濃度為0.8%;接入米根霉孢子懸
液與聚乙烯醇和海藻酸鈉混合液的體積比為1: 3.3;磷酸二氫鈉溶液的濃度是
0. 3mol/L,浸泡處理時間是0. 5-1小時。
所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特征在于固定化顆粒于4。C下硬化24小時。
所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特征在于得到的聚乙烯醇固定化米根霉細胞進行增殖培養(yǎng)生長后，用蒸餾水洗凈，用于L-乳酸的分批和重復分批發(fā)酵的具體步驟是
(1) 增殖固定化米根霉細胞增殖培養(yǎng)基中接入20% (v/v)固定化細胞，增殖 條件為150r/min， 37°C下增殖24小時；
(2) 接種量的確定接種量為20% (v/v);
(3) 發(fā)酵溫度確定發(fā)酵溫度為38。C;
(4) 重復分批發(fā)酵將上批固定化米根霉細胞用蒸餾水洗凈，轉(zhuǎn)入新鮮發(fā)酵培養(yǎng)
基中用于下批發(fā)酵，可重復發(fā)酵，產(chǎn)酸100 106g/L。
海藻酸鈉可解決聚乙烯醇結塊成團的問題，得到球狀顆粒，磷酸鹽與聚乙烯 醇的酯化反應使得顆粒結構更加堅固，同時磷酸鹽能破壞顆粒中的海藻酸鈣，可 以擴大凝膠孔徑，提高通透性。
本發(fā)明固定化方法簡單可行,可提高L-乳酸產(chǎn)量并且將來便于用于工業(yè)上
連續(xù)化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，克服了傳統(tǒng)米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸存在的問題1、由
于米根霉菌絲比較發(fā)達，在通常的攪拌發(fā)酵罐中容易糾結成團和纏住攪拌軸，從
而增加了傳質(zhì)阻力和動力消耗；2、游離菌不利于分批發(fā)酵或者是連續(xù)發(fā)酵，并 且在分批接菌的過程中容易染菌；3、聚乙烯醇固定化細胞在用碳酸鈉或氫氧化 鈉作為中和劑的發(fā)酵體系中保持穩(wěn)定，解決傳統(tǒng)的碳酸鈣作為中和劑時制取乳酸
所造成的污染。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所提供的這種改進方法具有下列特點
(1) 、機械強度高，聚乙烯醇制得的顆粒易結塊，而本發(fā)明的聚乙烯醇和海 藻酸鈉混合液制成的珠體效果佳；
(2) 、產(chǎn)酸量高，與游離細胞發(fā)酵相比，在投糖15%的情況下，L一乳酸產(chǎn) 量提高了 20%，產(chǎn)量達到106. 48g/L;
(3) 、產(chǎn)酸速率快，用磷酸二氫鈉處理后的固定化細胞產(chǎn)乳酸的速率提高到 2. 74g/L h，發(fā)酵時間比未處理的固定化細胞發(fā)酵縮短了一半；
(4) 、重復使用效果好，本發(fā)明的固定化細胞可以在不含氮源的新鮮培養(yǎng)基 中反復使用14次，產(chǎn)乳酸的活性保持穩(wěn)定。
具體實施例方式
用無菌水將斜面上的米根霉孢子洗下，用玻璃珠打散，制得孢子懸液。稱取海藻酸鈉(化學醇)、聚乙烯醇(聚合度，1750)用50mL無菌水沸水浴加熱溶 解，滅菌后加入15mL孢子懸液，混勻，滴入含2%氯化鈣的飽和硼酸溶液(pH 為5. 0-6.0)中，并用磁力攪拌器不停攪拌。固定化顆粒在4。C固化24小時， 然后用蒸餾水洗凈后，浸在0.3mol/L磷酸二氫鈉溶液中0.5-1小時。得到的固 定化細胞在37。C， 150r/min的條件下增殖培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基 (15%葡萄糖)中用于L-乳酸發(fā)酵。搖瓶發(fā)酵條件是50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中接入 10mL固定化細胞，在38。C， 170r/min下培養(yǎng)36小時；在鼓泡式發(fā)罐中的發(fā)酵 條件為pH=6. 0、 38°C、 1. Ovvm,接種量為20%(v/v)。將發(fā)酵液稀釋到合適的濃 度，用生物傳感儀測定出殘?zhí)呛腿樗岙a(chǎn)量。搖瓶實驗表明，固定化細胞產(chǎn)酸活性 高，L-乳酸產(chǎn)量達106.48g/L，固定化顆?；钚愿撸苤貜褪褂?4批。在以碳 酸鈉或氫氧化鈉為中和劑的發(fā)酵條件下，固定顆粒強度高，球形規(guī)則，沒有顆粒 破裂細胞泄漏的情況發(fā)生。
權利要求
1、一種聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特征在于將聚乙烯醇和海藻酸鈉于沸水浴加熱共溶于水，與米根霉孢子懸液混合，將混合液滴入含有3-5％氯化鈣的飽和硼酸溶液中，同時不停攪拌，使顆粒成球形，好的固定化顆粒于低溫下硬化，然后用磷酸二氫鈉溶液浸泡處理，然后用水洗滌除去顆粒內(nèi)生成的海藻酸鈣，得到的聚乙烯醇固定化米根霉細胞進行增殖培養(yǎng)生長后，用蒸餾水洗凈，用于L-乳酸的分批和重復分批發(fā)酵。
2、 按照權利要求l所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特 征在于米根霉孢子懸液中聚乙烯醇的濃度為4-10%，海藻酸鈉的濃度為0.4-2 %;所述的飽和硼酸溶液中含有2%氯化鈣，其pH值為5.0-6.0;接入米根霉孢子懸液與聚乙烯醇和海藻酸鈉混合液的體積比為1: 2-10;磷酸二氫鈉溶液的濃度是0. 2-0. 4mol/L,浸泡處理時間是0. 5_2小時。
3、 按照權利要求l所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特 征在于米根霉孢子懸液中聚乙烯醇的濃度為6%，海藻酸鈉的濃度為0.8%; 接入米根霉孢子懸液與聚乙烯醇和海藻酸鈉混合液的體積比為1: 3.3;磷酸二氫鈉溶液的濃度是0. 3mol/L，浸泡處理時間是0. 5-1小時。
4、 按照權利要求l所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特 征在于固定化顆粒于4。C下硬化24小時。
5、 根據(jù)權利要求l所述的聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，其特 征在于得到的聚乙烯醇固定化米根霉細胞進行增殖培養(yǎng)生長后，用蒸餾水洗凈， 用于L-乳酸的分批和重復分批發(fā)酵的具體步驟是(1) 增殖固定化米根霉細胞增殖培養(yǎng)基中接入20。/。(v/v)固定化細胞，增殖條 件為150r/min， 37°C下增殖24小時；(2) 接種量的確定接種量為20% (v/v);(3) 發(fā)酵溫度確定發(fā)酵溫度為38。C;(4) 重復分批發(fā)酵將上批固定化米根霉細胞用蒸餾水洗凈，轉(zhuǎn)入新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中用于下批發(fā)酵，可重復發(fā)酵，產(chǎn)酸100 106g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的方法，具體是將聚乙烯醇和海藻酸鈉于沸水浴加熱共溶于水，與米根霉孢子懸液混合，用注射器將混合液滴入含有氯化鈣的飽和硼酸溶液中，同時用磁力攪拌器不停攪拌，使顆粒成球形，好的固定化顆粒于低溫下硬化，然后用磷酸二氫鈉溶液處理，固定化細胞增殖生長后，用蒸餾水洗凈，用于L-乳酸的分批和重復分批發(fā)酵。這種聚乙烯醇固定化米根霉發(fā)酵L-乳酸的改進方法克服了現(xiàn)有的聚乙烯醇球狀載體以及通透性差的缺點，且具有機械強度高、產(chǎn)酸量高、產(chǎn)酸速率快和重復使用效果好的優(yōu)點。
文檔編號C12N11/00GK101519675SQ20091011645
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月30日 優(yōu)先權日2009年3月30日
發(fā)明者姚黎明, 張臘梅, 娟 李, 麗 王, 鵬 王, 袁成凌, 鄭之明, 振 陳 申請人:中國科學院等離子體物理研究所