專利名稱：Pcr反應(yīng)中的非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及聚合酶鏈反應(yīng)體系中內(nèi)對(duì)照分子的定量方法和內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建方法、以及基于其得到的量和/或內(nèi)對(duì)照分子的核酸擴(kuò)增方法和相應(yīng)檢測(cè)試劑盒。另外，本發(fā)明還涉及二步法PCR擴(kuò)增方法和內(nèi)對(duì)照分子或試劑盒的應(yīng)用等。

背景技術(shù)：
核酸檢測(cè)技術(shù)日益普及，檢測(cè)方法多種多樣，其中主要的有聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及其衍生技術(shù)，如反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)PCR等。PCR技術(shù)目前已經(jīng)在感染性疾病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲、法醫(yī)學(xué)等檢測(cè)過程中和動(dòng)植物、考古研究中得到了廣泛的應(yīng)用，是在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物檢測(cè)、食品安全等領(lǐng)域中非常重要的核酸檢測(cè)技術(shù)。尤其是，PCR已經(jīng)廣泛用于與疾病相關(guān)的核酸的檢測(cè)實(shí)踐中，對(duì)疾病的臨床診斷起了非常重要的作用并還在迅速發(fā)展推廣之中。
在實(shí)際進(jìn)行核酸檢測(cè)的過程中運(yùn)用PCR技術(shù)，為了表征假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，也為了確定PCR的反應(yīng)效率，需要在PCR反應(yīng)體系中加入內(nèi)對(duì)照分子，這樣才能對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果給出合理的解釋，如為了排除假陰性結(jié)果，中國專利申請(qǐng)CN1203366A采用珠蛋白基因等作為內(nèi)對(duì)照分子，CN1664098A采用beta-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照分子，CN1687454A采用res-1基因作為內(nèi)對(duì)照分子，CN1940087A采用了RNA內(nèi)對(duì)照分子。因此，每次PCR時(shí)，需要通過內(nèi)對(duì)照來保證實(shí)際PCR檢測(cè)質(zhì)量。然而，相對(duì)于PCR檢測(cè)方法，人們對(duì)內(nèi)對(duì)照的研究工作卻相對(duì)少得多。
內(nèi)對(duì)照分子通過與靶核酸競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)底物，從而和樣品中可能存在的靶核酸分子在PCR擴(kuò)增的過程中相互競(jìng)爭(zhēng)抑制。這種競(jìng)爭(zhēng)在定量PCR檢測(cè)過程中是有益的，因?yàn)閮?nèi)對(duì)照分子和靶核酸分子相互競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增后得到的比值，可用來定量測(cè)定靶核酸分子數(shù)量。然而，在對(duì)靈敏度要求較高的定性測(cè)定(即，定性判斷靶核酸分子是否存在于樣品中)中，這種競(jìng)爭(zhēng)則會(huì)對(duì)PCR檢測(cè)的敏感性產(chǎn)生較大影響，即使內(nèi)對(duì)照分子與靶核酸或靶核酸引物對(duì)的序列同一性低，但如果內(nèi)對(duì)照分子加入量大(尤其相對(duì)靶核酸的相對(duì)量大，特別是PCR擴(kuò)增的最初幾個(gè)循環(huán)時(shí)靶核酸相對(duì)量會(huì)很低)，由于有較多機(jī)會(huì)與靶核酸引物對(duì)接觸，盡管不一定共同退火，但空間上影響靶核酸引物對(duì)和靶核酸接觸，則仍舊會(huì)抑制靶分子的擴(kuò)增反應(yīng)，使靈敏度下降；可是，內(nèi)對(duì)照分子加入量小，則顯然降低內(nèi)對(duì)照分子被內(nèi)對(duì)照引物對(duì)擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，內(nèi)對(duì)照自身不容易被擴(kuò)增出，無法起到監(jiān)控反應(yīng)(即，表征假陰性結(jié)果)的作用。因此，檢測(cè)人員通常會(huì)根據(jù)自己長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)來確定特定PCR反應(yīng)體系中內(nèi)對(duì)照分子的加入量(如，絕對(duì)量、濃度等)，但是這樣經(jīng)驗(yàn)性的操作會(huì)因人而異，非常不利于檢測(cè)質(zhì)量的穩(wěn)定，如不利于與其他檢測(cè)人員的結(jié)果進(jìn)行共享，也無法對(duì)PCR擴(kuò)增體系和檢測(cè)方式的改變(包括靶核酸序列、內(nèi)對(duì)照分子序列、引物對(duì)序列、擴(kuò)增方式、檢測(cè)方式等的改變)做出相應(yīng)靈活的調(diào)節(jié)，不利于包括內(nèi)對(duì)照的PCR檢測(cè)方法及相應(yīng)檢測(cè)試劑盒的開發(fā)。為了兼顧檢測(cè)的靈敏度和表征假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，CN1664098A采用兩次測(cè)定的方法，即先不添加內(nèi)對(duì)照分子進(jìn)行第一次(或前幾次)PCR檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)陰性的樣品再添加內(nèi)對(duì)照分子進(jìn)行第二次(或后幾次)PCR檢測(cè)，但是這種方法較一次測(cè)定的方法步驟更多而且更復(fù)雜，樣品用量更多，檢測(cè)成本更高，而且需要判斷第一次(或前幾次)PCR檢測(cè)結(jié)果并挑選陰性樣品重新測(cè)量，這將增加自動(dòng)化操作設(shè)計(jì)的難度，非常不利于大規(guī)模檢測(cè)，如大量樣品并行的PCR檢測(cè)，另外第二次(或后幾次)PCR檢測(cè)仍舊需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定內(nèi)對(duì)照分子的加入量。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，經(jīng)過長(zhǎng)期艱苦努力和經(jīng)驗(yàn)摸索，本發(fā)明人令人驚訝地對(duì)PCR反應(yīng)體系中為人所不重視的內(nèi)對(duì)照分子方面加以改進(jìn)，根據(jù)不加入靶核酸時(shí)的PCR檢測(cè)結(jié)果，運(yùn)用Poisson分布來確定內(nèi)對(duì)照分子的加入量，由此來兼顧檢測(cè)的靈敏度和表征假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，在盡量使內(nèi)對(duì)照分子和靶核酸分子不發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)的條件下盡可能提高表征假陰性結(jié)果的有效性，同時(shí)避免經(jīng)驗(yàn)化確定加入量給檢測(cè)質(zhì)量造成的不穩(wěn)定性，從而能夠?yàn)殚_發(fā)的包括內(nèi)對(duì)照的PCR檢測(cè)方法(尤其是自動(dòng)化的PCR檢測(cè)方法)及相應(yīng)檢測(cè)試劑盒提供平衡了檢測(cè)靈敏度和表征假陰性結(jié)果的內(nèi)對(duì)照分子的加入量。因此，本發(fā)明人還根據(jù)上述確定內(nèi)對(duì)照分子的加入量的方法所確定的量開發(fā)了PCR檢測(cè)方法及相應(yīng)檢測(cè)試劑盒。
秉承內(nèi)對(duì)照分子方面改進(jìn)的思路，本發(fā)明人還令人驚訝地優(yōu)化了內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建方法，由此構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子通過對(duì)退火溫度的調(diào)節(jié)可以提高PCR檢測(cè)的靈敏度，配合上述定量的內(nèi)對(duì)照分子的加入量，可以進(jìn)一步提高PCR檢測(cè)質(zhì)量。因此，本發(fā)明還涉及包括相應(yīng)構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子的PCR檢測(cè)方法及相應(yīng)檢測(cè)試劑盒。盡管CN101343659A公開了一種PCR引物設(shè)計(jì)方法，使內(nèi)對(duì)照的引物對(duì)退火溫度低于靶核酸的引物對(duì)退火溫度，但是其為針對(duì)引物的設(shè)計(jì)方法，并非針對(duì)內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建，其設(shè)計(jì)的具體方式也完全不同于本發(fā)明的。同時(shí)，本發(fā)明人還令人驚訝地開發(fā)了一種新的PCR定性檢測(cè)方法，其為二步法PCR擴(kuò)增方法，對(duì)內(nèi)對(duì)照引物對(duì)在PCR中加入的時(shí)機(jī)進(jìn)行了優(yōu)化，可以提高PCR檢測(cè)的靈敏度，配合上述定量的內(nèi)對(duì)照分子的加入量，可以進(jìn)一步提高PCR檢測(cè)質(zhì)量。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供確定內(nèi)對(duì)照分子的量的方法和PCR檢測(cè)方法，其通過對(duì)PCR定性檢測(cè)方法中內(nèi)對(duì)照的改進(jìn)，提高檢測(cè)靈敏度和/或兼顧檢測(cè)靈敏度和表征假陰性結(jié)果的可靠性，用以得到更高質(zhì)量的PCR檢測(cè)結(jié)果，而且可以適應(yīng)PCR擴(kuò)增體系和檢測(cè)方式的改變，為設(shè)計(jì)、實(shí)施PCR檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒帶來方便。更具體地，本發(fā)明的目的在于通過在PCR定性檢測(cè)方法中確定內(nèi)對(duì)照分子的量、構(gòu)建內(nèi)對(duì)照分子和/或改進(jìn)內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的在PCR擴(kuò)增過程中加入的時(shí)機(jī)，來取得兼顧檢測(cè)靈敏度和表征假陰性結(jié)果，從而使檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量穩(wěn)定，靈活應(yīng)對(duì)檢測(cè)方法的變化，和/或提高檢測(cè)的靈敏度等有益效果。另外，本發(fā)明的目的還在于提供相應(yīng)檢測(cè)試劑盒以及應(yīng)用等。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明的目的在于提供PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中所用的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量的確定方法，其包括 (1)以相同的擴(kuò)增條件，分別進(jìn)行k個(gè)相同的陰性PCR擴(kuò)增，所述陰性PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的量為No，k≥10；該陰性PCR擴(kuò)增體系包含靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)，其中不存在靶核酸； (2)分別檢測(cè)步驟(1)的陰性PCR擴(kuò)增后是否擴(kuò)增出內(nèi)對(duì)照分子，未檢測(cè)到內(nèi)對(duì)照分子擴(kuò)增的陰性PCR擴(kuò)增的個(gè)數(shù)為t；若t＝0或者t＝k，則調(diào)整No，重新從步驟(1)開始進(jìn)行；若t＝0，提高內(nèi)對(duì)照分子的量；若t＝k，降低內(nèi)對(duì)照分子的量； (3)根據(jù)公式(I)計(jì)算臨界量Nc 和 (4)根據(jù)Nc確定內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量，內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量介于3.0×Nc至9.2×Nc。
在本文中，本發(fā)明的檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所檢測(cè)的樣品是潛在可能含有靶核酸的離體樣品，如食品、血液、血液制品、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。在所述樣品中，本發(fā)明的檢測(cè)樣品中靶核酸的方法所檢測(cè)的目標(biāo)(即，靶核酸)可以是任何適合PCR擴(kuò)增的核酸，如基因或基因片段，包括DNA和RNA。例如，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，可以檢測(cè)HCV(丙型肝炎病毒，其為RNA病毒)的5’非編碼區(qū)RNA、HIV(人免疫缺陷病毒，其為RNA病毒)的gag基因RNA和HBV(乙型肝炎病毒，其為DNA病毒)的編碼S抗原的基因DNA。因此，靶核酸可以是RNA或DNA，優(yōu)選是病原體的RNA或DNA，如相應(yīng)病原體的特異性RNA或DNA，優(yōu)選是細(xì)菌、病毒或致病微生物的RNA或DNA，更優(yōu)選是病毒RNA或DNA，最優(yōu)選是HCV RNA、HIV RNA或HBV DNA。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，靶核酸的示例有HCV的5’非編碼區(qū)(即5’非翻譯區(qū)，簡(jiǎn)稱5’UTR)RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的編碼S抗原的基因DNA(即，s區(qū)DNA)。這些核酸能夠在一定程度上表征相應(yīng)病原體的存在性。
需要指出的是，本發(fā)明的檢測(cè)方法是用于對(duì)離體樣品的檢測(cè)，檢測(cè)的直接結(jié)果是靶核酸的存在性與否。即使對(duì)于利用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)人或動(dòng)物的血液樣品中病原體(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在與否，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生或取樣人員判斷檢測(cè)出的靶核酸是來自于血液中的病原體還是取樣時(shí)不慎污染的病原體，而不能直接得到疾病的診斷結(jié)果或健康狀況；即使靶核酸來自于血液中的病原體，也只能說明相應(yīng)人或動(dòng)物是相應(yīng)病原體的攜帶者，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)人或動(dòng)物的體質(zhì)、病史、臨床癥狀等綜合情況才能判斷出是否會(huì)造成疾病或?qū)】禒顩r有影響。
在本文中，PCR定性檢測(cè)核酸的方法指的是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的技術(shù)，如未加限定或說明，其包括PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增中使用內(nèi)對(duì)照分子，即，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增所述核酸，并通過檢測(cè)是否有所述核酸的擴(kuò)增來判斷所述核酸是否存在，而且使用內(nèi)對(duì)照分子來監(jiān)測(cè)假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。其中，PCR擴(kuò)增是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，已經(jīng)發(fā)展出多種PCR擴(kuò)增方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地根據(jù)PCR擴(kuò)增的對(duì)象而選擇靶核酸引物對(duì)和PCR擴(kuò)增所需的試劑，如耐高溫的DNA聚合酶(如，Taq酶)、核酸單體(如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP)，對(duì)于采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增RNA來說，其中還需要反轉(zhuǎn)錄酶，如禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶等。而且，引物對(duì)的含義是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，其由正向引物和反向引物組成，用于擴(kuò)增所針對(duì)的核酸的有義鏈和其互補(bǔ)鏈，但在本文中，正向引物和反向引物中的“正向”和“反向”僅為區(qū)分正向引物和反向引物，而并非局限于指其與特定鏈(有義鏈或其互補(bǔ)鏈)退火。而且，在本文中，2種引物對(duì)的不同指的是1種引物對(duì)中的兩條引物與另一種引物對(duì)中任一條引物都不同。另外，PCR擴(kuò)增所需的試劑還優(yōu)選包含pH緩沖劑(如Tris-HCl、PBS等)、離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑(如，鹽)、抗氧化劑(還原劑)、蛋白(酶)保護(hù)劑(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)、RNase和/或RNase抑制劑等。這些成分及作用和所需儀器都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，而且已經(jīng)商品化，可以通過商業(yè)渠道購買或委托制造。對(duì)于檢測(cè)，通常在PCR擴(kuò)增后進(jìn)行檢測(cè)，如通過電泳(如，微流芯片電泳、凝膠電泳)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)等來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，但也可以在PCR擴(kuò)增時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，如實(shí)時(shí)PCR(Real-time PCR)通過探針上的熒光劑和淬滅劑在擴(kuò)增過程中對(duì)熒光的影響來檢測(cè)。上述檢測(cè)手段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，其中所需試劑、儀器也可以通過行業(yè)渠道購買或委托加工。另外，PCR定性檢測(cè)核酸的方法中可以不使用內(nèi)對(duì)照，但是對(duì)于結(jié)果分析要求較高的定性檢測(cè)(如臨床診斷、血液篩查過程的一部分中所使用的PCR定性檢測(cè))來說，為了檢測(cè)假陰性結(jié)果的產(chǎn)生(即，樣品中實(shí)際存在靶核酸，但是沒有檢測(cè)到)，會(huì)采用內(nèi)對(duì)照，包括內(nèi)對(duì)照分子以及內(nèi)對(duì)照引物對(duì)。因此，本發(fā)明的PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法包括PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增中使用內(nèi)對(duì)照分子。當(dāng)然，內(nèi)對(duì)照分子不必在PCR擴(kuò)增的全過程中都被使用，可以在進(jìn)行了幾個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增后再加入內(nèi)對(duì)照分子，也可以都加入內(nèi)對(duì)照分子，如本發(fā)明第五方面所述的那樣進(jìn)行。
內(nèi)對(duì)照分子是序列不同于靶核酸的核酸分子。內(nèi)對(duì)照分子可以是單鏈核酸，也可以是雙鏈核酸，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選是雙鏈核酸?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有將特定核酸分子用作為內(nèi)對(duì)照分子，本發(fā)明第三方面也提供了一種內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建方法。PCR擴(kuò)增時(shí)，在理論上的合適條件(如，理論上可以擴(kuò)增靶核酸的條件)下，內(nèi)對(duì)照分子可以被內(nèi)對(duì)照引物對(duì)擴(kuò)增，因此理論上可以監(jiān)測(cè)假陰性結(jié)果。但是，實(shí)際上，由可能存在靶核酸的樣品、靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和PCR擴(kuò)增所需的試劑以及水組成的PCR擴(kuò)增體系成分非常復(fù)雜，靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子之間在PCR擴(kuò)增體系中并不同PCR擴(kuò)增條件下的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)于不同精度的檢測(cè)方式所得的靈敏度影響，是難以用精確的計(jì)算方法推算出理論上的合適條件的。只能得出操作性差的大致結(jié)論P(yáng)CR擴(kuò)增中嚴(yán)格控制所加入的內(nèi)對(duì)照分子數(shù)(為減少競(jìng)爭(zhēng)應(yīng)當(dāng)加入最小量的內(nèi)對(duì)照模板數(shù))，既要使加入之內(nèi)對(duì)照模板能監(jiān)測(cè)反映出此PCR的效率或假陰性而多加，但又要盡可能少加來嚴(yán)格控制可能會(huì)抑制靶分子擴(kuò)增的負(fù)面影響。因此，本發(fā)明人采用與PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸時(shí)的PCR擴(kuò)增體系相比，僅缺少靶核酸的陰性PCR擴(kuò)增體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來實(shí)驗(yàn)出對(duì)于該P(yáng)CR擴(kuò)增體系及其PCR擴(kuò)增方式和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)的不能擴(kuò)增出可檢測(cè)得到內(nèi)對(duì)照分子的概率，并利用該概率通過Poisson分布計(jì)算出該P(yáng)CR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的臨界量，推算出內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量(優(yōu)化添加量)，從而優(yōu)化大規(guī)模PCR檢測(cè)中或在PCR檢測(cè)的不同批次之間的可靠性及重復(fù)性。
在本發(fā)明的第一方面的方法中，陰性PCR擴(kuò)增體系指的是PCR擴(kuò)增體系，其由靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和PCR擴(kuò)增所需的試劑以及水組成，其中不存在靶核酸。換句話說，與PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸時(shí)所采用的PCR擴(kuò)增體系相比，陰性PCR擴(kuò)增體系除了肯定不含靶核酸之外，其他都相同。例如，可以不加入樣品，而代之以加入相同體積的樣品溶劑(如水、緩沖液等)，并加入靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)和PCR擴(kuò)增所需的試劑以及水，由此來獲得陰性PCR擴(kuò)增體系。對(duì)陰性PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，即為陰性PCR擴(kuò)增，理論上將獲得靶核酸檢測(cè)陰性的結(jié)果(即，檢測(cè)不到)。優(yōu)選其中靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是不同的，即優(yōu)選所述陰性PCR擴(kuò)增體系包含靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)，其中靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是不同的，更優(yōu)選內(nèi)對(duì)照分子中沒有與靶核酸引物對(duì)序列同一性高的連續(xù)序列，如同一性大于50％、40％、30％、20％、10％或5％的序列。
在本發(fā)明的第一方面的方法中，為了準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)出對(duì)于特定PCR擴(kuò)增體系和特定PCR擴(kuò)增條件下不能擴(kuò)增出可檢測(cè)得到內(nèi)對(duì)照分子的概率，需要進(jìn)行k個(gè)相同的陰性PCR擴(kuò)增，其中k較大，優(yōu)選k大于等于10，優(yōu)選大于等于30，更優(yōu)選大于等于50，最優(yōu)選大于等于80。盡管k越大就越接近客觀的概率，但是根據(jù)本發(fā)明人長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)，30個(gè)以上的相同的陰性PCR擴(kuò)增數(shù)量所獲得的概率就已經(jīng)比較準(zhǔn)確了，而80個(gè)已經(jīng)非常準(zhǔn)確了，再增加試驗(yàn)次數(shù)所得的概率與80個(gè)的相差很小，出于成本的考慮可以不再增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)。各個(gè)陰性PCR擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)是相同的，即PCR擴(kuò)增條件和陰性PCR擴(kuò)增體系均是相同的，如退火溫度、退火時(shí)間、延伸時(shí)間等擴(kuò)增條件均相同，而且擴(kuò)增體系中諸如靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子等的量、序列和加入的時(shí)機(jī)以及所使用的酶、試劑的量和類型等均相同。其中，各個(gè)陰性PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的量均表示為No。在本文中，“量”可以指絕對(duì)數(shù)量，如分子數(shù)、分子摩爾數(shù)等，也可以指一定空間中的數(shù)量，如濃度。由于PCR擴(kuò)增體系是特定而預(yù)先知曉的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易通過總體積或總質(zhì)量來將相應(yīng)濃度換算成絕對(duì)數(shù)量，反之亦然。
進(jìn)行了k個(gè)相同的陰性PCR擴(kuò)增后，分別進(jìn)行檢測(cè)是否擴(kuò)增出內(nèi)對(duì)照分子，為了避免不同檢測(cè)方式的精度不同，優(yōu)選檢測(cè)的方式與本發(fā)明的PCR定性檢測(cè)核酸的方法中檢測(cè)是否擴(kuò)增出內(nèi)對(duì)照分子的方式是相同的，如都使用相同類型的凝膠電泳來檢測(cè)，其中檢測(cè)條件(如凝膠濃度、電流大小等)均相同。檢測(cè)后，未檢測(cè)到內(nèi)對(duì)照分子擴(kuò)增的陰性PCR擴(kuò)增的個(gè)數(shù)為t，若t＝0，則說明內(nèi)對(duì)照分子的量太少，少得足以無法以相應(yīng)PCR擴(kuò)增條件和PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增出可檢測(cè)得到的內(nèi)對(duì)照分子，根本無法起到內(nèi)對(duì)照監(jiān)測(cè)的作用，因此需要提高陰性PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的量(No)，重新從本發(fā)明的第一方面的方法的步驟(1)開始依次進(jìn)行；若t＝k，則說明內(nèi)對(duì)照分子的量可能太多，雖然能夠起到內(nèi)對(duì)照監(jiān)測(cè)的作用，但是可能有降低內(nèi)對(duì)照分子的量來避免與靶核酸競(jìng)爭(zhēng)的余地，因此需要降低陰性PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的量(No)，重新從本發(fā)明的第一方面的方法的步驟(1)開始依次進(jìn)行。如此進(jìn)行，直到0＜t＜k。此時(shí)，可以計(jì)算出該P(yáng)CR擴(kuò)增體系中n(顯然，n與No成正比，計(jì)為No＝m×n)個(gè)內(nèi)對(duì)照分子都沒有被擴(kuò)增到可檢測(cè)出的概率為P(0)＝t/k。由于內(nèi)對(duì)照分子數(shù)的絕對(duì)值很大，而每個(gè)內(nèi)對(duì)照分子不被擴(kuò)增的概率p很小，因此內(nèi)對(duì)照分子都沒有被擴(kuò)增到可檢測(cè)出的概率符合Poisson分布，例如P(0)＝e-n×p。同時(shí)，在該P(yáng)CR擴(kuò)增體系中，期望的沒有進(jìn)行擴(kuò)增的內(nèi)對(duì)照分子數(shù)為n和p的乘積，若期望的沒有進(jìn)行擴(kuò)增的內(nèi)對(duì)照分子數(shù)小于1，則有最大的概率使該P(yáng)CR擴(kuò)增體系沒有1個(gè)內(nèi)對(duì)照分子參與競(jìng)爭(zhēng)，因此參與競(jìng)爭(zhēng)的臨界內(nèi)對(duì)照分子數(shù)n’＝1/p，其中n’與臨界量Nc成正比，為Nc＝m×n’，可以根據(jù)公式(I)可以由No和P(0)計(jì)算出臨界量Nc。但是此時(shí)，只有內(nèi)對(duì)照分子只有以e-1(約37％)的概率被擴(kuò)增出，無法達(dá)到有效監(jiān)控的目的。因此，當(dāng)取優(yōu)化量時(shí)，內(nèi)對(duì)照分子以很大的概率(計(jì)為1-P(0)’)被擴(kuò)增到可檢測(cè)出，而沒有被擴(kuò)增到可檢測(cè)出的情況是小概率事件(概率計(jì)為P(0)’)，實(shí)踐中很難產(chǎn)生，因此再增加概率只有徒增與靶分子的競(jìng)爭(zhēng)和成本了，根據(jù)Poisson分布，此時(shí)優(yōu)化量為Nc×(-ln P(0)’)。也就是說，對(duì)于特定的PCR擴(kuò)增條件，當(dāng)特定的PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的量為臨界量Nc×(-ln P(0)’)時(shí)，檢測(cè)不到內(nèi)對(duì)照分子的情況被認(rèn)為不會(huì)發(fā)生，而此時(shí)內(nèi)對(duì)照分子的量又是被認(rèn)為內(nèi)對(duì)照分子不會(huì)被漏檢的情況下與靶核酸競(jìng)爭(zhēng)最小的濃度，兼顧了檢測(cè)靈敏度和假陰性結(jié)果的表征。而一般公認(rèn)的小概率是5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％等。因此，在本發(fā)明的第一方面的方法中，優(yōu)選內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量介于3.0×Nc至9.2×Nc，優(yōu)選介于4.6×Nc至6.9×Nc，最優(yōu)選為5.3×Nc。
在第二方面，本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明第一方面所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量在PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的應(yīng)用。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其包括PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增中使用內(nèi)對(duì)照分子，而且所使用的內(nèi)對(duì)照分子的量為本發(fā)明第一方面所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。由于該內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量針對(duì)本發(fā)明的第一方面的方法中的PCR擴(kuò)增體系、PCR擴(kuò)增條件和檢測(cè)內(nèi)對(duì)照分子的方式，因此本發(fā)明第二方面的PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法的PCR擴(kuò)增體系、PCR擴(kuò)增條件和檢測(cè)內(nèi)對(duì)照分子的方式希望能與本發(fā)明的第一方面的方法中的PCR擴(kuò)增體系、PCR擴(kuò)增條件和檢測(cè)內(nèi)對(duì)照分子的方式相同或相近。其中，優(yōu)選PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的擴(kuò)增條件為本發(fā)明第一方面所述方法步驟(1)所述的相同擴(kuò)增條件；也優(yōu)選PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中內(nèi)對(duì)照分子的檢測(cè)為本發(fā)明第一方面所述方法步驟(2)所述的內(nèi)對(duì)照分子的檢測(cè)；由于樣品中靶核酸可能存在也可能不存在，并非是預(yù)先確定的，因此也優(yōu)選PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的PCR擴(kuò)增體系由本發(fā)明第一方面所述方法步驟(1)所述的陰性PCR擴(kuò)增體系和樣品中任選存在的靶核酸組成。另外，本發(fā)明還提供了用于上述PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的檢測(cè)試劑盒，其中PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法所使用的內(nèi)對(duì)照分子的量為本發(fā)明第一方面所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。例如，在制備檢測(cè)試劑產(chǎn)品(如，檢測(cè)試劑盒)時(shí)，確定各種引物、試劑的序列、組成和用量，當(dāng)PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件確定后，采用本發(fā)明第一方面所述方法確定內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量，由此確定內(nèi)對(duì)照分子的用量。
在第三方面，本發(fā)明的目的在于提供PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中所用內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建方法，其包括選擇候選核酸或突變候選核酸成為內(nèi)對(duì)照分子，所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列和靶核酸中與靶核酸引物對(duì)退火的序列是不同的，而且內(nèi)對(duì)照分子與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的退火溫度低于靶核酸與靶核酸引物對(duì)的退火溫度。內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量由上述內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量的確定方法確定。在本發(fā)明第三方面的方法中，構(gòu)建的含義是選擇或突變核酸分子并進(jìn)而得到所選擇或突變的核酸實(shí)體。引物與其所針對(duì)的核酸序列的退火溫度可以通過Tm值來確定，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。由于靶核酸預(yù)先確定，因此需要構(gòu)建出內(nèi)對(duì)照分子，并根據(jù)Tm值來設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。這樣，降低內(nèi)對(duì)照引物對(duì)與內(nèi)對(duì)照分子的結(jié)合溫度，可以使靶核酸引物對(duì)與靶核酸在較高的溫度下退火結(jié)合，優(yōu)先擴(kuò)增，而內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)較難結(jié)合；然后，擴(kuò)增幾個(gè)或十幾個(gè)(如，5～10個(gè))循環(huán)之后，如存在，靶核酸的量將增加，其相對(duì)于內(nèi)對(duì)照分子的比例也增加了，受內(nèi)對(duì)照分子的競(jìng)爭(zhēng)影響也相對(duì)減少，因此提高了檢測(cè)靈敏度；此后再降低退火溫度，以使內(nèi)對(duì)照分子擴(kuò)增，也能兼顧假陰性結(jié)果的表征。
在本發(fā)明第三方面的方法中，候選核酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基因工程方法和/或化學(xué)合成方法來突變，或選擇其中一段序列，形成內(nèi)對(duì)照分子。為了降低突變的成本，也為了增加從中選擇出內(nèi)對(duì)照分子的機(jī)會(huì)，優(yōu)選候選核酸與靶核酸的序列同一性小于20％，更優(yōu)選小于10％。通過與人類及HBV、HCV、HIV等常見病毒和病菌基因組序列的綜合比較，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種與它們序列同一性綜合程度低的基因，其為序列如Seq ID No1所示的新霉素抗藥性基因(neo)，適于作為候選核酸。因此，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，候選核酸為新霉素抗藥性基因，在其基礎(chǔ)上選擇出或突變出如本發(fā)明實(shí)施例所列的內(nèi)對(duì)照分子。
對(duì)于本發(fā)明第三方面的方法，在一些具體實(shí)施方式
中，根據(jù)靶核酸和構(gòu)建出的內(nèi)多照分子的靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是不相同的。其中，內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)序列是完全匹配的，優(yōu)選所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列長(zhǎng)度介于10-25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選介于15-20個(gè)核苷酸。
對(duì)于本發(fā)明第三方面的方法，在另一些具體實(shí)施方式
中，根據(jù)靶核酸和構(gòu)建出的內(nèi)多照分子確定的靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是相同的。其中，內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)序列是不完全匹配的，優(yōu)選所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列長(zhǎng)度介于25-35個(gè)核苷酸，更優(yōu)選介于27-32個(gè)核苷酸。優(yōu)選其中所述不完全匹配的序列都位于由3-7個(gè)連續(xù)的A和/或T組成的序列中，更有選位于由5個(gè)連續(xù)的A和/或T組成的序列中，也優(yōu)選由3-7個(gè)連續(xù)的A和/或T組成的序列是由A或T組成的序列，如5’-AAAA-3’或5’-TTTTT-3’。優(yōu)選所述不完全匹配的序列更靠近但不位于內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列的5’端，如距離所述5’端6-8個(gè)堿基，和/或距離所述5’端1-3個(gè)堿基，即使距離所述5’端12-16個(gè)堿基也可以，只要所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列長(zhǎng)度足夠長(zhǎng)使其位置更靠近5’端而非3’端即可。通常，由于很難有機(jī)會(huì)從候選核酸上直接選擇出這樣性質(zhì)的內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列，因此需要對(duì)候選核酸上選擇出的序列加以突變，在與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)(即，靶核酸引物對(duì))退火的位置上形成所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列。例如，可以先根據(jù)靶核酸確定靶核酸引物對(duì)，即內(nèi)對(duì)照引物對(duì)，然后將與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的位置突變成內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的完全匹配的序列，然后再在更靠近但不位于與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列的5’端突變，形成所述不完全匹配的序列，由此完成內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建。
在第四方面，本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明第三方面所述的方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子在PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的應(yīng)用。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其包括PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增中使用內(nèi)對(duì)照分子，所使用的內(nèi)對(duì)照分子為本發(fā)明第三方面所述的方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子，而且PCR擴(kuò)增過程中降低退火溫度。另外，優(yōu)選其中內(nèi)對(duì)照分子的量為本發(fā)明第一方面所述的方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。這樣，降低內(nèi)對(duì)照引物對(duì)與內(nèi)對(duì)照分子的結(jié)合溫度，可以使靶核酸引物對(duì)與靶核酸在較高的溫度(優(yōu)選溫度為靶核酸引物對(duì)與靶核酸的退火溫度)下優(yōu)先擴(kuò)增；在擴(kuò)增幾個(gè)或十幾個(gè)(如，5～10個(gè))循環(huán)之后，如存在，靶核酸的量將增加，其相對(duì)于內(nèi)對(duì)照分子的比例也增加了，受內(nèi)對(duì)照分子的競(jìng)爭(zhēng)影響也相對(duì)減少，因此提高了檢測(cè)靈敏度；此后再降低退火溫度(優(yōu)選降至內(nèi)對(duì)照分子與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的退火溫度)，以使內(nèi)對(duì)照分子擴(kuò)增，也能兼顧假陰性結(jié)果的表征。對(duì)于本發(fā)明第三方面的方法，在一些具體實(shí)施方式
中，靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是不同的。其中，內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)序列是完全匹配的，優(yōu)選所述內(nèi)對(duì)照引物對(duì)中正向引物和反向引物的序列長(zhǎng)度都介于10-25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選介于15-20個(gè)核苷酸。對(duì)于本發(fā)明第三方面的方法，在另一些具體實(shí)施方式
中，其中靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是相同的。其中，內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)序列是不完全匹配的，優(yōu)選所述內(nèi)對(duì)照引物對(duì)中正向引物和反向引物的序列長(zhǎng)度都介于25-35個(gè)核苷酸，更優(yōu)選介于27-32個(gè)核苷酸。優(yōu)選其中所述不完全匹配的序列都位于由3-7個(gè)連續(xù)的A和/或T組成的序列中，更有選位于由5個(gè)連續(xù)的A和/或T組成的序列中，也優(yōu)選由3-7個(gè)連續(xù)的A和/或T組成的序列是由A或T組成的序列，如5’-AAAA-3’或5’-TTTTT-3’。優(yōu)選所述不完全匹配的序列更靠近但不位于內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列的5’端，如距離所述5’端6-8個(gè)堿基，和/或距離所述5’端1-3個(gè)堿基，即使距離所述5’端12-16個(gè)堿基也可以，只要所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列長(zhǎng)度足夠長(zhǎng)使其位置更靠近5’端而非3’端即可。另外，本發(fā)明還提供了用于上述PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的檢測(cè)試劑盒，其中PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法所使用的內(nèi)對(duì)照分子為本發(fā)明第三方面所述的方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子。例如，在制備檢測(cè)試劑產(chǎn)品(如，檢測(cè)試劑盒)時(shí)，為了構(gòu)成其中的內(nèi)對(duì)照分子，采用本發(fā)明第三方面所述的方法來構(gòu)建內(nèi)對(duì)照分子。
在第五方面，本發(fā)明的目的在于提供PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其包括(1)對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增體系所包含的內(nèi)對(duì)照引物對(duì)有且只有正向引物；(2)步驟(1)完成后，加入內(nèi)對(duì)照引物的反向引物，繼續(xù)對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和(3)步驟(2)完成后，檢測(cè)是否有擴(kuò)增的靶核酸。
本發(fā)明第五方面的方法采用了二步PCR擴(kuò)增，分兩步擴(kuò)增第一步PCR擴(kuò)增時(shí)只加入內(nèi)對(duì)照引物對(duì)中的一種引物(即，正向引物)，而不加入另一種引物(即，反向引物)；然后進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，其中加入反向引物。在本發(fā)明第五方面的方法的步驟(1)中，所述PCR擴(kuò)增體系由樣品、靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的正向引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑以及水組成。當(dāng)然其中，靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是不相同的，無法利用靶核酸引物對(duì)的正向引物或反向引物起到內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的反向引物的作用。這樣，在第一步PCR擴(kuò)增中只擴(kuò)增其中內(nèi)對(duì)照分子中的一條核酸鏈，該核酸鏈量的增長(zhǎng)方式呈線性增長(zhǎng)，會(huì)大大慢于同時(shí)擴(kuò)增的靶核酸量的增長(zhǎng)。例如，第一步PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，那么理論上內(nèi)對(duì)照分子只產(chǎn)生20倍于初始量的單鏈核酸，而如果存在，靶核酸的量將呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，因此第一步PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生的內(nèi)對(duì)照分子由于相對(duì)量較少，而沒有能力和靶分子競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)底物，從而降低了內(nèi)對(duì)照分子對(duì)靶核酸的競(jìng)爭(zhēng)，提高了檢測(cè)靈敏度。第二步PCR擴(kuò)增中，再補(bǔ)入內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的反向引物，來擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照分子，在降低競(jìng)爭(zhēng)的同時(shí)，起到內(nèi)對(duì)照監(jiān)測(cè)的作用。
在本發(fā)明第五方面的方法中，步驟(1)的PCR擴(kuò)增和步驟(2)的PCR擴(kuò)增可以采用相同的退火溫度，也可以采用不同的退火溫度。例如其中，步驟(1)的PCR擴(kuò)增的退火溫度比步驟(2)的PCR擴(kuò)增的退火溫度高，此時(shí)優(yōu)選其中內(nèi)對(duì)照分子為本發(fā)明第三方面所述方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子。
在本發(fā)明第五方面的方法中，優(yōu)選使得步驟(1)中內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的正向引物的量較少，在步驟(2)中加入內(nèi)對(duì)照引物的反向引物時(shí)補(bǔ)足正向引物的量。例如，步驟(1)中內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的正向引物的加入量只為本發(fā)明第五方面的方法中內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的正向引物的加入總量的不超過50％、40％、30％、20％、10％，如為加入總量的10％、5％，在步驟(2)中加入全部?jī)?nèi)對(duì)照引物的反向引物時(shí)補(bǔ)足正向引物的量。這樣，可以進(jìn)一步減低第一步PCR擴(kuò)增中內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增量，進(jìn)一步降低了內(nèi)對(duì)照分子對(duì)靶核酸的競(jìng)爭(zhēng)。
在本發(fā)明第五方面的方法中，優(yōu)選內(nèi)對(duì)照分子的量為本發(fā)明第一方面所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。這樣可以進(jìn)一步優(yōu)化本發(fā)明第五方面的方法，使得在盡可能保證檢測(cè)靈敏性的前提下，兼顧內(nèi)對(duì)照監(jiān)測(cè)擴(kuò)增的有效性。
在第六方面，本發(fā)明的目的在于提供PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其包括PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增中使用內(nèi)對(duì)照分子，其特征在于，所述內(nèi)對(duì)照分子為本發(fā)明第三方面所述方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子，和/或所述內(nèi)對(duì)照分子的量為本發(fā)明第一方面所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。本發(fā)明第六方面的方法可以參見本發(fā)明第四方面或本發(fā)明第二方面中描述的PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法。
在第七方面，本發(fā)明的目的在于提供用于本發(fā)明第五方面或本發(fā)明第六方面所述PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的檢測(cè)試劑盒。優(yōu)選所述試劑盒包含Seq ID No1所示的核酸作為內(nèi)對(duì)照分子。優(yōu)選所述PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中使用的靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)、PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或檢測(cè)所需的試劑可以分裝在相同或不同容器中。在本文中，試劑盒具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的常規(guī)含義，例如，當(dāng)存在不同步驟中使用的試劑時(shí)，則這些不同試劑應(yīng)當(dāng)分裝于不同容器，避免預(yù)先相互混合。優(yōu)選所述試劑盒還帶有標(biāo)簽或說明書，用于指示所述試劑盒中不同成分的使用方法，例如本發(fā)明第五方面或本發(fā)明第六方面的方法，用以指導(dǎo)所述方法的進(jìn)行。標(biāo)簽可以貼在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供獨(dú)立的說明書。其中，容器可以是瓶、盒、注射器等能容納上述成分的容器，例如常規(guī)用于裝PCR、酶或核酸試劑的容器。根據(jù)需要，如方便運(yùn)輸、存放的需要，試劑盒還可以進(jìn)一步包裝進(jìn)更大的包裝中，這樣的產(chǎn)品也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在第八方面，本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明第七方面所述的檢測(cè)試劑盒在制備用于本發(fā)明第五方面或本發(fā)明第六方面所述PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法的檢測(cè)試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。檢測(cè)試劑產(chǎn)品可以是檢測(cè)試劑盒本身，也可以是合并裝有多個(gè)檢測(cè)試劑盒的更大包裝產(chǎn)品。根據(jù)前文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解其中檢測(cè)試劑盒的成分以及其中制備方法和應(yīng)用方法的流程。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。



圖1使用內(nèi)對(duì)照分子一步法PCR檢測(cè)HBV的S基因的檢測(cè)結(jié)果圖，其中IC表示內(nèi)對(duì)照分子檢測(cè)峰，HBV表示S基因的檢測(cè)峰。
圖2使用內(nèi)對(duì)照分子二步法PCR檢測(cè)HBV的S基因的檢測(cè)結(jié)果圖，其中IC表示內(nèi)對(duì)照分子檢測(cè)峰，HBV表示S基因的檢測(cè)峰。
圖3PCR檢測(cè)HBV的S基因的檢測(cè)結(jié)果圖，其中IC表示內(nèi)對(duì)照分子檢測(cè)峰，HBV表示S基因的檢測(cè)峰。
圖4PCR檢測(cè)HBV的S基因的陰性PCR擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果圖，其中IC表示內(nèi)對(duì)照分子檢測(cè)峰，沒有出現(xiàn)表示S基因的檢測(cè)峰。

具體實(shí)施例方式 以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。
實(shí)施例1內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建和定量示例 從序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗藥性基因(neo)中選擇出第936位-1076位的核酸序列，委托大連寶生物公司合成該核酸，構(gòu)建成為內(nèi)對(duì)照分子。
向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的1拷貝上述內(nèi)對(duì)照分子，內(nèi)對(duì)照引物對(duì)(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，0.2uM的IC探針(SEQ IDNO.20)，靶核酸引物對(duì)(HBV引物1(SEQ ID NO.2)、HBV引物2(SEQ ID NO.3)各0.4uM，其針對(duì)HBV上的S基因)，0.2uM的HBV探針(SEQ ID NO.19)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。共重復(fù)進(jìn)行80個(gè)上述陰性PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的陰性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過熒光方法檢測(cè)內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如表1所示，其中未檢出內(nèi)對(duì)照分子的(no ct)共有30個(gè)，根據(jù)公式(I)，在上述PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的臨界濃度Nc＝1/-ln(30/80)＝1.02。由此可得，為了保證內(nèi)對(duì)照分子被檢測(cè)到幾率大于99.5％，上述PCR擴(kuò)增體系應(yīng)當(dāng)加入達(dá)到的優(yōu)化濃度為1.02×5.3＝5.4拷貝。
表1陰性PCR擴(kuò)增后內(nèi)對(duì)照分子的熒光數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)施例2使用內(nèi)對(duì)照分子一步法PCR檢測(cè)HBV的S基因 以HBV的S基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。向PCR試管中加入以下以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的5.4拷貝序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子，內(nèi)對(duì)照引物對(duì)(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心機(jī)構(gòu)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HBV引物1(SEQID NO.2)、HBV引物2(SEQ ID NO.3)，各0.4uM，其針對(duì)HBV上的S基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸(靶核酸探針為5’-(FAM)TGTGT CTGCG GCGTT TTATCA(eclipse)-3’，可以委托大連寶生物公司合成)和內(nèi)對(duì)照分子(內(nèi)對(duì)照分子探針為5’-(Texas Red)tgcgctgacagccggaacac(eclipse)-3’，可以委托大連寶生物公司合成)的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。
實(shí)施例3使用內(nèi)對(duì)照分子二步法PCR檢測(cè)HBV的S基因 以HBV的S基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。預(yù)先在很低濃度的含靶核酸的前提下，根據(jù)以下二步法PCR的全過程，確定序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子的加入量達(dá)到100拷貝。
向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的100拷貝序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC1(SEQ ID NO.4)，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心機(jī)構(gòu)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度為1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HBV引物1(SEQ IDNO.2)、HBV引物2(SEQ ID NO.3)，各0.4uM，其針對(duì)HBV上的S基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到20ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×20循環(huán)。由此完成第一步PCR擴(kuò)增。
向上述PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC1(SEQ ID NO.4)，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物對(duì)IC2(SEQ ID NO.5)，0.03U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×35循環(huán)。由此完成第二步PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。實(shí)施例4內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建以及使用其檢測(cè)HBV的S基因 從序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗藥性基因(neo)中選擇出第936位-1072位的核酸序列，并根據(jù)HBV的S基因所確定的靶核酸引物對(duì)(HBV引物3(SEQ ID NO.6)、HBV引物4(SEQ ID NO.7))突變退火區(qū)域的序列，并且突變出含有不匹配序列的連續(xù)aaaaa區(qū)域(其序列如SEQ ID NO.16所示)，委托大連寶生物公司合成SEQ ID NO.16所示序列的核酸，構(gòu)建成為內(nèi)對(duì)照分子。
以HBV的S基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。向PCR試管中加入以下以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的4.7拷貝序列如SEQ ID NO.16所示的內(nèi)對(duì)照分子，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HBV引物3(SEQ ID NO.6)、HBV引物4(SEQ ID NO.7)，各0.5uM，其針對(duì)HBV上的S基因，相當(dāng)于內(nèi)對(duì)照引物對(duì))，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)；圖4顯示陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果圖。
實(shí)施例5使用內(nèi)對(duì)照分子一步法PCR檢測(cè)HCV的RNA 以HCV的非編碼區(qū)RNA作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。預(yù)先在不含靶核酸的前提下，根據(jù)以下PCR的全過程，確定序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子的加入量。
向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的5.4拷貝如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子，內(nèi)對(duì)照引物對(duì)(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心機(jī)構(gòu)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HCV引物1(SEQ ID NO.8)、HCV引物2(SEQ ID NO.9)，各0.4uM，其針對(duì)HCV上的5‘非編碼區(qū)基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05UTaq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.5U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(可購自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，說明本發(fā)明的內(nèi)對(duì)照分子構(gòu)建方法和內(nèi)對(duì)照分子量的確定方法也同樣適于對(duì)RNA靶核酸的檢測(cè)。
實(shí)施例6使用內(nèi)對(duì)照分子二步法PCR檢測(cè)HCV的RNA 以HCV的非編碼區(qū)RNA作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。預(yù)先在含臨界較低濃度的靶核酸的前提下，根據(jù)以下二步法PCR的全過程，確定序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子的加入量。
向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的100拷貝序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC1(SEQ ID NO.4)，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心機(jī)構(gòu)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HCV引物1(SEQ ID NO.8)、HCV引物2(SEQ ID NO.9)，各0.4uM，其針對(duì)HCV上的5‘非編碼區(qū)基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U的Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.5U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(可購自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到20ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×20循環(huán)。由此完成第一步PCR擴(kuò)增。
向上述PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC1(SEQ ID NO.4)，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC2(SEQ ID NO.5)，0.03U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×35循環(huán)。由此完成第二步PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果顯示能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。
實(shí)施例7內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建以及使用其檢測(cè)HCV的RNA 從序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗藥性基因(neo)中選擇出第936位-1072位的核酸序列，并根據(jù)HCV的S基因所確定的靶核酸引物對(duì)(HCV引物3(SEQ ID NO.10)、HCV引物4(SEQ ID NO.11))突變退火區(qū)域的序列，并且突變出含有不匹配序列的連續(xù)aaaaa區(qū)域(其序列如SEQ ID NO.17所示)，委托大連寶生物公司合成SEQ ID NO.17所示序列的核酸，構(gòu)建成為內(nèi)對(duì)照分子。
以HCV的5‘非編碼區(qū)基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。向PCR試管中加入以下以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的6.2拷貝如SEQ ID NO.17所示的內(nèi)對(duì)照分子，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HCV引物3(SEQ ID NO.10)、HCV引物4(SEQ ID NO.11)，各0.6uM，其針對(duì)HCV上的5‘非編碼區(qū)基因，相當(dāng)于內(nèi)對(duì)照引物對(duì))，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.5U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(可購自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果顯示能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。
實(shí)施例8使用內(nèi)對(duì)照分子一步法PCR檢測(cè)HIV的RNA 以HIV RNA-1的gag基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。預(yù)先在不含靶核酸的前提下，根據(jù)以下PCR的全過程，確定序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子的加入量。
向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的5.4拷貝序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子，內(nèi)對(duì)照引物對(duì)(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HIV引物1(SEQ ID NO.12)、HIV引物2(SEQ ID NO.13)，各0.4uM，其針對(duì)HIV上的gag基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.5U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(可購自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，說明本發(fā)明的內(nèi)對(duì)照分子構(gòu)建方法和內(nèi)對(duì)照分子量的確定方法也同樣適于對(duì)RNA靶核酸的檢測(cè)。
實(shí)施例9使用內(nèi)對(duì)照分子二步法PCR檢測(cè)HIV的RNA 以HIV RNA-1的gag基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。預(yù)先在很低濃度的含靶核酸的前提下，根據(jù)以下二步法PCR的全過程，確定序列如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子的加入量。
向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的100拷貝如SEQ ID NO.21所示的內(nèi)對(duì)照分子，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC1(SEQ ID NO.4)，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心機(jī)構(gòu)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HIV引物1(SEQ ID NO.12)、HIV引物2(SEQ ID NO.13)，各0.4uM，其針對(duì)HIV上的gag基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U的Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.5U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(可購自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到20ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×20循環(huán)。由此完成第一步PCR擴(kuò)增。
向上述PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC1(SEQ ID NO.4)，0.2uM內(nèi)對(duì)照引物IC2(SEQ ID NO.5)，0.03U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行PCR94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×35循環(huán)。由此完成第二步PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果顯示能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。
實(shí)施例10內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建以及使用其檢測(cè)HIV的RNA 從序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗藥性基因(neo)中選擇出第936位-1072位的核酸序列，并根據(jù)HIV的gag基因所確定的靶核酸引物對(duì)(HIV引物3(SEQ ID NO.14)、HIV引物4(SEQ ID NO.15))突變退火區(qū)域的序列，并且突變出含有不匹配序列的連續(xù)aaaaa區(qū)域(其序列如SEQ ID NO.18所示)，委托大連寶生物公司合成SEQ ID NO.18所示序列的核酸，構(gòu)建成為內(nèi)對(duì)照分子。
以HIV的gag基因作為檢測(cè)所針對(duì)的靶核酸。向PCR試管中加入以下引物和PCR擴(kuò)增所需的試劑成分并達(dá)到以下終濃度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀釋得到的5.6拷貝序列如SEQ ID NO.18所示的內(nèi)對(duì)照分子，5uL靶核酸(其由購自衛(wèi)生部臨檢中心的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋而得，稀釋度分別為10、100、1000或不含靶核酸)，靶核酸引物對(duì)(HIV引物3(SEQ ID NO.14)、HIV引物4(SEQ ID NO.15)，各0.6uM，其針對(duì)HIV上的gag基因，相當(dāng)于內(nèi)對(duì)照引物對(duì))，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可購自MBI公司)，0.5U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(可購自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可購自EPI公司)，使最終體積達(dá)到30ul(余量用水補(bǔ)足)。按如下參數(shù)進(jìn)行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循環(huán)。
擴(kuò)增結(jié)束后，將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流芯片方法檢測(cè)靶核酸和內(nèi)對(duì)照分子的擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果顯示能夠檢測(cè)出1000稀釋度的靶核酸，而且內(nèi)對(duì)照分子能夠進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。
<110>上海浩源生物科技有限公司
<120>PCR反應(yīng)中的非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)
<160>21
<210>1
<211>4380
<212>DNA
<213>新霉素抗藥性基因(NEO)
<400>1
1gggccccccc tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgata tcgaattcct gcagcccggg
61 ggatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc tcgctgcatg caggtcactg
121 gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa tacaaataca
181 tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataagaac cctaattccc
241 ttatctggga actactcaca cattattctg gagaaaaata gagagagata gatttgtaga
301 gagagactgg tgatttttgc gggtcccgct cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag
361 gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat
421 tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc
481 gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata
541 ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc
601 ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc
661 tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg
721 tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg
781 atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
841 cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga
901 acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca
961 ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg
1021 gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat agccgaatag cctctccacc
1081 caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa tccaagctcc catggtggcc
1141 actcgaggtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg
1201 atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat ccacttgctt
1261 tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgttc ctcgtgggtg ggggtccatc
1321 tttgggacca ctgtcggtag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg
1381 gcatttgtag aagccatctt ccttttctac tgtcctttcg atgaagtgac agatagctgg
1441 gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct
1501 ctggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac
1561 catgtttgca tgcatgcatg catgcaagct tggtaccaga tcttataatt aaatggcctt
1621 cgctgcccat attattggta actcaacagc atcaatcacg ggatttttct cgaattaatt
1681 gcgtcgaatc tcagcatcga aatattcgcc tttttcgtcc attagactat ctattgtgat
1741 ggtggattta tcacaaatgg gacccgccgc cgacagaggt gtgatgttag gccaggactt
1801 tgaaaatttg cgcaactatc gtatagtggc cgacaaattg acgccgagtt gacagactgc
1861 ctagcatttg agtgaattat gtaaggtaat gggctacact gaattggtag ctcaaactgt
1921 cagtatttat gtatatgagt gtatattttc gcataatctc agaccaatct gaagatgaaa
1981 tgggtatctg ggaatggcga aatcaaggca tcgatcgtga agtttctcat ctaagccccc
2041 atttggacgt gaatgtagac acgtcgaaat aaagatttcc gaattagaat aatttgttta
2101 ttgctttcgc ctataaatac gacggatcgt aatttgtcgt tttatcaaaa tgtactttca
2161 ttttataata acgctgcgga catctacatt tttgaattga aaaaaaattg gtaattactc
2221 tttctttttc tccatattga ccatcatact cattgctgat ccatgtagat ttcccggaca
2281 tgaagccatt tacaattgaa tatatcctgc cgccgctgcc gctttgcacc cggtggagct
2341 tgcatgttgg tttctacgca gaactgagcc ggttaggcag ataatttcca ttgagaactg
2401 agccatgtgc accttccccc caacacggtg agcgacgggg caacggagtg atccacatgg
2461 gacttttaaa catcatccgt cggatggcgt tgcgagagaa gcagtcgatc cgtgagatca
2521 gccgacgcac cgggcaggcg cgcaacacga tcgcaaagta tttgaacgca ggtacaatcg
2581 agccgacgtt cacggtaccg gaacgaccaa gcaagctagc ttagtaaagc cctcgctaga
2641 ttttaatgcg gatgttgcga ttacttcgcc aactattgcg ataacaagaa aaagccagcc
2701 tttcatgata tatctcccaa tttgtgtagg gcttattatg cacgcttaaa aataataaaa
2761 gcagacttga cctgatagtt tggctgtgag caattatgtg cttagtgcat ctaacgcttg
2821 agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc ttgaacgaat tgttagacat tatttgccga
2881 ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg
2941 aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct
3001 gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt
3061 tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc
3121 cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat
3181 cctgttcagg aaccggatca aagagttcct ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat
3241 gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga
3301 tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt ctccaaattg cagttcgcgt ttagctggat
3361 aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa caatggtgac ttctacagcg cggagaatct
3421 cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg
3481 tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc
3541 cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct
3601 cgatgacgcc aactacctct gatagttgag tcgatacttc ggcgatcacc gcttccctca
3661 tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata
3721 acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact
3781 gtaccccaaa aaaacagtca taacaagcca tgaaaaccgc cactgcgccg ttaccaccgc
3841 tgcgttcggt caaggttctg gaccagttgc gtgagcgcat acgctacttg cattacagct
3901 tacgaaccga acaggcttat gtccactggg ttcgtgcctt catccgtttc cacggtgtgc
3961 gtcacccggc aaccttgggc agcagcgaag tcgaggcatt tctgtcctgg ctggcgaacg
4021 agcgcaaggt ttcggtctcc acgcatcgtc aggcattggc ggccttgctg ttcttctacg
4081 gcaaggtgct gtgcacggat ctgccctggc ttcaggagat cggaagacct cggccgtcgc
4141 ggcgcttgcc ggtggtgctg accccggatg aagtggttcg catcctcggt tttctggaag
4201 gcgagcatcg tttgttcgcc cagcttctgt atggaacggg catgcggatc agtgagggtt
4261 tgcaactgcg ggtcaaggat ctggatttcg atcacggcac gatcatcgtg cgggagggca
4321 agggctccaa ggatcgggcc ttgatgttac ccgagagctt ggcacccagc ctgcgcgagc
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CCT GTC C TG GTT ATC GCT G
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CCA GAA GAA CCA ACA AGA AGA T
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CTC GTC TTG CAG TTC ATT
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gag agg cta ttc ggc tat
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tct gta ctt tcc tgc tgg TGGCT cca gtt c
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
aaa att gag aga agt cca cc TCGAG tct aga
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
TGC GAA AGG CCT TGT GGT AC
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
GCA CGG TCT ACG AGA CCT CC
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
aac tac tgt ctt cac gca GAAAG cgt cta g
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
acc aca agg cct ttc gcg ACCCA aca cta c
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
agc cca gaa gta ata ccc atg tt
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tcc atc cta ttt gtt cct gaa
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
agt ggg ggg aca tca agc AGCCA t gca aat
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tca tcc atc cta ttt gtt CCTGG a ggg tac
<210>16
<211>181
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc
atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
cccaatagca gccagtccct
<210>17
<211>180
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc
atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
cccaatagca gccagtccct
<210>18
<211>180
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc
atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
cccaatagca gccagtccct
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
TGTGT CTGCG GCGTT TTATC A
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tgcgctgacagccggaacac
<210>21
<211>107
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
Ctc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg
gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gccc
權(quán)利要求
1、一種PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中所用的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量的確定方法，其包括如下步驟
(1)以相同的擴(kuò)增條件，分別進(jìn)行k個(gè)相同的陰性PCR擴(kuò)增，所述陰性PCR擴(kuò)增體系中內(nèi)對(duì)照分子的加入量為No，k≥10；該陰性PCR擴(kuò)增體系包含靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)，其中不存在靶核酸；
(2)分別檢測(cè)步驟(1)的陰性PCR擴(kuò)增后是否擴(kuò)增出內(nèi)對(duì)照分子，未檢測(cè)到內(nèi)對(duì)照分子擴(kuò)增的陰性PCR擴(kuò)增的個(gè)數(shù)為t；若t＝0或者t＝k，則調(diào)整No，重新從步驟(1)開始進(jìn)行；若t＝0，提高內(nèi)對(duì)照分子的量；若t＝k，降低內(nèi)對(duì)照分子的量；
(3)根據(jù)公式(I)計(jì)算臨界量Nc
(I)；和
(4)根據(jù)Nc確定內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量，內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量介于3.0×Nc至9.2×Nc。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中k大于等于30。
3、根據(jù)權(quán)利要求1-2之任一所述的方法，其中內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量介于4.6×Nc至6.9×Nc。
4、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量為5.3×Nc。
5、權(quán)利要求1-4之任一所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量在PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的應(yīng)用。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的PCR擴(kuò)增條件為權(quán)利要求1所述方法步驟(1)所述的相同擴(kuò)增條件。
7、PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中所用內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建方法，其包括選擇候選核酸或突變候選核酸成為內(nèi)對(duì)照分子，候選核酸與靶核酸的序列同一性小于20％；所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列和靶核酸中與靶核酸引物對(duì)退火的序列是不同的，而且內(nèi)對(duì)照分子與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的退火溫度低于靶核酸與靶核酸引物對(duì)的退火溫度；
PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸時(shí)，內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量由權(quán)利要求1-4之任一所述方法確定。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中候選核酸與靶核酸的序列同一性小于10％。
9、根據(jù)權(quán)利要求7-8之任一所述的方法，其中所述的候選核酸是如Seq ID No16、Seq ID No17、Seq ID No18或Seq ID No21所示。
10、根據(jù)權(quán)利要求7-8之任一所述的方法，其中內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)序列是完全匹配的。
11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列長(zhǎng)度介于10-25個(gè)核苷酸。
12、根據(jù)權(quán)利要求7-8之任一所述的方法，其中內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)序列是不完全匹配的。
13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述內(nèi)對(duì)照分子中與內(nèi)對(duì)照引物對(duì)退火的序列長(zhǎng)度介于25-35個(gè)核苷酸。
14、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述不完全匹配的序列是3-7個(gè)連續(xù)的A或T。
15、權(quán)利要求7-14之任一所述方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子在PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的應(yīng)用。
16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是不同的。
17、根據(jù)權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中靶核酸引物對(duì)和內(nèi)對(duì)照引物對(duì)是相同的。
18、PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其包括如下步驟
(1)對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系包含樣品、靶核酸引物對(duì)、內(nèi)對(duì)照分子、內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的正向引物；
(2)步驟(1)完成后，加入內(nèi)對(duì)照引物對(duì)的反向引物，繼續(xù)對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和
(3)步驟(2)完成后，檢測(cè)是否有擴(kuò)增的靶核酸；
其中內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量為權(quán)利要求1-4之任一所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。
19、根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中內(nèi)對(duì)照分子為權(quán)利要求7-14之任一所述方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子。
20、PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，其中PCR擴(kuò)增中使用內(nèi)對(duì)照分子，其特征在于，
所述內(nèi)對(duì)照分子為權(quán)利要求7-14之任一所述方法構(gòu)建的內(nèi)對(duì)照分子；和/或
所述內(nèi)對(duì)照分子的使用量為權(quán)利要求1-4之任一所述方法確定的內(nèi)對(duì)照分子的優(yōu)化量。
21、根據(jù)權(quán)利要求18-20之任一所述的方法，其中所述的內(nèi)對(duì)照分子如Seq ID No16、SeqID No17、Seq ID No18或Seq ID No21所示。
22、用于權(quán)利要求18-20之任一所述PCR定性檢測(cè)樣品中靶核酸的方法中的檢測(cè)試劑盒；所述試劑盒包含SeqID No16、Seq ID No17、Seq ID No18和Seq ID No21所示核酸分子之一或全部。
全文摘要
本發(fā)明涉及聚合酶鏈反應(yīng)體系中內(nèi)對(duì)照分子的定量方法和內(nèi)對(duì)照分子的構(gòu)建方法、以及基于其得到的量和/或內(nèi)對(duì)照分子的核酸擴(kuò)增方法和相應(yīng)檢測(cè)試劑盒。另外，本發(fā)明還涉及二步法PCR擴(kuò)增方法和內(nèi)對(duì)照分子或試劑盒的應(yīng)用等。上述方法用以提高檢測(cè)靈敏度和/或兼顧檢測(cè)靈敏度和表征假陰性結(jié)果的可靠性，并可以靈活適應(yīng)PCR擴(kuò)增體系和檢測(cè)方式的改變。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101492744SQ20091011925
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者李丙亮, 楊國翠, 張文艷, 李振勇, 黃道培 申請(qǐng)人:上海浩源生物科技有限公司