專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離
提取干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
目前國(guó)際上從人類(lèi)骨髓、臍帶血中分離細(xì)胞的方法很多，本申請(qǐng)人也申 請(qǐng)了兩項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)，如《骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法》(申請(qǐng) 號(hào)200710137781.9)禾P《一 種有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法》(申請(qǐng)?zhí)?200610106875. 5)。這些技術(shù)為從人體骨髓和胎兒分娩后的臍帶血中獲取干細(xì)胞提供了技 術(shù)保障，為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。 但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)人胎盤(pán)和臍帶不僅僅是血中含有大量的干細(xì)胞，而且 在實(shí)體組織中也含有大量的成體干細(xì)胞ACS(adult stem cell)，如間充質(zhì)干細(xì)胞MSC、 (mesenchymal stem cell)、多會(huì)g成體干細(xì)胞MAPC(multipotent adult progenitor cell)、多能成體祖細(xì)胞USSC(unrestricted somatic stem cell)、內(nèi)皮祖細(xì)胞 EPC (endothelialprogenitor cell)、月旨肪_衍生干細(xì)胞ASC (adipose__derived stern cell)，脂肪干細(xì)胞FSC(fat stem cells)、成纖維干細(xì)胞(fibroblasts stemcell)、造血干 細(xì)胞HSC (hematopoietic stem cell)等。 一直以來(lái)，在胎兒分娩后，胎盤(pán)和臍帶就成廢物。 從這些廢棄的實(shí)體組織中收集提取成體干細(xì)胞，將會(huì)對(duì)成體干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和研究提供 豐富的干細(xì)胞來(lái)源。 近年來(lái)科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)脂肪組織中除含有豐富的脂肪干細(xì)胞(FSC)以外， 還含有成纖維干細(xì)胞(fibroblasts stem cell)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，造血干細(xì)胞 HSC (hematopoietic stem cell)等成體干細(xì)胞(ACS)。脂肪組織中干細(xì)胞的種類(lèi)與數(shù)量?jī)H 次于骨髓組織，是人體的第二大儲(chǔ)存干細(xì)胞的組織。在臨床上采集骨髓和采集腹部的脂肪， 兩者相比，采集脂肪病人更容易接受，相比痛苦也小一點(diǎn)。還有近年來(lái)美容和減肥的吸脂手 術(shù)后可獲得大量的脂肪，將這些脂肪中的干細(xì)胞分離提取再利用也是一個(gè)非常好的途徑。
胎盤(pán)、臍帶及脂肪組織盡管結(jié)構(gòu)不同、組織種類(lèi)不同，但都是實(shí)體組織。雖然兩種 組織儲(chǔ)存的成體干細(xì)胞的種類(lèi)和數(shù)量方面有差異，但是存在于組織中細(xì)胞池(也叫壁龕、 集落)的存在形式是相同的，所以可用同一種獲取的方法獲得。 目前，盡管已經(jīng)有從胎盤(pán)臍帶組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，也有從胎盤(pán)臍帶 組織中獲取營(yíng)養(yǎng)層干細(xì)胞的方法，但都是實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，距離產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化還有很長(zhǎng)一段距 離；第二，這些方法只能獲取單一種類(lèi)的干細(xì)胞，不能有效保留全部的成體干細(xì)胞/祖細(xì) 胞；第三由于是實(shí)驗(yàn)室技術(shù)沒(méi)有操作規(guī)范的和產(chǎn)品質(zhì)量要求，在臨床推廣應(yīng)用時(shí)無(wú)法保證 生物安全性和質(zhì)量控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種可在臨床推廣應(yīng)用，方便可靠，安全有效的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，該方法可獲得成體組
織中所有的干細(xì)胞。 本發(fā)明的技術(shù)方案為 本發(fā)明不僅實(shí)現(xiàn)了從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取所有干細(xì)胞，而且實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，使醫(yī)生在臨床上方便、安全、規(guī)范地獲取成體干細(xì)胞，像用藥一樣地使用成體干細(xì)胞治療病人的疾病，解決臨床上很難獲取成體干細(xì)胞的瓶頸，推廣細(xì)胞治療技術(shù)。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單可靠，操作規(guī)范，安全有效，避免交叉污染，規(guī)范操作，能夠保證質(zhì)量控制的產(chǎn)
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
試劑盒組成 1、沉淀劑5%羥乙基淀粉，0.4%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7.4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 5 %聚蔗糖400#等，12. 5 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2。 3、細(xì)胞保養(yǎng)液磷酸緩沖液，ra值為7. 4±0. 2。4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時(shí)配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎機(jī)刀頭、蔡氏過(guò)濾器、50ml硅化離心管，10ml和25ml移液管、細(xì)胞轉(zhuǎn)移管組成的一個(gè)組合包裝。采用吸塑盒密封的一次性使用的包裝。采用Y射線消毒或是環(huán)氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。
上述的l-3條試劑配制后經(jīng)過(guò)12rC高壓滅菌35分鐘，分別存放試劑盒中，測(cè)試細(xì)菌內(nèi)毒素《0. 5EU/ml，2 8t:保存和運(yùn)輸，膠原酶分裝后與上述試劑一起保存。
取新鮮胎盤(pán)和臍帶一個(gè)稱(chēng)量以后，按重量與細(xì)胞保養(yǎng)液以4 : l的比例放到組織粉碎桶，以6000轉(zhuǎn)/分4分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻后，放置到37°C ±0. 5t:的水浴箱中30分鐘。 用蔡氏漏斗過(guò)濾后按體積4 : l加入沉淀劑，混勻后靜置20-30分鐘，收取上清夜，離心力1100Xg離心5分鐘，除去上清夜，加到泛影酸鈉-聚蔗糖400"夜體上面(雞尾酒加法)。用離心力650Xg離心30分鐘，吸取細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗3次。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率檢測(cè)后即可使用。
細(xì)胞存活率>96%; 細(xì)胞收集率為200g胎盤(pán)臍帶組織收集細(xì)胞總數(shù)應(yīng)為2. 5-4. 9X 108。 上述濃度為質(zhì)量濃度，其操作方法為質(zhì)量規(guī)范方法，其產(chǎn)品的包裝組合為實(shí)用技
術(shù)組合。 實(shí)施例2
試劑盒組成 1、沉淀劑7%羥乙基淀粉，0. 2%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 6 %聚蔗糖400#等，10 %泛影酸鈉的混合液，密度
41. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3 、細(xì)胞保養(yǎng)液、磷酸緩沖液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時(shí)配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過(guò)濾器、50ml硅化離
心管，10ml和25ml移液管、細(xì)胞轉(zhuǎn)移管組成的一個(gè)組合包裝。采用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。采用Y射線消毒或是環(huán)氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配制后經(jīng)12rC高壓滅菌35分鐘。測(cè)試細(xì)菌內(nèi)毒素《0. 5EU/
ml，分別存放試劑盒中，2 8t:保存和運(yùn)輸，膠原酶分裝后與上述試劑一起保存。 取新鮮胎盤(pán)和臍帶一個(gè)稱(chēng)量以后，按重量與細(xì)胞保養(yǎng)液以3 : l的比例放到組織
粉碎桶，以6000轉(zhuǎn)/分4分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻后，放置到37°C ±0. 5t:的水浴箱
中30分鐘。 具體操作方法同實(shí)施例l。 細(xì)胞收集率為200g胎盤(pán)臍帶組織收集細(xì)胞總數(shù)應(yīng)為2. 5-4. 9 X 108。 上述濃度為質(zhì)量濃度，其操作方法為質(zhì)量規(guī)范方法，其產(chǎn)品的包裝組合為實(shí)用技
術(shù)組合。 實(shí)施例3
試劑盒組成 1、沉淀劑5%羥乙基淀粉，0. 4%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2、泛影酸鈉_聚蔗糖400# :5%聚蔗糖400#等，12. 5 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3 、細(xì)胞保養(yǎng)液磷酸緩沖液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時(shí)配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過(guò)濾器、50ml硅化離
心管，10ml和25ml移液管、細(xì)胞轉(zhuǎn)移管組成的一個(gè)組合包裝。采用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。采用Y射線消毒或是環(huán)氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配制后經(jīng)過(guò)12rC高壓滅菌35分鐘，分別存放試劑盒中，測(cè)試細(xì)
菌內(nèi)毒素《0. 5EU/ml，2 8t:保存和運(yùn)輸，膠原酶分裝后與上述試劑一起保存。 取新鮮的脂肪組織，按重量與細(xì)胞保養(yǎng)液以4 : l的比例放到組織粉碎桶，以3000
轉(zhuǎn)/分2分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻后，放置到37°C ±0. 5t:的水浴箱中30分鐘。 用蔡氏漏斗過(guò)濾后按體積4 : l加入沉淀劑，混勻后靜置20-30分鐘，收取上清
夜，離心力1100Xg離心5分鐘，除去上清夜，加到泛影酸鈉-聚蔗糖400ft液體上面(雞尾
酒加法)。用離心力650Xg離心20分鐘，吸取細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗3次。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)
數(shù)和細(xì)胞存活率檢測(cè)后即可使用。 細(xì)胞存活率>96%。 細(xì)胞收集率為350g吸取的脂肪組織收集細(xì)胞總數(shù)應(yīng)為1 X 108。 上述濃度為質(zhì)量濃度，其操作方法為質(zhì)量規(guī)范方法，其產(chǎn)品的包裝組合為實(shí)用技
術(shù)組合。 實(shí)施例4
試劑盒組成 1、沉淀劑7%羥乙基淀粉，0. 2%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 6 %聚蔗糖400#等，10 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3、細(xì)胞保養(yǎng)液磷酸緩沖液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時(shí)配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過(guò)濾器、50ml硅化離
心管，10ml和25ml移液管、細(xì)胞轉(zhuǎn)移管組成的一個(gè)組合包裝。采用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。采用Y射線消毒或是環(huán)氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配制后經(jīng)12rC高壓滅菌35分鐘。測(cè)試細(xì)菌內(nèi)毒素《0. 5EU/
ml，分別存放試劑盒中，2 8t:保存和運(yùn)輸，膠原酶分裝后與上述試劑一起保存。 取新鮮的脂肪組織，按重量與細(xì)胞保養(yǎng)液以4 : 1的比例放到組織粉碎桶中，以
3000轉(zhuǎn)/分2分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻后，放置到37°C ±0. 5°C的水浴箱中30分鐘。 具體應(yīng)用方法同實(shí)施例l。 細(xì)胞存活率>96%。 細(xì)胞收集率為350g吸取的脂肪組織收集細(xì)胞總數(shù)應(yīng)為1 X 108。 上述濃度為質(zhì)量濃度，其操作方法為質(zhì)量規(guī)范方法，其產(chǎn)品的包裝組合為實(shí)用技
術(shù)組合。 實(shí)施例5
試劑盒組成 1、沉淀劑7%羥乙基淀粉，0. 2%葡萄糖酸鈣的水溶液，ra值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。 2 、泛影酸鈉-聚蔗糖400# : 6 %聚蔗糖400#等，10 %泛影酸鈉的混合液，密度1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2，滲透壓279m0sm/kg。
3、細(xì)胞保養(yǎng)液磷酸緩沖液。 4、膠原酶II或III或IV50-100mg或0. 25%胰蛋白酶10ml。 5、試劑盒同時(shí)配有一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過(guò)濾器、50ml硅化離
心管，10ml和25ml移液管、細(xì)胞轉(zhuǎn)移管組成的一個(gè)組合包裝。采用吸塑盒密封的一次性使
用的包裝。采用Y射線消毒或是環(huán)氧乙烷消毒。每一套試劑盒配一套一次性用品。 上述的1-3條試劑配制后經(jīng)12rC高壓滅菌35分鐘。測(cè)試細(xì)菌內(nèi)毒素《0. 5EU/
ml，分別存放試劑盒中，2 8t:保存和運(yùn)輸，膠原酶分裝后與上述試劑一起保存。 取新鮮的脂肪組織，按重量與細(xì)胞保養(yǎng)液以2.5 : l的比例放到組織粉碎桶中，以
3000轉(zhuǎn)/分2分鐘粉碎，加入膠原酶1支混勻后，放置到37°C ±0. 5°C的水浴箱中30分鐘。 具體應(yīng)用方法同實(shí)施例1 。 細(xì)胞存活率>96%。 細(xì)胞收集率為350g吸取的脂肪組織收集細(xì)胞總數(shù)應(yīng)為1 X 108。 上述濃度為質(zhì)量濃度，其操作方法為質(zhì)量規(guī)范方法，其產(chǎn)品的包裝組合為實(shí)用技
術(shù)組合。
6
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
不限于上述實(shí)施例所提供的方式,
權(quán)利要求
一種從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其工藝步驟為首先將胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織與細(xì)胞保養(yǎng)液按2.5～4∶1的重量比混合放入組織粉碎桶中，以3000-6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速粉碎2-4分鐘，然后加入膠原酶充分混勻，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中孵育20-30分鐘，用200目過(guò)濾器過(guò)濾，按組織懸液量的25％-40％比例加入沉淀劑，混勻后靜置10～30分鐘，吸取上清液，用1100Xg的離心力離心3～5分鐘，除去上清液，將濃縮的細(xì)胞加入到泛影酸鈉-聚蔗糖400#的液體上，用離心力650Xg離心10-30分鐘，收取中間10-15ml的細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗3-4次，將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞存活率≥95％時(shí)，即可以供臨床使用。
2. 按照權(quán)利要求1所述的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其特征在于將上述分離提取干細(xì)胞的所有試劑細(xì)胞保養(yǎng)液、膠原酶、沉淀劑和泛影酸鈉_聚蔗糖400#分開(kāi)保存于同一個(gè)試劑盒中，每一套試劑盒與一套一次性用品配套作為一次分離提取的器具。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其特征是所述的細(xì)胞保養(yǎng)液為磷酸緩沖液，ra值為7. 4±0. 2。
4. 按照權(quán)利要求1或2所述的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其特征是所述的膠原酶為膠原酶11、膠原酶III或膠原酶IV。
5. 按照權(quán)利要求1或2所述的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其特征是所述的沉淀劑是指由5-7%的羥乙基淀粉、甲基纖維素或羧甲基淀粉與0. 2-0. 4%葡萄糖酸鈣組成的水溶液，ra值為7. 4±0. 2。
6. 按照權(quán)利要求1或2所述的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其特征是所述的泛影酸鈉_聚蔗糖400#，其密度為1. 077-1. 080， PH值為7. 4±0. 2。
7. 按照權(quán)利要求2所述的從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其特征是所述一套一次性用品是由一次性滅菌的組織粉碎桶、粉碎力頭、蔡氏過(guò)濾器、50ml硅化離心管、10ml和25ml移液管和細(xì)胞轉(zhuǎn)移管組成的一個(gè)組合包裝。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法，其工藝步驟為首先將胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織與細(xì)胞保養(yǎng)液按2.5～4∶1的重量比混合放入組織粉碎桶中，粉碎后加入膠原酶混勻，在37℃左右條件下孵育，過(guò)濾，加入沉淀劑，靜置后吸取上清液，離心，除去上清液，將濃縮的細(xì)胞加入到泛影酸鈉-聚蔗糖400#的液體上，再離心，收取中間10-15ml的細(xì)胞層，用細(xì)胞保養(yǎng)液清洗，將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞存活率≥95％時(shí)，即可以供臨床使用。本發(fā)明不僅實(shí)現(xiàn)了從胎盤(pán)、臍帶或脂肪組織中分離提取所有干細(xì)胞，而且實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，使醫(yī)生在臨床上方便、安全、規(guī)范地獲取成體干細(xì)胞，像用藥一樣地使用成體干細(xì)胞治療病人的疾病，解決臨床上很難獲取成體干細(xì)胞的瓶頸，推廣細(xì)胞治療技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N5/074GK101693884SQ20091011752
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者王懷林, 王沁怡 申請(qǐng)人:王沁怡;王懷林;