專利名稱：具有改變的特性的變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親代Termamyl樣a-淀粉酶的變體(突變體)，這些變體具有 a淀粉酶的活性，并且在如下幾方面的性質(zhì)中，顯示出至少一種與所述親 代a淀粉酶有所不同底物特異性，底物結(jié)合性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定 性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對(duì)氧化的穩(wěn)定性，Ca^依賴 性，比活性，和溶解度，特別是在生產(chǎn)與應(yīng)用環(huán)境下。
背景技術(shù)：
cc淀粉酶(oc-l，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C. 3.2丄1)組成一組催化淀 粉和其它直鏈和支鏈1,4-糖苷鍵寡糖和多糖水解的酶。
在現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)中，在發(fā)酵、純化、回收過程的中和產(chǎn)物配制中可 出現(xiàn)高蛋白濃度。
在發(fā)酵過程中，蛋白的濃度取決于所用的宿主細(xì)胞。在工業(yè)生產(chǎn)過程中， 蛋白濃度一般為0.1克/升發(fā)酵液以上。而在芽孢桿菌中大量重組生產(chǎn)ot-淀粉 酶時(shí)，蛋白濃度可高達(dá)250克/升發(fā)酵液。經(jīng)過純化，蛋白濃度可以達(dá)到大 約1000克/升水平。這樣的高濃度導(dǎo)致不希望有的沉淀，而使得活性蛋白丟 失。增加產(chǎn)物的強(qiáng)度是目前的趨勢(shì)，這種增加的強(qiáng)度可使酶在更重要的溶 液中得以維持。蛋白溶液濃度的升高通常導(dǎo)致蛋白的沉淀，而沉淀的蛋白 很難溶解成活性蛋白。
所以，本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有以下改變的特性的a-淀粉酶，特別是
使其溶解度增加。 發(fā)明筒述
8本發(fā)明的目的是提供Termamyl樣淀粉酶的變體，它們與相應(yīng)親代a-淀 粉酶即未突變的a淀粉酶相比，具有a-淀粉酶活性，并且相對(duì)于親代a-淀 粉酶，顯示如下性質(zhì)中至少一種性質(zhì)的改變底物特異性，底物結(jié)合性，底 物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對(duì)氧化 的穩(wěn)定性，Ca"依賴性，比活性和溶解度，特別是在制備條件下的溶解度。
命名法
在本說明書和權(quán)利要求中，用到了常用的1個(gè)字母和3個(gè)字母的氨基 酸代碼。為便于參考，本發(fā)明中的oc-淀粉酶變體用下面的命名法來描述 原氨基酸位置取代的氨基酸
依照這種命名法，舉例來說，將第30位的丙氨酸取代為天冬酰胺，表 示為Ala30Asn或A3 ON
在相同位置缺失丙氨酸表示為 Ala30承或A30*
插入另外一個(gè)氨基酸殘基，如賴氨酸，表示為 Ala30AlaLys或A30AK
一段連續(xù)的氨基酸殘基的缺失，例如，第30-33位的氨基酸殘基被缺失， 表示為(30-33)承或A(A30-N33)。
當(dāng)某一oc-淀粉酶與其他a-淀粉酶相比有一個(gè)"缺失"，并在該位置上 又插入了 一個(gè)氨基酸則表示為
*36Asp或承36D
即，在第36位插入了天冬氨酸。 多突變凈皮"+"號(hào)分隔開，如 Ala30Asp + Glu34Ser或A30N+E34S
代表第30位的丙氨酸和第34位的谷氨酸分別被天冬酰胺和絲氨酸取代。
當(dāng)一個(gè)或多個(gè)可選擇的氨基酸殘基插入同一給定位點(diǎn)時(shí)，表示為 A30N，E或 A30N或A30E
另外，當(dāng)本文中鑒定出 一個(gè)適于修飾的位點(diǎn)而沒有提示任何特定的修飾 時(shí)，應(yīng)理解為任何一個(gè)氨基酸殘基都可以取代這個(gè)位點(diǎn)上現(xiàn)有的氨基酸。例30的丙氨酸的修飾，而又沒有特別指明進(jìn)行何種修飾時(shí)，
應(yīng)理解為該丙氨酸可以被缺失或被下列任何一個(gè)氨基酸所取代 R，N,D，A,C，Q,E孤I，L，K,M,F,P，S,T，W，Y,V。 進(jìn)一步的，"A30X"代表下列任何一種取代
A30R， A30N, A30D, A30C， A30Q， A30E， A30G， A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P， A30S， A30T, A30W, A30Y，或A30V;或簡(jiǎn)寫為 A30R,N,D，C,Q,E,GH,I，L,K，M,F，P,S,T，W,Y，V。


圖1是五種親代Termamyl樣ct-淀粉酶氨基酸序列的比對(duì)。最左邊的數(shù) 字分別代表如下的氨基酸序列 1: SEQIDNO:4(SP722) 2:SEQ IDNO:2(SP690) 3: SEQIDNO: 10 (BAN) 4: SEQ ID NO: 8 (BLA) 5: SEQ ID NO: 6(BSG)。
圖2顯示由4個(gè)酶分子組成的晶格的格點(diǎn)視圖。每個(gè)分子都有8個(gè)相 互作用的區(qū)域。
圖3顯示由4個(gè)酶分子組成的晶格的頂視圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的目的是提供多肽(如酶，特別是a -淀粉酶)，這些多肽相對(duì)于 所述親代多肽在如下性質(zhì)中有至少一種性質(zhì)改變底物特異性，底物結(jié)合 性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線， 針對(duì)氧化的穩(wěn)定性，Ca"依賴性，比活性和溶解度，特別是在制備條件下的 溶解度。以下有對(duì)這些性質(zhì)的進(jìn)一步描述。
多肽
本發(fā)明的多肽包括具有生物活性，抗微生物活性，和酶活性的蛋白質(zhì)。 涉及的酶活性包括蛋白酶，淀粉酶，CGT酶(CGTase)，甘露聚糖酶 (mannanase), 產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenic amylase), 葡萄糖淀粉酶，糖酶 (carbohydrase)，轉(zhuǎn)移酶，裂解酶，氧化還原酶，脂肪酶的活性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶是一種a-淀粉酶，特別是芽孢桿菌屬 或曲霉屬a-淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬a-淀粉酶是 Termamyl樣淀粉酶。
具有生物活性的多肽包括紅細(xì)胞生成素(EPO), TPO，生長(zhǎng)激素，調(diào)節(jié) 肽，凝血因子，抗體等。
改變了溶解度的多肽
蛋白(多肽)晶體是由系統(tǒng)排列的相同單位在三維結(jié)構(gòu)上緊密堆積而成。 晶格可以包含一個(gè)或多個(gè)蛋白分子和大量的水。在三級(jí)結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)有離 子例如4丐離子，鈉離子，氯離子，硫酸根離子和較大的分子如表面活性劑 和底物(在晶體生長(zhǎng)過程中出現(xiàn))。雖然單個(gè)分子和單個(gè)原子很小，但相同單 位的重復(fù)排列有利于進(jìn)行X-線衍射，從而為蛋白質(zhì)工程提供結(jié)構(gòu)信息。
相對(duì)于晶體來說，沉淀物與聚集體是較小的單位，并且單個(gè)分子比在
晶體中時(shí)更加無序。然而分子間的某些作用與在非常有序的晶體中所見相 同，并因此可用三級(jí)結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))和分子間信息來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程改造 的、具有改變的特性的ot-淀粉酶變體，所述特性特別是沉淀趨勢(shì)下降，即 溶解度增加。
由于蛋白分子為球形和通常有不規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)，晶格中會(huì)出現(xiàn)大孔， 這些大孔被更加雜亂的溶劑如水占據(jù)。實(shí)際上，大多數(shù)蛋白質(zhì)表面都覆蓋 著水層，這就是為什么通過X光晶體學(xué)方法得到的蛋白結(jié)構(gòu)與溶液中的蛋 白結(jié)構(gòu)相同的一個(gè)原因。蛋白分子只在極少區(qū)域直接相互接觸，但溶劑介 導(dǎo)的接觸可以象"膠水，， 一樣把晶體粘在一起。
通常，蛋白的溶解度受有機(jī)溶劑，鹽類如硫酸銨、氯化鈉和氯化4丐， 和改變分子表面電荷的pH變化的影響。這些因素在將酶維持于溶液中的酶 生產(chǎn)以及得到有效晶體的結(jié)晶學(xué)實(shí)驗(yàn)中都有涉及。大的對(duì)稱晶體需要緩慢 增加蛋白質(zhì)濃度或者改變蛋白表面來加強(qiáng)分子間相互接觸而得到。
不是所有的蛋白都結(jié)晶為有效于X光晶體學(xué)確定方法的形式，但是， 如果模板分子與目的分子的同源性足夠高，那么根據(jù)已有的三級(jí)結(jié)構(gòu)，可 以建立精確的模型。
當(dāng)同源多肽(如酶，特別是以下定義的Termamyl樣oc-淀粉酶)在三級(jí)結(jié) 構(gòu)基礎(chǔ)上相比較時(shí)，最主要差異在于分子表面。盡管如此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Termamyl樣cc-淀粉酶(SP722，公開于SEQ IDNO:4)表面的(直接或通過水分子間接)參與晶體形成的氨基酸殘基，在其 它Termamyl樣oc淀粉酶的晶體形成中(以下描述)也起了關(guān)鍵作用。
以下描述了用另一種Termamyl樣oc淀粉酶結(jié)構(gòu)(SP722結(jié)構(gòu)，附錄1中 公開)建立一個(gè)Termamyl樣a淀粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)^^莫型的實(shí)例。
可以理解，本發(fā)明的概念與以下描述的建模方法可以推廣到所有的多肽， 蛋白，特別是酶，如ot淀粉酶。
SP722的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及對(duì)另 一種Termamyl樣oc淀粉酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的建模
本發(fā)明的a淀粉酶突變體是基于附錄1中SP722(SEQIDNO: 4)的三級(jí) 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的，其它多肽的突變體通過其它的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)。堿性Termamyl 樣a-淀粉酶的結(jié)晶(SP722)(如SEQ ID NO: 4中顯示，也在美國(guó)專利 5,824,531中有描述)是用懸滴法(本領(lǐng)域已知的方法)得到的，其三級(jí)結(jié)構(gòu)(三 維結(jié)構(gòu))見本文附錄l。
其晶格包含4個(gè)酶分子，每個(gè)分子有8個(gè)相互作用的區(qū)域(圖2和圖3)。 其中兩個(gè)區(qū)域被確定在酶的圍繞活性位點(diǎn)的一側(cè)，在ct -淀粉酶上相對(duì)于活性 位點(diǎn)的背側(cè)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大的區(qū)域。所述側(cè)還有兩個(gè)相互作用的區(qū)域，分子的 頂部和底部各有一個(gè)相互作用的側(cè)面，形成"頂，，對(duì)"底"的相互作用。
可以從圖2看出兩個(gè)環(huán)繞活性位點(diǎn)的相互作用區(qū)域與一個(gè)反向平行的 相鄰分子上的兩個(gè)相同區(qū)域之間相互作用。同樣，背側(cè)區(qū)域與第三個(gè)反向 平行的淀粉酶分子上的背側(cè)區(qū)域相接觸，但所有這些接觸都是由水分子介 導(dǎo)。還可以從圖2、圖3看出相互作用的區(qū)域分散在整個(gè)分子。
另 一堿性Termamyl樣oc -淀粉酶模型AA560是基于附錄1公開的SP722 的三級(jí)結(jié)構(gòu)建立的。a-淀粉酶AA560與模板淀粉酶(SP722)大約有87%相 同，且序列對(duì)比排列不含有插入或缺失。在蛋白的生產(chǎn)過程中，即從發(fā)酵 到純化的過程中，由于存在高度的同源性(同一性)，相同的對(duì)稱性和相同的 晶體間相互作用，蛋白表面相同的相互作用區(qū)域參與蛋白濃度增加情況下 的晶體形成和沉淀(參見背景章節(jié))。
在這些相互作用區(qū)域中構(gòu)建突變，表達(dá)并純化酶，用"材料與方法" 章節(jié)中描述的方法，在實(shí)施例8和實(shí)施例9描述的不同條件下，對(duì)蛋白溶 解度進(jìn)行^r測(cè)。
12本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用于如下Termamyl樣ct -淀粉酶與SEQ ID NO: 12所示的Termamyl樣a-淀粉酶至少60%相同，優(yōu)選至少70%相同，更優(yōu) 選80%相同，甚至更優(yōu)選85%相同，甚至更優(yōu)選90°/。相同，甚至95%相同， 甚至97。/。相同，甚至99°/。相同。這些發(fā)現(xiàn)優(yōu)選適用于堿性Termamyl樣oc-淀 粉酶，特別是那些與SP722(SEQIDNO:4，在圖1的序列對(duì)比中顯示為1號(hào) 的序列)比較時(shí)，在對(duì)比的一級(jí)結(jié)構(gòu)中沒有添加或缺失氨基酸的，長(zhǎng)度相同 的堿性Termamyl樣ot -淀粉酶。這些發(fā)現(xiàn)尤其可以用于以下堿性Termamyl 樣oc-淀粉酶SP690(SEQ ID NO: 2)， SP722(SEQ ID NO: 4), AA560(SEQ ID NO: 12), #707 cc-淀粉酶(SEQ ID NO: 13)，公開在KSM AP1378中的KSM APE 1738 a-淀粉酶，WO 97/11324中公開的a -淀粉酶，或者它們的片段 或截短形式。后面提到的這些堿性Termamyl樣a淀粉酶在上述相互作用的 區(qū)域周圍有非常類似的晶體三級(jí)結(jié)構(gòu)，而且有485個(gè)氨基酸長(zhǎng)的相同的一 級(jí)結(jié)構(gòu)。
與此不同的是，例如，Te腿myl(圖1的對(duì)比中序列號(hào)為4的序列)與 SP722對(duì)比排列時(shí)，缺少兩個(gè)氨基酸殘基(l位和2位)；在174位和181-182 位有缺口 ；在378-381位多了 3個(gè)氨基酸殘基。
BAN(圖1的對(duì)比中序列號(hào)為3的序列)與SP722對(duì)比缺少5個(gè)氨基酸殘 基(1_4位和488位)；在174位、181-182位有缺口；在378-381位多了 3個(gè) 氨基酸殘基。
BSG(圖1的對(duì)比中序列號(hào)為5的序列)與SP722對(duì)比缺少1個(gè)氨基酸殘 基(l位)；在489-519位多了 31個(gè)氨基酸殘基。
KSM-K36和KSM-K38(EP 1,022，334-A)與SP722對(duì)比缺少5個(gè)氨基酸 殘基(1位和2位)，并在174位、181-182位有缺口。
AA180, AA20和Amrk385(丹麥專利申請(qǐng)PA 2000 00347或 PCT/DK01/00133)與SP722對(duì)比在261位多了 一個(gè)氨基酸。
以下描述如何根據(jù)一種Termamyl樣a -淀壽分酶建立另 一種Termamyl樣 cc-淀粉酶的模型。在實(shí)施例4中描述了根據(jù)SP722建立AA560的模型。這 種方法可以推廣用于其它的多肽如以上所提到的多肽。
Termamyl樣oc -淀粉酶才莫型的建立
WO 96/23874提供了 Termamyl樣a -淀粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))和X 光晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，所述Termamyl樣a-淀粉酶由解淀粉芽孢桿菌cc-淀粉酶(BANTM)N末端的300個(gè)氨基酸殘基和地衣芽孢桿菌a-淀粉酶(SEQ ID NO: 8)C末端301-483位氨基酸殘基組成。WO 96/23874進(jìn)一步描述了 ，在分析親 代Termamyl樣a -淀粉酶的結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，建立該親代Termamyl樣cc -淀粉 酶的相對(duì)于其親代特性已改變的變體的模型的方法。
依照WO 96/23874可以建立其它Termamyl樣結(jié)構(gòu)模型，該文獻(xiàn)納入本 文作為參考。
至于獲得本發(fā)明的變體，如實(shí)施例l所述，基于SP722的三級(jí)結(jié)構(gòu)(附 錄l中公開)設(shè)計(jì)了 AA560的三級(jí)結(jié)構(gòu)(建模)。其它Termamyl樣oc-淀粉酶(例 如本文^^開的)的結(jié)構(gòu)可以用類似的方法建立。
Termamyl樣oc淀粉酶
芽孢桿菌菌林產(chǎn)生的多種oc淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源(相同) 的。多種芽孢桿菌oc-淀粉酶的同一性可從以下表l中觀察到 表1
百分比 同一性
707AP1378BANBSGSP690SP722AA560Terma
707100.086.466.966.587.686.295.568.1
AP137886.4100.067.168.195.186.686.069.4
BAN66.967.1100.065.667.168.866.980.7
BSG66.568.165.6100.067.967.166.365.4
SP69087.695.167.167.9100.087.287.069.2
SP72286.286.668.867.187.2100.086.870.8
AA56095.586.066.966.387.086.8100.068.3
Termamyl68.169.480.765.469.270.868.3100.0
例如，地衣芽孢桿菌oc淀粉酶包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(可 以TermamyFM商品名購(gòu)買到)，已發(fā)現(xiàn)其與包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序 列的解淀粉芽孢桿菌cc -淀粉酶有約81%的同源性，與包含SEQ ID NO:6所 示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌的oc-淀粉酶有約65%的同源性。其它同 源的a淀粉酶包括WO 95/26397中公開的SP690和SP722，本文中SEQ ID NO:2和SEQIDNO:4分別對(duì)它們進(jìn)行了的描述。其它淀粉酶有來源于芽孢 桿菌的AA560 a -淀粉酶(SEQ ID NO:12)和來源于芽孢桿菌的^707 a -淀粉酶(顯示在SEQ ID NO: 13)， Tsukamoto et al" Biochemical and Biophysical Research Communications, 151(1988)， pp. 25-31只于it匕有4苗述。
KSM AP1378 a-淀粉酶公開于WO 97/00324(來自KAO公司)。另外， EP1，022，334中公開了 K38和K38oc-淀粉酶，對(duì)此本發(fā)明也有涉及。
其他同源的oc-淀粉酶包括由EP 0252666描述的地衣芽孢桿菌菌抹 (ATCC 2781 l)產(chǎn)生的a -淀粉酶，以及WO 91/00353和WO 94/18314中所確 定的oc-淀粉酶。其它商品化的Termamyl樣a-淀粉酶包括用以下商品名稱 出售的產(chǎn)品Optitherm 和TakathermTM(SoIvay出品)；MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor出品)，Spezym AA 和Spezyme AAATM(Genencor出品), 還有Keistase (Daiwa出品)，Purastar ST 5000E, PURASTRA HPAM L(Genencor Int.出品)。
由于這些a淀粉酶的結(jié)構(gòu)同源性，所以它們被認(rèn)為屬于同 一類ct -淀粉 酶，即"Termamyl樣oc-淀粉酶"。
因此，本文術(shù)語"Termamyl樣cc-淀粉酶"意指那些在氨基酸水平上與 Termamyl ,即具有本文SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌oc -淀粉酶基本相同的cx -淀粉酶。
換言之，以下所有具有本文SEQ ID NO: 2， 4, 6, 8, 10, 12,和13所示氨基 酸序列的a -淀粉酶，被認(rèn)為是"Termamyl樣oc -淀粉酶"。其它Termamyl樣 oc-淀粉酶是如下a-淀粉酶i)與上述SEQIDNO:2，4, 6，8, 10, 12，和13所 示氨基酸序列中至少一種氨基酸序列有至少60%,如至少70%,例如至少 75%,或至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少97%,至少99% 的同源性，和/或ii)由能與編碼上述a-淀粉酶的DNA序歹'J(本說明書中SEQ ID NO: 1, 3， 5， 7, 9,它們分別編碼本文SEQ ID NO: 2, 4, 6， 8, 10, 12所示氨基 酸序列)雜交的DNA序列編碼。
關(guān)于特性i)，同源性是兩個(gè)序列之間提示第一個(gè)序列從第二個(gè)序列衍生的 同一性程度。同源性可通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序如GCG軟件包提供的 GAP程序適當(dāng)確定(如上所述)。這時(shí)，Gap GCGv8可以用如下默認(rèn)參數(shù)缺 口產(chǎn)生罰分為5.0，缺口延伸罰分為0.3,默認(rèn)得分矩陣，對(duì)核酸序列和蛋白質(zhì) 序列分別為3.0和0.1 。 GAP用Needleman/Wunsch/Sellers方法進(jìn)行排列對(duì)比。
Termamyl(SEQ ID NO: 8)和另 一種Termamyl樣oc -淀4分酶的結(jié)構(gòu)對(duì)比可 以用來確定其它Termamyl樣cx-淀粉酶中等效的/相應(yīng)的位置。 一種獲得所
15述結(jié)構(gòu)對(duì)比的方法是應(yīng)用GCG軟件包的PileUp程序，采用缺口罰分默認(rèn)值， 即缺口產(chǎn)生罰分用3.0,缺口延伸罰分用O.l。其它結(jié)構(gòu)對(duì)比方法包括疏水簇 分析(Gaboriaudetal.， (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155)和反向穿 梭(reversethreading)法(Huber, T;Tord, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7， No. 1 pp. 142-149(1998)。 雜交
用于鑒定多肽，如具有以上ii)特性的Termamyl樣oc -淀粉酶的寡核苷酸 探針，可以在所述oc-淀粉酶的全部或部分核普酸或氨基酸序列基礎(chǔ)上適當(dāng)制備。
雜交檢測(cè)的適當(dāng)條件包括在5xSSC中預(yù)浸泡，于 40。C,在含有20%曱 酰胺，5xDenhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH 6.8,和50mg變性的超聲波處理的 小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交1小時(shí)，然后于 40。C,在補(bǔ)充有l(wèi)OOmMATP 的上述相同溶液中雜交18小時(shí)，再于40。C，用2xSSC， 0.2。/。SDS洗濾膜 三次，每次30分鐘(低嚴(yán)緊度)，優(yōu)選在50。C(中等嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選在65。C(高 嚴(yán)緊度)，甚至更優(yōu)選在約75。C(極高嚴(yán)緊度)進(jìn)行洗滌。雜交方法的更多細(xì) 節(jié)描述于Sambrook等，Molecular_Cloning: A Laboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor, 1989。
本文中，"衍生" 一詞不僅指所述菌抹產(chǎn)生或可誘導(dǎo)產(chǎn)生的a-淀粉酶， 還指由分離自這種菌抹的DNA序列編碼的oc-淀粉酶和在所述DNA序列轉(zhuǎn) 化的宿主生物中產(chǎn)生的ct-淀粉酶。該術(shù)語還指由合成的和/或cDNA來源的 DNA序列編碼的a -淀粉酶，其有所述ot淀粉酶的可鑒別的特征。該術(shù)語也 指親代a-淀粉酶的天然產(chǎn)生的變體，即天然產(chǎn)生的ot-淀粉酶經(jīng)一個(gè)或多個(gè) (幾個(gè))氨基酸殘基的修飾(插入，取代，缺失)后產(chǎn)生的變體。
親代Termamyl樣a -淀粉酶
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的所有Termamyl樣cc-淀粉酶，都可以作為親代 (即，骨架(backbone))a-淀粉酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，親代a-淀粉 酶衍生自地衣芽孢桿菌，例如，上述那些cc-淀粉酶之一，如具有SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶。尤其優(yōu)選的親代a-淀粉酶是 SP722a-淀粉酶和AA560oc-淀粉酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，親代a-淀粉酶有 一個(gè)或多個(gè)以下突變/取代A(R81-G182); A(D183-G184); A(D183-G184)+N195F; RR181Q+N445Q+K446N; A(D183-G184)+R181Q。親代雜合體Termamyl樣a -淀粉酶
親代oc -淀粉酶(即骨架cc -淀粉酶)也可以是雜合體oc -淀粉酶，即包含來 自至少兩種a-淀粉酶的部分氨基酸序列之組合的cc-淀粉酶。
親代雜合體oc -淀粉酶可以是這樣一種oc -淀粉酶，在氨基酸序列同源性 (同一性)和/或DNA雜交(如以上所確定的)基礎(chǔ)上，能確定其屬于Termamyl 樣cc-淀粉酶家族。在此情況下，雜合體cx-淀粉酶通常由以下部分組成 Termamyl樣oc -淀粉酶的至少一部分和從孩史生物(細(xì)菌或真菌)和/或哺乳動(dòng)物 來源的Termamyl樣a -淀粉酶或非Termamyl樣oc -淀粉酶中選定的一種或多 種其它的a-淀粉酶的部分。
所以，親代雜合體a -淀粉酶可包含來源于至少兩種Termamyl樣a -淀 粉酶，或來源于至少一種Termamyl樣和至少一種非Termamyl樣細(xì)菌ot-淀 粉酶，或來源于至少 一種Termamyl樣a-淀粉酶和至少 一種真菌a -淀粉酶的 部分氨基酸序列的組合。作為部分氨基酸序列的來源的Termamyl樣cc-淀粉 酶，可以是本文所涉及的那些具體Termamyl樣oc -淀粉酶中的任何一種。
例如，親代cc -淀粉酶可以包含來源于地衣芽孢桿菌菌抹a -淀粉酶的C 末端部分和來源于解淀粉芽孢桿菌菌林或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株a-淀粉酶 的N末端部分。例如，親代a-淀粉酶可包含地衣芽孢桿菌oc-淀粉酶的C末 端部分至少430個(gè)氨基酸，并且可包含a)相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的ot -淀粉酶N末端37個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段， 和相當(dāng)于地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的cc -淀粉酶C末 端445個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段，或與該Termamyl序列相同的雜合體 Termamyl樣a-淀粉酶，即SEQ ID NO: 8所示地衣芽孢桿菌a-淀粉酶，但 其成熟蛋白的N末端35個(gè)氨基酸殘基，已被BAN(成熟蛋白)即SEQ ID NO: 10所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶N末端33個(gè)殘基取代；或b)相當(dāng)于 嗜熱脂肪芽胞桿菌具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的cc -淀粉酶N末端68 個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段和相當(dāng)于地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 8所示 氨基S吏序列的a -淀粉酶C末端415個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段。
另一種適合的親代雜合體a-淀粉酶是此前WO 96/23874(出自Novo Nordisk)中描述的，其由BAN,解淀粉芽孢桿菌cc -淀粉酶的N末端(成熟蛋 白的1-300位氨基酸)和Termamyl的C末端(成熟蛋白的301-483位氨基酸) 構(gòu)成。改變的特性
以下討論表現(xiàn)為本發(fā)明變體的突變和其所導(dǎo)致的所需特性改變(相對(duì)于
親 Termamyl樣a —淀4分酶)之間的相互關(guān)系，
如上所述，本發(fā)明涉及特性改變的，特別是在生產(chǎn)條件下特性改變的 Termamyl樣oc -淀粉酶。
涉及到改變的特性時(shí)，尤其涉及的親代Termamyl樣cc -淀粉酶是上述提 到的親代Termamyl樣a-淀粉酶和親代雜合體Termamyl樣cx-淀粉酶。以 SP722ot-淀粉酶作為起點(diǎn)，但例如Termamyl, BSQ BAN, AA560, SP690, AA180，KSM，AP1378，和#707, K38，和K36的相應(yīng)位點(diǎn)也應(yīng)理解為已公開。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體的溶解度已經(jīng)增加，尤其是在洗滌或 清洗條件下。
本發(fā)明 一方面涉及上述具有特性改變的變體。
第一方面，親代Termamyl樣cc-淀粉酶的變體在選自下組的一個(gè)或多個(gè) 位點(diǎn)(用SEQIDNO: 12的氨基酸編號(hào))包含改變
R28, R118， N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400， W439, R444, N445, K446, Q449, R458， N471, N484,
其中
(a) 所述每一改變是
(i)在占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸下游插入一個(gè)氨基酸，
Cii)缺失占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，或
(iii)用另一氨基酸取代占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，
(b) 變體有a淀粉酶活性和
(c) 每一位點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于具有SEQIDNO: U所示AA560氨基酸序列的親 代Termamyl樣a -淀粉酶的氨基酸序列位點(diǎn)。
在SP722(SEQ ID NO: 4)中，這種相應(yīng)位點(diǎn)是R28; N94; LI 18; N125; Q174; R181; G182; D183; G184; A186; W189; N195， M202， Y298; N299;畫2; S303;畫6; A310; N314; K320; H324; Q345; F396, T400, W439, Q444; N445, K446, Q449, K458; N471; K484。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體有一個(gè)或多個(gè)如下突變/取代(用SEQ ID NO: 12的編號(hào))△G184; A(R181-G182); A(D183-G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A,R,K; N174D; R181Q，E,K; G186R; W189R，K; N195F; M202L; Y298H,F: N299A; K302R; S303Q; N306QD,R,K; R31 OA,K,Q,E，H,D，N; N314D; R320K; H324K; E345R,D,K,N; Y396F;諸OT,K; W439R; R444K; N445K,Q; K446N: Q449E; R458K; N471E; N484Q。
優(yōu)選的雙重，三重和多重突變(以SEQIDNO: 12為編號(hào)J^出)包括
A(D183-G184)+R181Q;
A(D183-G184)+G186R;
A(D183-G184)+N195F;
A(D183-G184)+M202L;
△(D183-G184)+G 186R+N195F;
△(D183-G184)+N 195F+R400T;
A(D183-G184)+N195F+W439R;
△(D183-G 184)+Nl 95F+Q449E;
△(D183-G 184)+Nl 95F+N484Q;
△(D183 -G184)+N 195F+K446N;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+N484E;
△(Dl 83-G184)+N195F+N445Q+K446N+Q449E;
A(D183-G184)+N195F+N471E;
A(D183-G184)+N195F+H324K;
A(D183-G184)+N195F+Y396F;
A(D 183-G184)+脂5F+K446D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q;
A(D183-G184)+N195F+R181E;
△(D183-G184)+N 195F+N445Q+K446N;
N445Q+K446N;
N445Q+K446N+N484E;
N445Q+K446N+Q449E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181 Q+N445Q+K446N;
A(D 183-G184)+N 195F+R181 Q+K446N;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+固4E;△(D183-G 184)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N;
A(D 183-G 184)+Nl 95F+R181E+K446N;
△(Dl 83-G 184)+N 195F+R181E+N445Q+K446N+N484E;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N445Q+K446N+Y243F;
△(D183 -G184)+N 195F+N445 Q+K446N+V209I;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+E212R;
A(D183-G184)+N195F+M116R;
A(D183-G184)+N195F+K142H+D144H+R158H;
A(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+K142H+D144H;
A(D183-G184)+N195F+R158H;
A(D183-G184)+N195F+E345R;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+W189R;
A(D 183-G184)+Nl 95F+Y298H;
△(D183-G 184)+Nl 95F+N299A;
△(D183 -G184)+N 195F+K3 02R+S3 03Q;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N306G;
△(D183-G184)+N195F+Y298H+N299A+K302R+S303Q+N306G;
△(D183-G184)+N195F+N125A;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N125R;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R310A;
A(D 183 -G184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R310A+Q311N;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R320K;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D;
△(D183-G184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306A;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+K302N;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+Y298F;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N;
A(D 183-G 184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R31 OA;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D+N306D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D;A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306D; N174D+N314D;
△(D183-G184)+Nl 95F+畫6D+R310H+E345D;
A(D183-G184)+Rl 81Q+N195F+W189R+S94K;
△(D183 -G184)+R 181Q+W189R+S94K;
△(D183-G 184)+Nl 95F+R181 Q+S94K;
△(Dl 83-G184)+N195F+Rl 81K+N125R;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181K+N125K;
△(Dl 83-G184)+N195F+Rl 18K+R320K+R458K;
A(D 183 -G184)+R 181Q+N195F+R118K+R320K+R45 8K;
△(Dl 83-G184)+Nl 95F+R181 Q+N306G;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+W189R;
A(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125K+R444K+N445K A(D 183-G 184)+Rl 81Q+N195F+R118K+N125K+R320K+R45 8K; A(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125R+R320K+R458K; △(D183-G 184)+Rl 81Q+N195F+S94K+R118K+R320K+R458K; A(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N306R+R320K+R458K; △(Dl 83-G184)+N195F+Rl 18K+R320K+R458K+R444K+N445K; A(D183-Gl 84)+N195F+S94K+Rl 18K+N306R+R320K+R458K;
考慮的變體包括在實(shí)施例中提到的具體變體和上述突變與一種或多種 如下突變/取代的進(jìn)一步組合A(D183-G184);N195F;R181Q;G186R; M202L; V206F,L，M;N193S,T，P。
增加的溶解度
當(dāng)把所有上述突變?nèi)缦滤鲇糜谝唤MTermamyl樣cc-淀粉酶中的任何 一種a -淀粉酶，都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生溶解度改變的Termamyl樣cc -淀粉酶變體。
所以，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體是親代Termamyl樣oc-淀粉酶 的變體，其與親代Termamyl樣cc-淀粉酶相比，溶解度已提高(如上定義)， 并包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的改變(用SEQ ID NO: 12進(jìn)行氨基酸編 號(hào))R28, R118, N174， R181， G182, D183， G184, G186， W189, N195, M202: Y298, N299, K302, S303, N306， R310, N314, R320, H324, E345, Y396， R40O W439， R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484,
其中
(a) 所述每一改變是
(i) 在占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸下游插入一個(gè)氨基酸，
(ii) 缺失占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，或
(iii) 用另一氨基酸取代占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，
(b) 變體有cc淀粉酶活性和
(c)每一位點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于具有SEQIDNO: 12所示AA560氨基酸序列的親 代Termamyl樣oc -淀粉酶的氨基酸序列位點(diǎn)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中溶解度增加的變體與親代oc -淀粉酶相比 具有一種或多種如下^F又代
△G184; A(R181-G182); A(D183-G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A,R， K; N174D; R181Q,E，K; G186R; W189R,K; N195F; M202L; Y298H,F; N299A; K302R; S303Q; N306QD,R,K; R310A,K,Q,E,H,D,N; N314D; R320K; H324K; E345R,D，K,N; Y396F;體0T，K; W439R; R444K; N445K,Q; K446N; Q449E; R458K; N471E; N484Q。
在更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明溶解度增加的變體(由"材料與方法"部 分描述的方法之一確定)包括(以SEQIDNO: 12為&出編號(hào))
A(D183-G184)+R181Q;
A(D183-G184)+G186R;
A(D183-G184)+N195F;
A(D183-G184)+M202L;
A(D183-G184)+G186R+N195F;
A(D183-G184)+N195F+R400T;
A(D183-G184)+N195F+W439R;
A(D183-G184)+Nl 95F+Q449E;
A(D183-G184)+N195F+N484Q;
△(D183-G184)+N 195F+K446N;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+N484E△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N445Q+K446N+Q449E;
A(D 183-G 184)+N 195F+N471E;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+H324K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y396F;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+K446D;
△(D183-G184)+N195F+R181Q;
A(D183-G184)+N195F+R181E;
△(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N;
N445Q+K446N;
N445Q+K446N+N484E;
N445Q+K446N+Q449E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N; A(D 183陽G 184)+N 195F+R181Q+K446N; A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N484E; A(D183-G184)+N195F+R181E+N445Q+K446N; A(D 183 -G184)+N 195F+R181E+K446N; A(D183-G184)+N195F+R181E+N445Q+K446N+N484E; A(D 183 -G184)+N 195F+N445Q+K446N+Y243F; △(Dl 83-Gl 84)+N195F+N445Q+K446N+V209I; A(D 183 -G184)+N 195F+E212R; △(Dl 83-Gl 84)+N195F+M116R; A(D 183 -Gl 84)+N 195F+K142H+D144H+R15 8H; △(D183 -G184)+N 195F+K142H+D1楊； A(D183-G184)+N195F+R158H; △(Dl 83-Gl 84)+N195F+E345R; △(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+W189R; △(D183 -G184)+N 195F+Y298H; A(D183-G184)+N195F+N299A; △(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+K302R+S303Q; A(D183-G184)+N195F+N306G; △(D183-
23△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N125A; △(D183-G184)+N195F+N125R;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R310A;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R320K;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306A;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+K302N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+E345N;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+Y298F;
△(D183-G 184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R28N;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+R28N+R31 OA;
△(D183-G184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D+N3 06D;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+N12 8D;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+N3 06D;
N174D+N314D;
A(D183-G184)+N195F+N306D+R310H+E345D;
△(D183匿G 184)+Rl 81 Q+N 195F+W189R+S94K;
A(Dl 83-Gl 84)+Rl 81 Q+Wl 89R+S94K;
A(D 18 3 -G184)+N 195F+R181Q+S94K;
A(D183-G184)+N195F+R181K+N125R;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 18K+R320K+R458K;
△(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+R320K+R458K;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181Q+N306G;
△(D18 3 -G184)+N 195F+R181Q+W189R;
△(D183 -G184)+Rl 81 Q+Nl 95F+R118K+N125K+R444K+N445K A(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125K+R320K+R458K; A(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125R+R320K+R458K; A(Dl 83-Gl 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+S94K+R118K+R320K+R458K; △(D183-G 184)+Rl 81 Q+Nl 95F+R118K+N306R+R320K+R458K;△(D183-G184)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K+R444K+N445K; △(D183-G184)+N 195F+S94K+R118K+N3 06R+R320K+R45 8K; 本發(fā)明的其它組合包括實(shí)施例中提到的具體組合和一種或多種如下取 代N195F; R181Q; G186R; M202L; V206F,L，M; N193P。 穩(wěn)定性
在本發(fā)明的上下文中，那些獲得改變的穩(wěn)定性，尤其是在特別高的pH 值(即pH 8-10.5)條件下，獲得改進(jìn)的穩(wěn)定性(提高或降低)的重要突變(包括氨 基酸取代和缺失)，包括"改變的特性"部分所列舉的任何一種突變。
Ca2+穩(wěn)定性
改變的Ca"穩(wěn)定性是指酶在Ca^損耗的條件下穩(wěn)定性已得到改進(jìn)，即， 提高或降低了穩(wěn)定性。在本發(fā)明的上下文中，那些獲得改變的Ca^l、定性， 尤其是在特別高的pH值(即pH 8-10.5)條件下，獲得改進(jìn)的Ca"穩(wěn)定性(提 高或降低的穩(wěn)定性)的重要突變(包括氨基酸取代和缺失)，包括"改變的特性 "部分所列舉的任何一種突變。
比活性
本發(fā)明另一方面，與獲得比活性改變，尤其在10-60。C溫度下，優(yōu)選 20-50。C,尤其30-40°C溫度下增強(qiáng)或降低比活性的變體有關(guān)的重要突變(包 括氨基酸取代和缺失)，包括"改變的特性"部分所列舉的任何突變。
本發(fā)明變體的一般突變
那些能夠增加酶活性位點(diǎn)周圍流動(dòng)性(mobility)的突變(包括氨基酸的取 代與缺失)是特別令人關(guān)注的。這可以通過破壞活性位點(diǎn)附近(即在優(yōu)選距離 構(gòu)成活性位點(diǎn)的任何氨基酸殘基IOA,或8A,或6A,或4A的范圍內(nèi))的穩(wěn) 定作用而實(shí)現(xiàn)。
以下是降低側(cè)鏈大小的突變實(shí)例
Ala突變?yōu)镚ly
Val突變?yōu)锳la或Gly
lie突變?yōu)長(zhǎng)eu, Val，Ala或Gly
Thr突變?yōu)镾er
期望通過這些突變使活性位點(diǎn)區(qū)的柔性增加，這可用引入空腔或通過填 充突變留下的空間的結(jié)構(gòu)重排來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的變體優(yōu)選除上述突變外還包含一種或多種修飾。因此，oc-淀 粉酶變體部分存在的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代可能 是有利的，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然產(chǎn)生的非脯氨酸殘基， 優(yōu)選是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸。
同樣，親代a-淀粉酶中一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘 基，如，絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代可能是優(yōu) 選的。
此外，本發(fā)明的變體或者只經(jīng)歷一種修飾，或者以任何上述修飾的組合 方式被修飾，以使對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10的185-209位氨基酸的氨基酸片段 中存在的天冬氨酸和/或谷氨酸，各自被天冬酰胺和/或谷氨酰胺取代。在這 些Termamyl樣cx -淀粉酶中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10序歹'J 185-209位氨基酸 片段的氨基酸片段中存在的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))賴氨酸殘基被精氨酸取代，也 是人們所關(guān)注的。
可以理解，本發(fā)明包含引入二種或多種上述1'務(wù)飾的變體。
此外，在如下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入突變可能是有利的(用SEQ ID NO: 10(TermamylTM)來編號(hào))
M15， V128， Alll, H133, W138， T149, M197, N188, A209， A210, H405, T412，尤其是如下單個(gè)，雙重，三重或多重突變
M15X，特別是M15T,L;
V128X,特別是V128E;
H133X,特別是H133Y;
N188X，特別是N188S,T，P;
M197X，特別是M197T，L;
A209X，特別是A209V;
M197T/W138F; M197T/W138Y; M15T/H133Y/N188S;
M15/V128E/H133Y/N188S; El 19C/S130C; D124C/R127C; H133Y/T149I;
G475R， H133Y/S187D; H133Y/A209V;
在AA560中所述修飾對(duì)應(yīng)于
L17X，特別是L17T;
E130X;
Y135X;W140X,特別是W140F，Y; T193X;特別是S,P; M202X,特別是M202T，L; V214X;
涉及的突變組合包括
M202T/W140F; M202T/W140Y; L17T/T193S; L17窗193P; E121C/S132C; N126C/Q129C; T151I; G480R。
制備本發(fā)明a-淀粉酶變體的方法
將突變引入基因的多種方法為本領(lǐng)域所知。在筒短討論如何克隆oc -淀粉 酶編碼DNA序列后，以下討論在a-淀粉酶編碼序列的特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變 的方法。
克隆編碼a -淀粉酶的DNA序列
編碼親代a-淀粉酶的DNA序列可以用本領(lǐng)域熟知的多種方法，從任何 產(chǎn)生所需a-淀粉酶的細(xì)胞或微生物中分離出來。首先，從具有目的oc-淀粉 酶的生物中獲得染色體DNA和/或信使RNA，建立基因組DNA和/或cDNA 文庫(kù)。然后，如果a-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經(jīng)標(biāo)記 的寡核芬酸探針，用于從所述生物中制備的基因組文庫(kù)中鑒定a -淀粉酶編 碼克隆?；蛘?，包含已知a-淀粉酶基因同源序列的標(biāo)記寡核苷酸探針用作 探針，在較低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件下，鑒定oc-淀粉酶編碼克隆。
鑒定a-淀粉酶編碼克隆的另一種方法是將基因組DNA插入到表達(dá)載 體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化的oc-淀粉酶陰性菌，然后，在 含有cc-淀粉酶底物的瓊脂培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)，以獲得能表達(dá)所要鑒定的oc-淀粉酶的克隆。
另外，編碼酶的DNA序列還可以用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，亞磷酰 胺法(如S丄.Beaucage和M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1981, pp. 1859-1869所述)或Matthes等描述的方法〖Matthes et al.、 The EMBO J. 3, 1984 pp. 801-805)得到。在亞磷酰胺法中，寡聚核苷酸是例如用DNA自動(dòng)合成儀 合成的，對(duì)其進(jìn)行純化，退火，連接，并克隆到合適的載體。
最后，DNA序列可以是采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得的、基因組序列與合成的序列， 合成的序列與cDNA來源的序列，或基因組序列與cDNA來源的序列的混合(適當(dāng)?shù)?，這些片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)DNA序列的各部分)。DNA序列還可以用特 定引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)得到，如US 4,683,202或R.K. Saiki et al.， Science 239, 1988, pp. 487-491所述。
cc-淀粉酶變體的表達(dá)
根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過上述方法，或通 過本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體 一般包括編碼啟動(dòng)子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號(hào)的控制序 列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發(fā)明oc-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能 對(duì)其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導(dǎo)入該 載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自我復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí) 體存在的載體，所述載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，所述載體包括例如 質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體。或者，載體可 以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的 染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列可操作相連。啟動(dòng)子可 以是在選定宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動(dòng)子可以得自 編碼與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。介導(dǎo)編碼本發(fā)明a-淀粉酶變
體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的例子是 大腸桿菌/ac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA啟動(dòng)子，地 衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因Omy丄)啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶 基因("my竭啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(am;;0啟動(dòng)子，枯草芽孢桿 菌xylA和xy舊基因的啟動(dòng)子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的 例子是得自編碼下列酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛 霉(i /z&omwcor m/e/ze/)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性a-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn) 定的a-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白 酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體還含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有 與編碼本發(fā)明a-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終 止和聚腺苦酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動(dòng)子相同的來源。載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述 序列的例子是質(zhì)粒pUC19， pACYC177， pUB110, pE194, pAMBl和pIJ702的
復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因， 如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的^/基因，或能賦予抗生素抗性的基因，
所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外， 載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS, argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的 標(biāo)記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來完成選擇。
盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(例如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí))有 利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)。通常，本文所述的芽孢桿菌a-淀粉酶 含有允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)(preregion)。必要時(shí)，該前區(qū)可 被不同的前區(qū)或信號(hào)序列取代，通過取代編碼各個(gè)前區(qū)的DNA序列可以方 便地實(shí)現(xiàn)此目的。
分別連接編碼a-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動(dòng)子，終止子和 其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版， 冷泉港，l989)。
含有上文所定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以 有利地用作宿主細(xì)胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的ot-淀粉酶變體。可以方便地通 過將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合至宿主染色體， 用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檎虾驞NA 序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源 重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體?；蛘?，可用與不同類型的宿主 細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選其 為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適合的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩 芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌(及a汰a/o; Mw)， 解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽 孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過，例如原生質(zhì)轉(zhuǎn)化或通過已知的方式用 感受態(tài)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。
酵母生物可優(yōu)選糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。絲狀真菌優(yōu) 選屬于曲霉屬，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細(xì)胞可用一種方法轉(zhuǎn)化，該 方法涉及原生質(zhì)形成、原生質(zhì)轉(zhuǎn)化、然后細(xì)胞壁以其本身已知的方式再生。
曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適合方法如EP 23 8 023所述。
在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明ot-淀粉酶變體的方法，該方法包 含在有利于變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)如上所述宿主細(xì)胞以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng) 液中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明 a-淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以商購(gòu)，或者可根據(jù)公 開的配方(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中所述的配方)生產(chǎn)。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養(yǎng)基與細(xì)胞分開，利 用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接著利用層析法，如離子交換 層析，親和層析等，從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的a-淀粉酶變體。
工業(yè)化應(yīng)用
本發(fā)明的cc淀粉酶變體有許多在工業(yè)應(yīng)用中有價(jià)值的特性。具體地，本 發(fā)明的酶變體可以作為洗滌，清洗餐具，洗滌硬表面的洗滌劑組合物的成分。 本發(fā)明的具有改變的特性的變體還可用于淀粉加工，特別是淀粉轉(zhuǎn)化，特別 是淀粉的液化等過程(參見，例如US 3,912,590, EP專利
發(fā)明者卡斯滕·安德森, 托本·V·博徹特, 比賈尼·R·尼爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司