專利名稱：：一種染色體22q11.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種染色體22qll.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：22qll微缺失人群發(fā)生率為約1/4000，是最常見的基因組異常綜合征，臨床表現(xiàn)以先天性心臟缺陷(CHD)為最常見，其他臨床表現(xiàn)有面部畸形、免疫缺陷、高鈣血癥、骨骼異常、泌尿系畸形、輕度學(xué)習(xí)障礙等。而CHD以主動(dòng)脈弓中斷、法樂(lè)氏四聯(lián)征、室間隔缺損、永存動(dòng)脈干等最為常見。對(duì)CHD進(jìn)行22qir微缺失分析不僅可對(duì)CHD的分子機(jī)理進(jìn)行探討，對(duì)臨床診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷都有幫助。雖然國(guó)外對(duì)22qll孩i缺失和先心病關(guān)系的探索已歷十余年，取得了一些*，如已將缺失片段定位于染色體22qll區(qū)段的1.5-3Mb區(qū)間，對(duì)其間的一些基因進(jìn)行了定位，制備了一些區(qū)域探針和篩選了一些STRP標(biāo)記用于遺傳學(xué)診斷，不幸的是對(duì)部分染色體拷貝數(shù)變化比較困難，包括微缺失、微重復(fù)等。對(duì)于染色體微缺失、微重復(fù)的檢測(cè)，目前主要采用三種技術(shù)(1)染色體熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)。這是利用克隆獲得目標(biāo)染色體位點(diǎn)DM序列制備探針，在焚光標(biāo)記的條件下，與患者體細(xì)胞染色體雜交，確定目標(biāo)染色體位點(diǎn)是否存在檢測(cè)片段的缺失。FISH技術(shù)具有分子雜交的特異性和敏感性，結(jié)果直觀，染色體微缺失分析中，一直為多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用。但FISH檢測(cè)成本較高，操作繁雜，難以同時(shí)分析多個(gè)染色體區(qū)帶。FISH技術(shù)受到探針雜交片段的限制，分析染色體位點(diǎn)內(nèi)的微小缺失容易出現(xiàn)漏診。(2)短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性(shorttandemrepeatpolymorphsm,STRP)分析。這一技術(shù)利用人類基因組中廣泛存在的微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，在目標(biāo)染色體區(qū)帶內(nèi)選擇多條微衛(wèi)星DNA靶序列。結(jié)合患者及其親本基因組DM的分析，確定目標(biāo)染色體位點(diǎn)是否存在靶序列的雜合型缺失。STRP分析方法簡(jiǎn)便，可以確定缺失染色體的親本起源。但判定結(jié)果通常依賴于雜合條帶，同時(shí)需結(jié)合雙親基因型綜合分析。另一方面，F(xiàn)ISH技術(shù)和STRP對(duì)于分析片段難以定量，因此對(duì)于目標(biāo)染色體區(qū)帶的DNA微復(fù)制也難以檢出。(3)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MultiplexLigation-dependentProbeAmplification,MLPA)，由荷蘭的Dr.Schouten所帶領(lǐng)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)于2002年發(fā)表，這是利用針對(duì)染色體不同區(qū)域的上下游對(duì)同一條DNA單鏈設(shè)計(jì)的多對(duì)帶冗余共同序列的探針，用連接酶連接這些上下游探針以采集這些探針結(jié)合區(qū)域的DNA模板的數(shù)量信息，其探針數(shù)量為模板數(shù)量。這些多個(gè)在不同結(jié)合區(qū)域所生成的探針可由同一對(duì)引物擴(kuò)增，其定量較為準(zhǔn)確，且于單一反應(yīng)管內(nèi)最多可同時(shí)檢測(cè)40個(gè)不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。但作為一種半定量的方法，其假陽(yáng)性率不可避免。并且其檢測(cè)成本較高，難以大規(guī)模推廣。以上各種檢驗(yàn)染色體拷貝數(shù)變化的方法共同的缺點(diǎn)是結(jié)果的不確定性。FISH技術(shù)受到探針雜交片段的限制，分析染色體位點(diǎn)內(nèi)的微小缺失容易出現(xiàn)漏診，STRP分析的判定結(jié)果通常依賴于雜合條帶，且受到分析靶序列雜合度和雙親樣本分析結(jié)果的影響，其陽(yáng)性率不能完全滿意，而MLPA作為一種半定量的方法，其假陽(yáng)性率不可避免。這些方法的不確定性已成為制約大規(guī)模推廣臨床診斷的重要障礙，因此，開發(fā)一種新的、能大規(guī)模精確而又經(jīng)濟(jì)的確定染色體拷貝數(shù)變化的方法并制定相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)就變得非常重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種染色體22q11.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種染色體22qll.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法，該方法包括下列步驟a.抽提基因組DNA;b.多重?zé)晒舛縋CR復(fù)合擴(kuò)增復(fù)合擴(kuò)增體系中包括了5個(gè)STR標(biāo)記D22S873,22D-5畫1,22D丄5,22D-4—4，22D—4—3和一個(gè)內(nèi)參G6PDH;進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c.取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性使雙鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可為毛細(xì)管電泳分析的單鏈，采用毛細(xì)管電泳對(duì)上述變性產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物長(zhǎng)度和產(chǎn)物量分析；d.結(jié)果分析1)根據(jù)下列公式計(jì)算量比值被檢測(cè)者STR位點(diǎn)峰面積/其內(nèi)參的峰面積量比值=__正常對(duì)照STR位點(diǎn)峰面積/其內(nèi)參的峰面積量比值0.7-1.3,為正常二倍體個(gè)體；量比值小于0.7，為存在微缺失的個(gè)體；量比值大于1.3，為存在微重復(fù)的個(gè)體；和/或2)根據(jù)峰的位置和數(shù)量進(jìn)行判斷，微缺失為在相應(yīng)位置缺少峰；微重復(fù)有三種情形相應(yīng)位置出現(xiàn)峰高等于或接近1:1:1的三個(gè)峰、出現(xiàn)峰高等于或接近2:1的二個(gè)峰、出現(xiàn)峰高等于或接近l:2的二個(gè)峰；其中D22S873的上游引物序列為SEQIDNO.1,下游引物序列為SEQIDNO.2;22D_5—1的上游引物序列為SEQIDNO.3,下游引物序列為SEQIDNO.4;22D—4-5的上游引物序列為SEQIDNO.5,下游引物序列為SEQIDNO.6;22D-4—4的上游引物序列為SEQIDN0.7，下游引物序列為SEQIDNO.8;22D丄3的上游引物序列為SEQIDNO.9,下游引物序列為SEQIDNO.10;G6PDH的上游引物序列為SEQIDNO.11，下游引物序列為SEQIDNO.12。所述的測(cè)定方法，該方法中PCR復(fù)合擴(kuò)增體系為25pl體系包括35-80ng基因組DNA2.5ju110xSTRbuffer(promega)0.1D22S873引物0.2juM22D—5—1引物0.4juM22D丄5引物1.122D—4—4引物0.21juM22D-4—3引物0.085nMG6PDH引物1UTag酶(promega)。本發(fā)明的有益效果對(duì)22qll.2,我們建立了一種竟?fàn)幮远嘀胤俟舛慷檀?lián)重復(fù)PCR檢測(cè)技術(shù)(CFMSA)。通過(guò)短串聯(lián)重復(fù)PCR標(biāo)記物，CFMSA可以在同一試管中同時(shí)檢測(cè)該染色體的多態(tài)性和基因數(shù)量，也因此增加了敏感性。在IIO個(gè)正常對(duì)照的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了高度多態(tài)性和基因數(shù)量的可靠性。476個(gè)符合美國(guó)心臟學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)的先天性心臟病患者中，正確鑒別出22qll.2區(qū)的17個(gè)微缺失和1個(gè)微重復(fù)。CFMSA有望取代目前對(duì)22qll.2區(qū)常規(guī)的大范圍篩查技術(shù)，成為廉價(jià)而有效的篩查22qll.2區(qū)微缺失和微重復(fù)的新方法。1、突破了傳統(tǒng)微缺失和微重復(fù)的篩查工具只能提供定量信息和多態(tài)性信息中的其中一種的限制，CFMSA同時(shí)提供這兩個(gè)互為印證的信息，極大的提高了傳統(tǒng)篩查工具的可靠性，將篩查結(jié)果的無(wú)效率從20%左右降低為0.02%以下，降低了IOOO倍。2、CFMSA不需要傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)，探針雜交技術(shù)，將整套流程的時(shí)間從數(shù)個(gè)工作曰降低為數(shù)個(gè)小時(shí)，并極大降低了工作量，每個(gè)FISH樣品所需要的人工為3個(gè)，該工具僅為0.01個(gè)。3、整個(gè)技術(shù)流程的大部分可以自動(dòng)化操作，利于大規(guī)模臨床使用。且費(fèi)用低廉，成本從l千多元降低為數(shù)十元。國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷由于成本高，規(guī)模小長(zhǎng)期處于虧損狀態(tài)，該工具有望改變這一情況。圖1是實(shí)施例1樣本擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3130基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析圖。圖2是實(shí)施例2樣本擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3130基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析圖。圖中標(biāo)*為先心病人樣本。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。注本發(fā)明實(shí)施例涉及的生物工程技術(shù)未作詳細(xì)說(shuō)明的均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。用于產(chǎn)前診斷的基因組DNA可采用胎兒羊水進(jìn)行抽提基因組DM。實(shí)施例1操作步驟1、抽提基因組DM:樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛技術(shù)公司)；先天性心臟病患者及正常人血液；按照試劑盒要求分別抽提基因組DNA。2、多重?zé)晒舛縋CR復(fù)合擴(kuò)增復(fù)合擴(kuò)增體系中包括了5個(gè)STR標(biāo)記D22S873,22D—5—1，22D—4—5，22D—4—4,22D—4—3和一個(gè)內(nèi)參G6PDH;引物序列見下表(在每個(gè)STR位點(diǎn)的前向引物F上加FAM熒光標(biāo)記)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>RGATGATTTATCTGCCCTGTCACCG6PDHFCAGCCCTCTGTCCGATTACTAC9246459-9246842RGCCAGCTTAGAGATCAGCTCCTpcr擴(kuò)增25u1體系包括35-80ng基因組DNA2.5/a110xSTRbuffer(緩沖液)(promega)0.1mMd22s873引物0.2jjM22D丄1引物0.4juM22D一4一5引物1.1pM22D-4—4引物0.21pM22D—4一3引物0.085ijMG6PDH引物1UTag酶(promega);PCR反應(yīng)條件95'C2min,94。Clmin60。Clmin-lOcycle75'C1.5min,90。Clmin-60。Clmin."cycle70°C1.5minj60。C30min3、取2|u1PCR產(chǎn)物，與7.8jj1HiDi甲酰胺(abi公司)，0.2y1Rox500標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記(ABI公司)相混合，95。C變性5分鐘，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由雙鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可為毛細(xì)管電泳分析的單鏈。4、用abi3130基因分析儀對(duì)上述變性產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，得出str位點(diǎn)及其內(nèi)參的峰面積(見表l)及圖1:5、結(jié)果分析1)根據(jù)量比值進(jìn)行分析表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(18419+17156+16808+15507+37654)/92059量比值==0.601(27852+20354+18870+18110+45668)/6863結(jié)果此先心病人存在22qll.2微缺失。2)根據(jù)圖1中峰的位置和數(shù)量進(jìn)行判斷說(shuō)明由于染色體的DNA來(lái)自父母，在正常情況下，每對(duì)引物PCR擴(kuò)增片斷的變性產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析顯示為相應(yīng)位置出現(xiàn)峰高相同或接近的兩個(gè)峰(峰高比例可在0.7-1.3:l之間)，即兩個(gè)未重疊峰；如果這兩個(gè)峰重疊，則該位置出現(xiàn)峰高約為未重疊峰峰高2倍的單個(gè)重疊峰(重疊峰與未重疊峰的峰高比例可在1.6~2.4:1之間)圖1中引物D22S873對(duì)應(yīng)位置的峰正常對(duì)照為峰高約為先心病人峰高2倍的一個(gè)峰，表明形成重疊，而先心病人只有一個(gè)未重疊的峰，缺少另一個(gè)峰高相近的峰；引物22D—5—1、引物22D-4—5、引物22D—4-4、引物22D-4—3對(duì)應(yīng)位置的峰正常人分別在相應(yīng)位置出現(xiàn)兩個(gè)未重疊的峰，而先心病人在相應(yīng)位置只有一個(gè)未重疊的峰。結(jié)論此先心病人存在22q11.2微缺失?？梢詥为?dú)采用量比值的方法或者采用峰的位置和數(shù)量的方法判斷是否存在微缺失，最好是兩種方法結(jié)合采用，以進(jìn)一步提高分析的準(zhǔn)確性。實(shí)施例2:操作步驟1、抽提基因組DNA:樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(上海賽百盛技術(shù)公司)；另一先天性心臟病患者及正常人血液；按照試劑盒要求分別抽提基因組DNA。2、多重?zé)晒舛縋CR復(fù)合擴(kuò)增復(fù)合擴(kuò)增體系中包括了5個(gè)STR標(biāo)記D22S873，22D—5-1,22D—4—5，22D一4一4，22D—4—3和一個(gè)內(nèi)參G6PDH;引物序列見下表(在每個(gè)STR位點(diǎn)的前向引物F上加FAM熒光標(biāo)記)STR標(biāo)記引物序列染色體位置重復(fù)序列D22S873FAGTCTGTGTGACAGAGTGACAGCRGCTCCTCTGAGCACGTTTCT22D—5一1FGAGCAGCTTTTGTGGGTTTTRGACTCTGAAAGGTAGAGGTGAAGG22D—4—5FTGAAATTTGTATGTGAGCTGATTGRGAGCGACACTGTGAGACACCT22D丄4FGGCTTGGACTGAGTGTCTGAGRGTGAGACCCTATTTCAAAAACGM22D一4一3FTCCTGCTCCATTCCAGGTCRGATGATTTATCTGCCCTGTCACC18320444-1832061617860735-1786094117356116-1735637618028855-1802914817985302-17985630MATTA丌CTTCTTTC<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>PCR擴(kuò)增25ml體系包括35-80ng基因組DNA2.5ja110xSTRbuffer(promega)0.1mMd22s873引物0.2jjM22d—5—1引物0.4jnM22D—4—5引物1.1iuM22D—4_4引物0.21uM22D-4—3引物0.085iuMG6PDH引物1UTag酶(promega);PCR反應(yīng)條件:95。C2min,94。Clmin、60。Clmin>10cycle75。C1.5min,90。Clmin-60'Clmin，14cycle70。C1.5min'60°C30min3、取2julPCR產(chǎn)物，與7.8nlHiDi甲酰胺(ABI公司)，0.2jj1Rox500標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記(ABI公司)相混合，95。C變性5分鐘，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由雙鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可為毛細(xì)管電泳分析的單鏈。4、用ABI3130基因分析儀對(duì)上述變性產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，得出STR位點(diǎn)及其內(nèi)參的峰面積(見表2)及圖2:5、結(jié)果分析1)根據(jù)量比值進(jìn)行分析表2D22S873(峰面積)22D—5-1(峰面積)22D丄5(峰面積)22丄4(峰面積)22D丄3(峰面積)G6PDH(峰面積)先心病人4934850186303424527812483685514正常人278522035418870181104566868631(49348+50186+30342+45278+124836)/85514量比值=-(27852+20354+1887Q+1S110+4566S)結(jié)果此先心病人存在22qll.2微重復(fù)。2)根據(jù)圖2中峰的位置和數(shù)量進(jìn)行判斷:10引物D22S873對(duì)應(yīng)位置的峰正常對(duì)照為峰高約為先心病人未重疊峰的峰高2倍的一個(gè)峰，表明形成重疊，而先心病人有3個(gè)峰高相近的未重疊峰，多出一個(gè)峰；引物22D-5—1、引物22D一4-5、引物22D—4—4對(duì)應(yīng)位置的峰正常人分別在相應(yīng)位置出現(xiàn)2個(gè)未重疊的峰，而先心病人在相應(yīng)位置出現(xiàn)2個(gè)峰，但其中一個(gè)峰的峰高約為另一個(gè)峰的峰高2倍，表明此峰是重疊峰，即多出一個(gè)峰。引物22D-(3對(duì)應(yīng)位置的峰正常人在相應(yīng)位置出現(xiàn)兩個(gè)未重疊的峰，而先心病人在相應(yīng)位置出現(xiàn)3個(gè)未重疊峰，多出一個(gè)峰。結(jié)論此先心病人存在22qlL2」微重復(fù)。可以單獨(dú)采用量比值的方法或者采用峰的位置和數(shù)量的方法判斷是否存在微重復(fù)，最好是兩種方法結(jié)合采用，以進(jìn)一步提高分析的準(zhǔn)確性。<110>南京市婦幼{呆健院〈120〉一種染色體22q11.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法<160>12<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)記D22S873上游引物<400>1agtctgtgtgacagagtgacage23<210>2<211>20<212>腿<213>人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)記D22S873下游引物<400>2gctcctctgagcacgtUct20<210>3<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉STR標(biāo)記22D—5-l上游引物<400>3gagcagcttttgtgggtut20<210>4<211〉24<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)記22D—5-l下游引物<400〉4gactctgaaaggtagaggtgaagg24<210>5<211>24<212>腿<213>人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)i己22D—4-5上游引物<400>5tgaaatttgtatgtgagctgattg24<210>6<211>21<212>艦<213>人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)i己22D-4-5下游引物<400>6gagcgacactgtgagacacct21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)記22D-4-4上游引物<400>7ggcttggactgagtgtctgag21<210>8<211>24<212>腿<213〉人工序列<220〉〈223〉STR標(biāo)記22D-4-4下游引物<400>8gtgagaccctatttcaaaaacgaa24<210>9<211>19<212>DM<213〉人工序列<220〉〈223〉STR標(biāo)記22D-4-3上游引物<400>9tcctgctccattccaggtc19<210>10<211>24<212>難<213>人工序列<220>〈223〉STR標(biāo)記22D—4-3下游引物<400>10gatgatttatctgccctgtcacc24<210〉11<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉G6PDH上游引物<400〉11cagccctctgtccgattactac22<210〉12<211>22<212>廳<213>人工序列<220>〈223〉G6PDH上游引物<400>12gccagcttagagatcagctcct2權(quán)利要求1、一種染色體22q11.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法，其特征在于該方法包括下列步驟a.抽提基因組DNA；b.多重?zé)晒舛縋CR復(fù)合擴(kuò)增復(fù)合擴(kuò)增體系中包括了5個(gè)STR標(biāo)記D22S873，22D_5_1，22D_4_5，22D_4_4，22D_4_3和一個(gè)內(nèi)參G6PDH；進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c.取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性使雙鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可為毛細(xì)管電泳分析的單鏈，采用毛細(xì)管電泳對(duì)上述變性產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物長(zhǎng)度和產(chǎn)物量分析；d.結(jié)果分析1)根據(jù)下列公式計(jì)算量比值量比值0.7～1.3為正常二倍體個(gè)體；量比值小于0.7為存在微缺失的個(gè)體；量比值大于1.3為存在微重復(fù)的個(gè)體；和/或2)根據(jù)峰的位置和數(shù)量進(jìn)行判斷，微缺失為在相應(yīng)位置缺少峰；微重復(fù)有三種情形相應(yīng)位置出現(xiàn)峰高等于或接近1∶1∶1的三個(gè)峰、出現(xiàn)峰高等于或接近2∶1的二個(gè)峰、出現(xiàn)峰高等于或接近1∶2的二個(gè)峰；其中D22S873的上游引物序列為SEQIDNO.1，下游引物序列為SEQIDNO.2；22D_5_1的上游引物序列為SEQIDNO.3，下游引物序列為SEQIDNO.4；22D_4_5的上游引物序列為SEQIDNO.5，下游引物序列為SEQIDNO.6；22D_4_4的上游引物序列為SEQIDNO.7，下游引物序列為SEQIDNO.8；22D_4_3的上游引物序列為SEQIDNO.9，下游引物序列為SEQIDNO.10；G6PDH的上游引物序列為SEQIDNO.11，下游引物序列為SEQIDNO.12。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于該方法中PCR復(fù)合擴(kuò)增體系為25(jl體系包括35-80ng基因組DNA`2.5jj110xstr緩沖液0.1juMD22S873引物0.2juM22D-5—1引物0.4juM22D—4-5引物1.1|uM22D—4—4引物0.21jaM22D—4一3引物0.085uMG6PDH引物1UTag酶。全文摘要本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開了一種染色體22q11.2區(qū)微缺失、微重復(fù)的測(cè)定方法。該方法的步驟包括抽提基因組DNA；進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR復(fù)合擴(kuò)增，復(fù)合擴(kuò)增體系中包括了5個(gè)STR標(biāo)記D22S873，22D_5_1，22D_4_5，2D_4_4，22D_4_3和一個(gè)內(nèi)參G6PDH；取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性使雙鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可為毛細(xì)管電泳分析的單鏈，采用毛細(xì)管電泳對(duì)上述變性產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物長(zhǎng)度和產(chǎn)物量分析；采用量比值分析的方法和/或采用峰的位置及數(shù)量分析的方法判斷是否為正常、微缺失或微重復(fù)。該方法可提高檢測(cè)的可靠性，縮短檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)成本，便于臨床大規(guī)模使用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101555528SQ20091011894公開日2009年10月14日申請(qǐng)日期2009年3月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者龍易,許爭(zhēng)峰申請(qǐng)人:南京市婦幼保健院