專利名稱：：檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈dna適配子及其制備方法專利說(shuō)明本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是生物檢測(cè)技術(shù)。具體涉及一種利用分子生物學(xué)SELEX技術(shù)設(shè)計(jì)的能夠特異性檢測(cè)人慢性粒細(xì)胞白血病的高親和力單鏈DNA適配子及其制備方法。
背景技術(shù)：
：白血病(Leukemia)是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病。在我國(guó)，白血病被列為十大高發(fā)性腫瘤之一，約占腫瘤總發(fā)病率的5%左右。其死亡率占我國(guó)腫瘤男性第6位、女性第8位，在兒童及青少年中占第1位。慢性粒細(xì)胞性白血病，簡(jiǎn)稱慢粒(chronicmyelognousleukemia,CML)，是臨床上一種起病及發(fā)展相對(duì)緩慢的白血病，表現(xiàn)為髓系祖細(xì)胞池?cái)U(kuò)展，髓細(xì)胞系及其祖細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。我國(guó)的CML發(fā)病率調(diào)查結(jié)果為年發(fā)病率36/10萬(wàn)，在我國(guó)CML約占各類白血病的20%，占慢性白血病的95%。發(fā)病年齡分布較廣，但發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)有逐步上升的趨勢(shì)。臨床上白血病的診斷主要依靠血象、骨髓象、細(xì)胞化學(xué)染色以及用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白血病細(xì)胞抗原，但是血象檢查無(wú)特異性，骨髓穿剌具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，且技術(shù)要求較高，細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果受影響的因素較多，如試劑、每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員判斷標(biāo)準(zhǔn)等，使結(jié)果相差很大，流式細(xì)胞儀檢測(cè)價(jià)格昂貴，不能作為常規(guī)體檢的項(xiàng)目對(duì)白血病進(jìn)行人群普查。臨床上現(xiàn)有的檢測(cè)手段診斷出的白血病均已屬晚期，如能早期診斷，無(wú)論化療或放療，治療效果非常顯著，癥狀、體征可完全消失，血象、骨髓象恢復(fù)正?；蚪咏?。因此白血病的早期診斷成為亟待解決的問(wèn)題。利用SELEX技術(shù)篩選出靶細(xì)胞特異性適配子，從而建立白血病的早期特異性檢測(cè)技術(shù)方法。SELEX技術(shù)(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制的一種新的組織化學(xué)技術(shù)，其基本思想是體外構(gòu)建一個(gè)大容量單鏈寡核苷酸文庫(kù)，并與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)與核酸的復(fù)合物，洗掉未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行下一輪的篩選過(guò)程。通過(guò)重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，最后得到特異性強(qiáng)、親和力高的寡核苷酸適配子(aptamers)，具有庫(kù)容量大、耙物質(zhì)范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種靶物質(zhì)的篩選，除用于核苷酸序列、蛋白質(zhì)、氨基酸(L-精氨酸)夕卜，還可用于染料、金屬離子、藥物小分子(如茶堿)、生長(zhǎng)因子、肽鏈、類固醇、糖類，甚至可用于完整的細(xì)胞、病毒、孢子和朊病毒等。這種方法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，與其他化學(xué)庫(kù)如隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)和噬菌體表面展示文庫(kù)相比，從寡核苷酸文庫(kù)中篩選出的適配子具有更高的親和力和特異性，具有良好的應(yīng)用前景。目前通過(guò)此技術(shù)篩選到的靶物質(zhì)有200多種，篩選出的適配子在疾病的診斷、治療與藥物的快速開(kāi)發(fā)等方面起著重要作用。目前，在國(guó)內(nèi)利用SELEX技術(shù)篩選特異性適配子方面的研究很多，但是在白血病適配子的開(kāi)發(fā)上還是空白，而且在國(guó)外發(fā)表的文獻(xiàn)僅報(bào)道了以急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性T細(xì)胞型淋巴母細(xì)胞白血病為材料篩選適配子的方法，然而在慢性粒細(xì)胞白血病適配子的制備上沒(méi)有任何報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)篩選出的DNA適配子可以填充空白，而且為慢性粒細(xì)5胞白血病的診斷、治療等提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠特異性結(jié)合慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的DNA適配子，該DNA適配子為診斷和治療慢性粒細(xì)胞白血病提供了新的方法，為克服臨床上現(xiàn)在不能做到早期診斷、早期治療的問(wèn)題，提供了新的解決途徑。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備能夠和慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞高親和力特異性結(jié)合的DNA適配子的方法，該方法包括隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物的構(gòu)建、PCR擴(kuò)增、生物素_鏈霉親和素磁珠分離制備次級(jí)文庫(kù)、SELEX篩選、人中性粒細(xì)胞反篩、一級(jí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析、適配子親和力特異性的測(cè)定。本發(fā)明的有益效果是能特異性的結(jié)合慢性白血病K562細(xì)胞上，而與其他細(xì)胞的結(jié)合率很低，因此該DNA適配子經(jīng)修飾可檢測(cè)和治療慢性粒細(xì)胞性白血病。因?yàn)椴捎昧诵碌慕M合化學(xué)技術(shù)-SELEX技術(shù)進(jìn)行慢性粒細(xì)胞性白血病的DNA適配子的篩選，確保了獲得的DNA適配子可特異性結(jié)合在慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞上，從而檢測(cè)和治療慢性粒細(xì)胞性白血病。另外，本發(fā)明制備的DNA適配子為小分子核酸，其分子結(jié)構(gòu)不同于任何使用的檢測(cè)物質(zhì)，且只高親和力結(jié)合慢性粒細(xì)胞，對(duì)其他細(xì)胞并無(wú)危害；該DNA適配子也有別于傳統(tǒng)的抗體，其分子量小，可快速滲入，經(jīng)修飾后作為治療藥物攜帶體，無(wú)抗原性，不引起副作用。圖1表示不同循環(huán)的PCR產(chǎn)物3%瓊脂糖電泳圖；圖1中1-5分別代表9、12、15、18、21個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物；M代表100bpDNAMarker;箭頭指示為目的條帶。圖2表示部分SELEX篩選的PCR產(chǎn)物3%瓊脂糖電泳圖；圖2中l(wèi)-5分別代表第1、4、7、10、13輪篩選的PCR產(chǎn)物;M代表100bpDNAMarker;箭頭指示為目的條帶。圖3表示部分SELEX篩選的產(chǎn)物結(jié)合率所測(cè)吸光度A值圖；圖3中橫坐標(biāo)為篩選輪數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光度A值。圖4為感受態(tài)DH5a轉(zhuǎn)化率的測(cè)定圖；圖5為重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aa互補(bǔ)篩選圖；圖6為DNA適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。具體實(shí)施例方式材料與方法—、實(shí)驗(yàn)材料1.2細(xì)胞和菌株慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株；大腸桿菌DH5a。1.3克隆載體克隆載體pGEM-T購(gòu)自Promega公司，1.4主要試劑及試劑盒1.4.1PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；1.4.2PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；1.4.3UNIQ-10柱式DNA膠回收純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；1.4.4lOObpDNAmarker:購(gòu)自西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；1.4.5人中性粒細(xì)胞提取液購(gòu)自西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；1.4.6生物素_鏈霉親合素磁珠及磁力架購(gòu)自Promega公司；1.4.7pGEM-T載體和T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；1.4.8小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；1.4.9氨芐青霉素(Amp):購(gòu)自華美生物工程公司；1.4.10溴化乙錠(EB):購(gòu)自華美生物工程公司；1.4.11Agarose(瓊脂糖)德國(guó)進(jìn)口分裝；1.4.12IPTG:Promega產(chǎn)品分裝；1.4.13X-gal:美國(guó)進(jìn)口分裝;1.4.14胰蛋白胨英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；1.4.15酵母提取物英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；1.4.16Agar(瓊脂)日本進(jìn)口分裝；1.4.17ATP:購(gòu)自華美生物工程公司；1.4.18CaC12:購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；1.4.19Tris:購(gòu)自上海新興化工試劑研究所；1.4.20EDTA:購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；1.4.21BSA(牛血清蛋白)購(gòu)自西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司公司；1.4.22酚氯仿異戊醇(25:24:i):購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；1.4.23質(zhì)粒小提試劑盒天根生化科技有限公司；1.5主要試劑及配制1.5.1RPMI-1640的制備:取10.4g1640干粉溶于800ml新鮮三蒸水，磁力攪拌2h，加2gNaHC03再攪拌4h，加青、鏈霉素各io萬(wàn)u，定容至1L，過(guò)濾除菌并分裝到若干個(gè)小瓶，4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.2血清的滅活1瓶小牛血清在56t:水浴中滅活35min，消除補(bǔ)體活性，分裝到數(shù)個(gè)小瓶，-2(TC保存?zhèn)溆谩?.5.3谷氨酰胺貯存液谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾除菌，分裝小瓶，_201:保存，使用時(shí)向100ml培養(yǎng)液中加入lml谷氨酰胺溶液。1.5.4完全培養(yǎng)基的制備90mlRPMI-1640液體培養(yǎng)基中加入10ml滅活的小牛血清，制成含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。1.5.5D-hank，s液的配制稱取NaCl8.OOg，KCl0.4g，Na2HP0412H200.134g，KH2P040.06g，NaHC030.35g，酚紅0.02g溶于900ml三蒸水中，7.4%NaHC03pH值到7.2-7.4，容量燒瓶定容到1L，在1.034X105Pa高壓下蒸汽滅菌20min，4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.60.Olmol/L，pH7.4PBS的配制:稱取NaCl8.Og，KC10.2g，Na2HP0412H203.628g，KH2P040.24g溶于900ml三蒸水中，容量燒瓶定容到IL，在1.034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20min，4"C冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.70.5mol/L的EDTA(pH8.0)的配制:在800ml雙蒸水中加入EDTA-Na22H20186.lg，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用lmol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌放于4"C冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.8pH8.0的TE緩沖液的配制:吸取lmol/L的Tris-Cl(pH8.0)lOml，O.5mol/L的EDTA(pH8.0)2ml，加入800ml的雙蒸水，調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1000ml，分裝后高壓滅菌，4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.9溴化乙錠(EB)的配制在10ml雙蒸水中溶解0.lg的溴化乙錠，磁力攪拌3h使其溶解，分裝后用鋁箔包裹容器，4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.105XTBE的配制稱取54gTris堿加入27.5g硼酸和20ml0.5mol/LEDTA(pH8.O)，加入雙蒸水定容至lL，4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.116X上樣緩沖液的配制稱取2.5mg的溴酚藍(lán)和4g的蔗糖用雙蒸水溶解后定容至10ml，4"冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.123%瓊脂糖凝膠的配制1.5g瓊脂糖+50ml電泳緩沖液，在微波爐中加熱30s至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至5(TC時(shí)加入10mg/ml溴化乙錠1.25ul，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后使用。1.5.133XBSA的配制3g牛血清蛋白(BSA)溶于100mlPBS中，4"冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.142X結(jié)合緩沖液的配制50mMTrisHCl，5mMKCl，100mMNaCl，lmMMgCl2，調(diào)節(jié)pH7.4。1.5.152X洗滌緩沖液的配制將0.lmlTween20溶液加入100ml滅菌pH7.4的PBS緩沖液中，充分混勻，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩６?、?shí)驗(yàn)方法2.1慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的培養(yǎng)用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37"、飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔天傳代一次。2.2隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)及引物以下隨機(jī)ssDNA文庫(kù)和引物均委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。2.2.1隨機(jī)ssDNA文庫(kù)構(gòu)建了長(zhǎng)度為88nt的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，兩端為固定引物序列，中間52個(gè)核苷酸為隨機(jī)序列，庫(kù)容量大約為1016，合成量為20D26。。將合成庫(kù)加入22ii1的三蒸水配制成100iiM貯存液-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆?。合成的序列如?'-ATACCAGCTTATTCAATT-52-nt-AGATAGTAAGTGCAATCT—3'此外還合成了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(5'_FITC-88nt-3')，測(cè)定結(jié)合率時(shí)用。2.2.2引物合成以下5種引物，無(wú)任何二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，與核酸序列中已有的核酸序列無(wú)同源性。引物序列如下PI5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3'P25，-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3，P35，-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3，P45，-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3，P55，-AGATTGCACTTACTATCT-3'弓|物PI和P5分別對(duì)應(yīng)于隨機(jī)ssDNA庫(kù)的兩端固定序列，利于在PCR反應(yīng)時(shí)退火延伸；引物P4用生物素標(biāo)記，在用生物素-鏈霉親和素磁珠分離DNA雙鏈為單鏈時(shí)使用；引物P2、P3分別用熒光素和地高辛標(biāo)記，在測(cè)定結(jié)合率時(shí)使用。以上5種引物合成量均為50D26。，每0D的引物加57ii1的三蒸水配制成100yM貯存液-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3SELEX技術(shù)篩選K562細(xì)胞的適配子2.3.1SELEX篩選過(guò)程(l)lOiig的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)加到400iU2X結(jié)合緩沖液中，于1.5ml微量離心管中99"變性5min，然后立即置于(TC冰上10min;(2)加入3%BSA13.5降低背景；(3)將lX10e個(gè)人慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞加到上述溶液中混勻，37t:水浴30min;(4)更換離心管，去除與管壁結(jié)合的ssDNA;(5)3000rpm離心5min，去上清，加入400iU結(jié)合緩沖液混勻再3000rpm離心5min，反復(fù)6次;(6)最后所得沉淀加入100ii1ddH20，IO(TC加熱10min;(7)10000rpm離心5min，取上清，經(jīng)酚氯仿抽提，乙醇沉淀，將ssDNA溶解于20iilTE緩沖液中。2.3.2PCR擴(kuò)增將上述篩選過(guò)程得到的ssDNA用上游引物Pl和下游生物素標(biāo)記的引物P4經(jīng)PCR擴(kuò)增成一端帶生物素的dsDNA。PCR反應(yīng)體系為模板mii1，lOXPCRButter5iil，MgCl23iil，dNTPs5iU，TaqDNA多聚酶2U，上游引物、下游5'端生物素標(biāo)記的引物各25pmol，加去離子水至50yl;PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性2min，然后進(jìn)行n個(gè)循環(huán)94。C的變性30s，45。C退火lmin，72。C延伸30s，最后72。C延伸5min。PCR反應(yīng)體系如下10XPCRButter5pidNTPs5^1MgCl23^1上游引物25pmol下游5'端生物素標(biāo)記的引物25pmol模板mpiTaqDNA多聚酶2U去離子水upto50^1m為模板量，隨著篩選輪數(shù)的增加而不斷變化，具體數(shù)值見(jiàn)表1;n為循環(huán)次數(shù)，隨著篩選輪數(shù)的增加而不斷變化，具體數(shù)值表l。為了盡可能多地捕獲適配子，在開(kāi)始幾輪篩選過(guò)程中，ssDNA文庫(kù)和細(xì)胞量投放很多；在隨后的幾輪篩選中，由于高特異性的適配子已經(jīng)富集，為了提高篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性，結(jié)合時(shí)間由30min減少到20min;模板量也由2y1減少到0.5;然而PCR循環(huán)數(shù)卻由原來(lái)的11個(gè)循環(huán)增加到16個(gè)循環(huán)；具體數(shù)值見(jiàn)表1。表113輪篩選所加細(xì)胞、ssDNA文庫(kù)、結(jié)合時(shí)間、PCR循環(huán)數(shù)和模板量表輪數(shù)細(xì)胞量ssDNA結(jié)合時(shí)間PCR循環(huán)模板量(輪)(個(gè))Cpmol)(min)數(shù)(個(gè))(Hi)12xl0610003011222xl065003013132xl065003013141.5xl06300301511.5xl063002015161.5xl0620020151lxl0620020150.58lx10620020150.59lxl0610020160.510lxl0610020160.511lx10610020160.512MO610020160.513lx10610020160.52.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定用含有濃度0.25illEB的3X的瓊脂糖凝膠，將每輪篩選產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物中，取5-10yl上樣于80V，進(jìn)行電泳，30min后取出凝膠，用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Syngene10ChemiGenius2)觀察并照相。2.3.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果影響很大本實(shí)驗(yàn)最佳退火溫度為45t:;當(dāng)退火溫度在40-651:時(shí)，3%瓊脂糖凝膠電泳有目的條帶；退火溫度低于4(TC時(shí)，有大于目的條帶的片段出現(xiàn)；退火溫度高于65t:時(shí)，無(wú)任何PCR反應(yīng)產(chǎn)物。另外，模板含量和循環(huán)次數(shù)對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響也很大每輪SELEX篩選的模板含量和循環(huán)次數(shù)都各不相同。模板含量一定，循環(huán)次數(shù)過(guò)少，無(wú)目的條帶，循環(huán)次數(shù)過(guò)多，則出現(xiàn)梯狀條帶且有拖尾現(xiàn)象，結(jié)果如圖1所示；模板含量過(guò)少，適當(dāng)增加循環(huán)也可獲得目的條帶；模板含量過(guò)多反而無(wú)目的條帶。其他因素如引物濃度、dNTP濃度、Mg2+離子濃度等在擴(kuò)增過(guò)程中也有一定的影響。電泳條帶隨SELEX篩選輪數(shù)的增加逐漸變細(xì)變致密，結(jié)果如圖2所示。2.3.5磁珠分離制備次級(jí)文庫(kù)取100iil磁珠于1.5ml微量離心管中置磁力架12min，吸棄上清；拿下微量離心管，加入100ul2X洗滌緩沖液重懸磁珠；重置磁力架12min，吸棄洗滌緩沖液，加入200iil2X洗滌緩沖液，再加入200ii1生物素化的dsDNA37。C水浴15min;上磁力架12min，吸棄上清；用200X洗滌緩沖液沖洗23次；加入50y1150mMNaOH于37。C水浴15min，使dsDNA解鏈；上磁力架，含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素磁珠上并吸附于管壁，而另一條不含生物素的ssDNA則存在于上清中，分離出上清中的ssDNA并測(cè)定A值，此即為下一輪篩選的ssDNA庫(kù)。2.3.6正常人中性粒細(xì)胞的提取本實(shí)驗(yàn)材料均取自蘭州大學(xué)第一醫(yī)院健康查體人群，與所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象簽署知情同意書(shū)后，抽取空腹靜脈血2ml，并用人中性粒細(xì)胞提取液(購(gòu)自西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)從血液中提取中性粒細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。2.3.7用中性粒細(xì)胞進(jìn)行反篩為了加快篩選的速度，并有效地提高適配子的特異性，本實(shí)驗(yàn)用中性粒細(xì)胞做反篩，步驟如下(1)將磁珠分離得到的ssDNA庫(kù)99°C加熱5min進(jìn)行變性，然后立即置于0°C10min;(2)將1X10S個(gè)從血液中提取的中性粒細(xì)胞，去上清后加入上述溶液，加入選擇緩沖液400ii137。C水浴30min;(3)將混合液3000rpm離心2min，取上清，用于下一輪SELEX篩選。2.3.8ssDNA文庫(kù)與K562細(xì)胞親和力的測(cè)定1-13輪SELEX篩選的產(chǎn)物，用標(biāo)記地高辛的引物P3和標(biāo)記生物素的引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳鑒定目的條帶清楚的PCR產(chǎn)物用試劑盒純化，然后與K562細(xì)胞充分反應(yīng)并用150mMNaOH解鏈，地高辛標(biāo)記的ssDNA游離在上清中，測(cè)定ssDNA含量。按ssDNA:K562細(xì)胞=500pmo1:1X106個(gè)在400ii12X結(jié)合緩沖液中結(jié)合，離心，棄上清，加入100ii11:15000稀釋的抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶，反應(yīng)10min，離心，棄上清，用500iUlX結(jié)合緩沖液懸浮K562細(xì)胞后，離心，棄上清，重復(fù)洗滌3次，洗去未與抗地高辛抗體結(jié)合的堿性磷酸酶，以底物顯色，終止反應(yīng)后用酶聯(lián)儀于405nm測(cè)定A值(三次試驗(yàn)取平均值)。結(jié)果如圖3表示。2.4克隆、測(cè)序及結(jié)構(gòu)分析2.4.1制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)胞(1)從大腸桿菌DH5a平板上挑選單個(gè)菌落接種于含2mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37t:搖床振搖培養(yǎng)過(guò)夜；(2)次日，取0.5ml渾濁菌液轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有50mlLB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37。C搖床振搖23h，使菌液的0D6。?！?.40.5;(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，立即冰上放置lOmin;(4)04°C，4000rmp離心lOmin，使細(xì)胞沉淀，回收細(xì)胞；(5)倒出離心管中的培養(yǎng)液，將離心管倒置于一滅菌的濾紙上lmin，以盡量流盡培養(yǎng)液；(6)用冰冷的0.1M的CaCl210ml懸浮沉淀，立即放冰上保溫30min;(7)04°C，4000rmp離心lOmin，使細(xì)胞沉淀，回收細(xì)胞；(8)倒出離心管中的液體，將離心管倒置于一滅菌的濾紙上lmin，以盡量流盡殘留液體；(9)用冰預(yù)冷的0.1M的CaCl22ml懸浮細(xì)胞，制成感受態(tài)細(xì)胞；(10)迅速將懸液分裝到無(wú)菌的E卯endorf管中，每管200iU。2.4.2感受態(tài)大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化率的測(cè)定(1)將0.5iig/ill的pGEM-T質(zhì)粒1:100稀釋后待用(pGEM-T質(zhì)粒濃度稀釋為5ng/li1);(2)向上述分裝好感受態(tài)細(xì)胞的E卯endorf管加入稀釋的pGEM-T質(zhì)粒1y1，吹打混勻，置冰上30min;;(3)將Eppendorf管放到42。C水浴90s;(4)將E卯endorf管冰上放置加in;(5)加入800ill的LB液體培養(yǎng)基，37。C慢搖培養(yǎng)lh;(6)將管中的轉(zhuǎn)化反應(yīng)用培養(yǎng)液作1:10的稀釋(其中的pGEM-T質(zhì)粒濃度為2.5ng/ml)，取其中100的稀釋液加到已含有適當(dāng)Amp的LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌的玻璃涂布器將轉(zhuǎn)化菌均勻鋪在瓊脂板表面；(7)將平板置于室溫0.5h以使液體能被吸收；(8)倒置平板于37t:培養(yǎng)16h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；(9)按照下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。例如用0.lng完整的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化100ii1的感受態(tài)細(xì)胞，向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900ii1培養(yǎng)液(0.lng/lml)，讓細(xì)菌恢復(fù)一段時(shí)間(lh)。將轉(zhuǎn)化反應(yīng)用培養(yǎng)液作1:10的稀釋(0.01ng/ml)，取其中100的稀釋液來(lái)涂布(0.OOlngDNA/100y1)。如能獲得200個(gè)克隆，轉(zhuǎn)化效率是2X108cfu/ugDNA，計(jì)算方法如下200cfu/0.00lng=2X105cfu/ng=2X108cfu/ugDNA轉(zhuǎn)化效率lXl(fcfu/iigDNA可滿足普通的亞克隆實(shí)驗(yàn)；1X107cfu/iigDNA用于作更復(fù)雜的亞克隆。結(jié)果如圖4顯示。2.4.3篩選產(chǎn)物擴(kuò)增和膠回收純化經(jīng)11輪篩選得到的ssDNA，用引物1和引物5經(jīng)PCR擴(kuò)增成dsDNA，再用膠回收試劑盒回收DNA，按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。2.4.4PCR純化產(chǎn)物的連接反應(yīng)(l)DNA分子摩爾質(zhì)量計(jì)算方法DNA分子摩爾數(shù)(pmol)=DNA分子質(zhì)量(ng)X1000/(660XDNA分子的bp數(shù))(2)PCR膠回收產(chǎn)物通過(guò)3%瓊脂糖凝膠電泳估量約為10ng/iU。(3)按i:3、i:5、i:8比例在微量離心管中加入以下成分1:31:51:82x連接緩沖液5^15nl5^1pGEM-T載體(50ng/ul)11W1nl目的DNA片段0.9pl1.5nl2.4plT4DNA連接酶1nl1pl1pi滅菌水2.1nl1.5nl0.6pi將上述物質(zhì)混合均勻，4t:放置過(guò)夜。2.4.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及Amp和a互補(bǔ)篩選(1)向上述分裝好感受態(tài)細(xì)胞的E卯endorf管加入連接反應(yīng)液10y1，吹打混勻，置冰上30min;(2)將Eppendorf管放到42。C水浴90s;(3)將E卯endorf管冰上放置加in;(4)向各管加入800ia的LB液體培養(yǎng)基，37t:慢搖培養(yǎng)lh;(5)將以上各管取轉(zhuǎn)化反應(yīng)用培養(yǎng)液取100iil，分別涂布到IPTG/X-gal/Amp的LB平板上；(6)將平板置于室溫0.5h以使液體能被吸收；(7)倒置平板于37"培養(yǎng)16h;(8)取出培養(yǎng)皿在4t:放置6h，使藍(lán)色充分顯現(xiàn)，觀察結(jié)果如圖5。2.4.6挑選單克隆菌液測(cè)序次日取出培養(yǎng)皿，隨機(jī)挑選24個(gè)菌落接種于3ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖菌過(guò)夜，分別吸取轉(zhuǎn)化菌液lml加入離心管中，每管加入30ii1滅菌甘油，顛倒混勻、封膜后送上海生工生物技術(shù)有限公司采用載體的通用測(cè)序引物(T7引物)鑒定并測(cè)序。剩余菌液加入100iU滅菌甘油，顛倒混勻后置-S(TC冰箱凍存。2.4.7適配子一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析用DNAMAN軟件對(duì)隨機(jī)區(qū)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)無(wú)同源序列，但可分為6個(gè)家族(family):家族1含有保守序列ACCAG，家族2含有保守序列ACCGG，家族3含有保守序列CCCGC，家族4含有保守序列家族5含有保守序列AAGTT。家族6共10個(gè)，無(wú)保守序列。結(jié)果如下130183]Family10184]1N18—0185]2N18—0186]9N18—0187]Family20188]6N18—0189]7N18—0190]17N18—0191]Family30192]10訓(xùn)-0193]16訓(xùn)-0194]22訓(xùn)-0195]Family40196]5訓(xùn)-0197]11訓(xùn)-0198]24訓(xùn)-0199]Family50200]12訓(xùn)-0201]19訓(xùn)-0202]Family60203]3訓(xùn)-0204]4訓(xùn)-0205]8訓(xùn)-0206]13訓(xùn)-0207]14訓(xùn)-0208]15訓(xùn)-0209]18訓(xùn)-0210]20訓(xùn)-0211]21訓(xùn)-0212]23訓(xùn)-0213]對(duì)所有序CACCACGAGGAACTTCCCGCAAACCAGCAGATGTGACACGCATAGGTCCT-ACCAGATAGTAAGTGCAATCTATACCAGCTTATTCAATTGGC—N18-訓(xùn)ATCGTTTTTAAGAGAATGAGAGGTGGGGCGCGTCCACCAGGCCTAAGTCGG—N18CGCGGCGGAATCCCCCGGAGCACCGGAACGGGCGGGAATCTGGCCACTGCTCG-TAGGAGTGGGACCGGTACAAAAAAATATAACCCACTCAATATAATGCCTCAT-—N18.訓(xùn)N18-AGTTCGGCTCAGAAGGGGTGCTAGCTCCGGGTGTAGCCGGACGCGTGACCGT--GGCAAGGAAATTCACTCATGGAGTATGTGGAAGTTAAGACGGTTCCGGGGCG--訓(xùn)-訓(xùn)-訓(xùn)-訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)-訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)—訓(xùn)—N18適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由莖環(huán)和凸環(huán)結(jié)構(gòu)組成的，分為以下5類A類隨機(jī)序列與3'端形成幾個(gè)小莖環(huán)，樹(shù)杈樣分布，基底部與5'端形成的大凸環(huán)相連；B類5'端與隨機(jī)序列形成幾個(gè)小莖環(huán)，分兩支與3'端形成的大凸環(huán)相連；C類5'端、3'端和隨機(jī)序列分別形成一個(gè)小莖環(huán)，各自連接在一個(gè)大凸環(huán)上；D類5'端、3'端和隨機(jī)序列形成4個(gè)小莖環(huán)，各自連接在一個(gè)大凸環(huán)上；E類5'端、3'端和隨機(jī)序列形成多個(gè)小莖環(huán)復(fù)雜排列，無(wú)凸環(huán)結(jié)構(gòu)。具體的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖如圖6。2.524個(gè)克隆適配子與靶細(xì)胞親和力的測(cè)定取-S(TC冰箱凍存的測(cè)序之轉(zhuǎn)化菌，經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR擴(kuò)增、純化后測(cè)定其與慢性14粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的親和力。2.5.1各克隆菌質(zhì)粒抽提用質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。2.5.2PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物純化將上述質(zhì)粒抽提產(chǎn)物用標(biāo)記熒光素和生物素的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物凝膠電泳觀察看是否有明亮清晰的目的條帶，若條帶明亮清晰，則進(jìn)一步純化PCR產(chǎn)物，方法同2.2.4。PCR反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.5.3熒光強(qiáng)度-ssDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將標(biāo)準(zhǔn)品(5，-FITC-88nt-3')用選擇緩沖液稀釋為800ng/ml、666.7ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml9管不同濃度的溶液，測(cè)定各管的熒光強(qiáng)度(測(cè)三次取平均值)，繪出熒光強(qiáng)度-ssDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.5.4熒光素標(biāo)記的ssDNA的制備2.4.2中PCR產(chǎn)物一條鏈5'端含熒光素，另一條鏈5'端含生物素。利用生物素_鏈霉親和素磁珠將dsDNA解鏈為ssDNA。含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素磁珠上并吸附于管壁，而另一條帶熒光素的ssDNA存在于上清中，分離出上清中ssDNA并用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得其熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的ssDNA的含量，此即測(cè)定結(jié)合率的純適配子庫(kù)。2.5.5各克隆適配子與靶細(xì)胞和中性粒細(xì)胞結(jié)合率的測(cè)定按熒光素標(biāo)記的ssDNA:慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞=50pmol:1Xl(f個(gè)慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞的比例進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，將二者在選擇緩沖液中結(jié)合30min，更換離心管，離心，吸取上清測(cè)定熒光強(qiáng)度；用選擇緩沖液重懸慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞后離心，吸取上清，測(cè)定熒光強(qiáng)度，重復(fù)洗滌2次，洗去未與慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞結(jié)合的熒光素-ssDNA。根據(jù)各管洗滌上清的熒光強(qiáng)度從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得其對(duì)應(yīng)的濃度，乘體積得到ssDNA的量，再將各管的量相加，即為未結(jié)合到慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞上的ssDNA的總量。將投入總量減去未結(jié)合的量即為結(jié)合到慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞上的ssDNA的量，用結(jié)合的量除以總量，計(jì)算出結(jié)合率；用同樣的方法測(cè)定其與人正常中性粒細(xì)胞的集合率。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從上表中看出，各適配子中與靶細(xì)胞結(jié)合率比較高的是5、10、21、22、24號(hào)適配子，其結(jié)合率分別為40.6%、45.2%、40.8%、42.2%、41.6%。2.6各克隆適配子特異性通過(guò)上表中各適配子與慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的結(jié)合率測(cè)定顯示結(jié)合率高的5、10、21、22、24號(hào)適配子都有較高的特異性，與正常人血液中提取的中性粒細(xì)胞的結(jié)合率明顯降低，分別僅為2.9%、2.8%、3.0%、2.5%、2.7%，由此證明此5種適配子具有較高的特異性。適配子一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)序結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>〈120〉檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法〈130〉檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法〈160>5〈170>PatentInversion3.5<210>1〈211〉88〈212>DNA〈213〉白血病細(xì)胞〈400>1ataccagcttattcaattccgcccggtcagcatctcttcccaacctattttcactgtgtg60gctccctatcagategteagtgcaatct88〈210>2〈211>88〈212>DNA〈213〉白血病細(xì)胞〈400>2ateccagcttattcaattcccgctgcttcggctccccactccgcactgtgttactgcctt60agtctecttgagategteagtgc朋tct88〈210>3<211>88〈212>DNA〈213〉白血病細(xì)胞〈400>3￡lt￡lCC3gCtt3ttC朋ttC3tCgttttt朋g￡lg￡l￡ltgag￡lggtggggCgCgtCC3CC3gg60cct朋gtcgg3gategte3gtgcaatct88〈210>4〈211〉88〈212>DNA〈213〉白血病細(xì)胞〈400>4agattgcacttectatctgagcttcccccgcgagaccgttagcgacgtcaattggagtct603ttcacc3ga朋ttg朋teagctggtet88〈210>5〈211>88〈212>DNA〈213〉白血病細(xì)胞〈400>5agattgcacttectetctegttcggctcagaaggggtgctagctccgggtgtegccggac60gcgtgaccgt朋ttg朋teagctggtet88權(quán)利要求一種檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈DNA適配子，其特征在于該適配子具有序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所述的核苷酸序列的任意一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈DNA適配子，其特征在于所述SEQIDNo.1所述的核苷酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述SEQIDNo.2所述的核苷酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述SEQIDNo.3所述的核苷酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述SEQIDNo.4所述的核苷酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>所述SEQIDNo.5所述的核苷酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.—種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈DNA適配子的制備方法，其特征在于該方法按照下列步驟進(jìn)行①將慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37°〇、飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天傳代一次；②構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N52-AGATAGTAAGTGCAATCT-3，，其中N代表堿基A、G、C、T中的任意一個(gè)，構(gòu)建5條引物，分別為Pl5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'P25'-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3'P35，-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3，P45，-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3，P55，-AGATTGCACTTACTATCT-3，③將10yg的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)加到400iil2X結(jié)合緩沖液中，于99。C變性5min，然后立即置于0。C冰上10min;加入3%BSA13.5yl降低背景；再將1X106個(gè)人慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞加到上述溶液中混勻，37。C水浴30min;3000rpm離心5min，去上清，加入400ii1結(jié)合緩沖液混勻再3000rpm離心5min，反復(fù)6次；最后所得沉淀加入100y1ddH20，IO(TC加熱10min;10000rpm離心5min，取上清，經(jīng)酚氯仿抽提，乙醇沉淀，將ssDNA溶解于20iUTE緩沖液中;④將上述篩選過(guò)程得到的ssDNA，用上游引物Pl和下游生物素標(biāo)記的引物P4經(jīng)PCR擴(kuò)增成一端帶生物素的dsDNA，PCR反應(yīng)體系為:模板mii1，10XPCRButter5iU，MgCl23yl，dNTPs5iU，T叫DNA多聚酶2U，上游引物、下游5，端生物素標(biāo)記的引物各25pmol，加去離子水至50ii1;PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性2min，然后進(jìn)行n個(gè)循環(huán)94°C的變性30s，45°C退火lmin，72t:延伸30s，最后72。C延伸5min;在開(kāi)始幾輪篩選過(guò)程中，ssDNA文庫(kù)和細(xì)胞量投放很多；在隨后的幾輪篩選中，由于高特異性的適配子已經(jīng)富集，為了提高篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性，結(jié)合時(shí)間由30min減少到20min;模板量也由2y1減少到0.5yl;然而PCR循環(huán)數(shù)卻由原來(lái)的11個(gè)循環(huán)增加到16個(gè)循環(huán)；⑤PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定及純化用含有濃度O.25iUEB的3%的瓊脂糖凝膠，將每輪篩選產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物中，取5-10iU上樣于80V，進(jìn)行電泳，30min后取出凝膠，用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并照相，PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化；⑥磁珠分離制備次級(jí)文庫(kù)取100ii1磁珠于1.5ml微量離心管中置磁力架12min，吸棄上清；拿下微量離心管，加入100ul2X洗滌緩沖液重懸磁珠；重置磁力架12min，吸棄洗滌緩沖液，加入200iil2X洗滌緩沖液，再加入200ii1生物素化的dsDNA37。C水浴15min;上磁力架12min，吸棄上清；用200ylIX洗滌緩沖液沖洗23次；加入50y1150mMNaOH于37。C水浴15min，使dsDNA解鏈；上磁力架，含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素磁珠上并吸附于管壁，而另一條不含生物素的ssDNA則存在于上清中，分離出上清中的ssDNA并測(cè)定A值，此即為下一輪篩選的ssDNA庫(kù)；⑦中性粒細(xì)胞進(jìn)行反篩用中性粒細(xì)胞提取液從正常查體人群血液中提取中性粒細(xì)胞，將磁珠分離得到的ssDNA庫(kù)99t:加熱5min進(jìn)行變性，然后立即置于0t:10min;將1X106個(gè)中性粒細(xì)胞上清后加入上述溶液，加入選擇緩沖液400ii137t:水浴30min;將混合液3000rpm離心2min，取上清，用于下一輪SELEX篩選；⑧適配子克隆測(cè)序及一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析重復(fù)篩選13輪后，將篩選得到的適配子回收純化后連接pGEM-T質(zhì)粒載體，經(jīng)藍(lán)白篩選后，隨機(jī)挑選24個(gè)克隆子進(jìn)行序列測(cè)定；并用DNAMAN軟件對(duì)適配子序列進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；⑨克隆適配子與靶細(xì)胞親和力的測(cè)定將標(biāo)準(zhǔn)品5'-FITC-88nt-3'用選擇緩沖液稀釋為不同濃度的溶液，測(cè)定各管的熒光強(qiáng)度，繪出熒光強(qiáng)度-ssDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；取測(cè)序之轉(zhuǎn)化菌，經(jīng)質(zhì)粒抽提試劑盒抽提后，用標(biāo)記熒光素和生物素的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再用生物素-鏈霉親和素磁珠分離，得到標(biāo)記有熒光素的單鏈DNA，測(cè)定其熒光強(qiáng)度；按熒光素標(biāo)記的ssDNA:慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞二50pmol:1X106個(gè)慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞的比例進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，將二者在選擇緩沖液中結(jié)合30min，更換離心管，離心，吸取上清測(cè)定熒光強(qiáng)度；用選擇緩沖液重懸慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞后離心，吸取上清，測(cè)定熒光強(qiáng)度，重復(fù)洗滌2次，洗去未與慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞結(jié)合的熒光素-ssDNA;根據(jù)各管洗滌上清的熒光強(qiáng)度從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得其對(duì)應(yīng)的濃度，乘體積得到ssDNA的量，再將各管的量相加，即為未結(jié)合到慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞上的ssDNA的總量；將投入總量減去未結(jié)合的量即為結(jié)合到慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞上的ssDNA的量，用結(jié)合的量除以總量，計(jì)算出結(jié)合率；用同樣的方法測(cè)定適配子與人正常中性粒細(xì)胞的結(jié)合率；與慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞結(jié)合率較高，而與人正常中性粒細(xì)胞結(jié)合率低的就是能與慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞特異性結(jié)合的DNA適配子。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法，體外合成長(zhǎng)度為88個(gè)堿基的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)，采用生物素-鏈霉親和素磁珠法制備次級(jí)文庫(kù)，以正常人中性粒細(xì)胞為反篩細(xì)胞，利用SELEX技術(shù)篩選出與慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞特異結(jié)合的適配子。將篩選得到的適配子回收純化后連接pGEM-T質(zhì)粒載體，經(jīng)藍(lán)白篩選后，隨機(jī)挑選24個(gè)克隆子進(jìn)行序列測(cè)定。采用熒光標(biāo)記引物法檢測(cè)親和力，并用DNAMAN軟件對(duì)適配子序列進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)無(wú)同源序列，但可分為6個(gè)家族(family)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明適配子形成的莖環(huán)、凸環(huán)結(jié)構(gòu)可能是與K562細(xì)胞特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。24個(gè)克隆適配子中，第5、10、21、22、24號(hào)適配子與慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的結(jié)合率較高，分別為40.6％、45.2％、40.8％、42.2％、41.6％。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101748210SQ20091011758公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2009年11月11日優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日發(fā)明者劉玲玲,姚海燕,查成喜,韓躍武申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)