專利名稱：發(fā)酵方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請是基于申請日為2003年6月11日，申請?zhí)枮?3825398.4(國際申請?zhí)枮镻CT/US2003/018566)，發(fā)明名稱為“發(fā)酵方法和組合物”的專利申請的分案申請。
相關(guān)申請交互參考
本申請請求于2002年9月26日提交的申請?zhí)枮?0/413,730的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)和利益，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此全文引入作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域 本申請涉及用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的酶促方法和組合物，包括用于改進(jìn)發(fā)酵方法中酵母性能的方法和組合物。

背景技術(shù)：
發(fā)酵方法可用于制備各很多種商品，包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、甲叉丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO2)，以及更復(fù)雜的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、B12、β-胡蘿卜素)；激素，以及難以合成制備的其他化合物。通常，發(fā)酵方法還用于食用乙醇(例如，啤酒和葡萄酒)，奶制品(例如，制備酸乳酪和乳酪)，皮革制品和煙草工業(yè)。
因此需要進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法并需要改進(jìn)的包括發(fā)酵步驟的方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了用于制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法和組合物。本發(fā)明提供了用于改進(jìn)發(fā)酵方法中酵母性能的的方法和組合物，包括發(fā)酵方法的速度和/或產(chǎn)量。本發(fā)明提供了用于制備乙醇的方法和組合物。
本發(fā)明的一個方面涉及一種發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法中至少應(yīng)用一種酯酶。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括讓發(fā)酵中使用的發(fā)酵微生物或培養(yǎng)物與至少一種酯酶接觸。所述酯酶可以應(yīng)用于發(fā)酵方法中和/或所述酯酶可以應(yīng)用于發(fā)酵之前，例如發(fā)酵微生物的增殖過程中。
盡管未限定于于任何一種工作原理，但認(rèn)為在發(fā)酵方法中應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的酯酶，可以促進(jìn)發(fā)酵微生物內(nèi)部和/或外部或發(fā)酵微生物細(xì)胞膜內(nèi)脂類組成/濃度改變，從而導(dǎo)致發(fā)酵期間發(fā)酵微生物溶質(zhì)向內(nèi)和/或向外運(yùn)動的改善，和/或提供更可代謝的能源。例如，如通過轉(zhuǎn)變換發(fā)酵底物或發(fā)酵培養(yǎng)基的組分，例如將谷類基質(zhì)中的油類轉(zhuǎn)變成發(fā)酵微生物可利用的組分，如不飽和脂肪酸和甘油。
在本發(fā)明這方面的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種酯酶包括脂肪分解酶，更優(yōu)選脂肪酶。在本發(fā)明這方面的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種酯酶包括角質(zhì)酶(cutinase)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種酯酶包括磷酸脂酶。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種酯酶選自脂肪酶、角質(zhì)酶、磷酸脂酶及其組合。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明發(fā)酵方法與液化過程和/或糖化過程結(jié)合使用，其中采用另外的酶促活性例如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性來加工基質(zhì)，如淀粉底物。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵方法用于生產(chǎn)乙醇。根據(jù)該優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)用所述至少一種酯酶可提高發(fā)酵微生物對乙醇的耐受極限，從而改善乙醇產(chǎn)量和/或加快發(fā)酵速度。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用至少一種脂肪分解酶來提高發(fā)酵微生物對乙醇的耐受，從而提高乙醇產(chǎn)量。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可將一種或多種其他的酶活性與本發(fā)明的酯酶處理結(jié)合使用(例如之前、期間或之后)。優(yōu)選的其他酶包括蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶和麥芽糖α-淀粉酶。
本發(fā)明另一方面涉及加入發(fā)酵微生物生長刺激物，與本申請所述的酶促過程結(jié)合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法。優(yōu)選的生長刺激物包括維生素和礦物質(zhì)。
本發(fā)明另一方面涉及發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法中應(yīng)用至少一種漆酶。有效劑量的漆酶可在發(fā)酵期間應(yīng)用，和/或在發(fā)酵之前例如在發(fā)酵微生物增殖期間應(yīng)用。雖然未限定于任何一種工作原理，但是在發(fā)酵方法中通過使用至少一種漆酶，可促進(jìn)抑制劑的氧化和氧氣損耗，因而促進(jìn)更適于發(fā)酵微生物的缺氧環(huán)境的生成。
本發(fā)明另一個方面涉及一種方法，該方法通過在至少一種蛋白酶存在條件下增殖發(fā)酵微生物生產(chǎn)可用于發(fā)酵方法的發(fā)酵微生物。雖然未限定于任何一種工作原理，但是確實(shí)如此與相同條件但未加蛋白酶情況下增殖的發(fā)酵微生物相比，存在有效劑量至少一種蛋白酶存在條件下增殖的發(fā)酵微生物，在隨后用于發(fā)酵方法中時，該發(fā)酵微生物的遲滯期(lag time)縮短。在增殖過程中，蛋白酶的作用直接或間接決定將發(fā)酵期間對發(fā)酵微生物有害或有益的基因分別抑制或表達(dá)，從而縮短遲滯期，加快發(fā)酵循環(huán)。
具體地，本發(fā)明涉及如下方面 1)用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，該方法包括發(fā)酵步驟，其包括讓發(fā)酵步驟中所用的發(fā)酵微生物或發(fā)酵介質(zhì)與至少一種酯酶接觸。
2)1)所述的方法，其中所述酯酶為脂肪酶。
3)1)所述的方法，其中所述酯酶為磷脂酶。
4)1)所述的方法，其中所述酯酶為角質(zhì)酶。
5)1)所述的方法，其中所述酯酶為脂肪酶、角質(zhì)酶、磷脂酶或其組合。
6)1)所述的方法，其中所述微生物為酵母。
7)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)品為乙醇。
8)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟為同時糖化和發(fā)酵方法的一部分。
9)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟為粗制淀粉水解過程的一部分。
10)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟在有葡糖淀粉酶和淀粉酶存在時實(shí)施。
11)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟為干法粉碎或濕法粉碎方法的一部分。
12)11)所述的方法，其中用于粉碎方法的原材料為含淀粉的原材料。
13)11)所述的方法，其中用于粉碎的原材料選自玉米、小麥、大麥或高粱。
14)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括去胚的谷物谷粒。
15)1)所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括去胚的玉米。
16)1)所述的方法，進(jìn)一步包括使發(fā)酵微生物或發(fā)酵介質(zhì)與選自蛋白酶、植酸酶或纖維素酶的酶作用。
17)一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括 (a)全粒粉碎； (b)步驟(a)產(chǎn)物的液化； (c)液化材料的糖化； (d)使用微生物發(fā)酵糖化材料，其中發(fā)酵方法還包括使發(fā)酵微生物或含發(fā)酵微生物的介質(zhì)與至少一種酯酶接觸。
18)17)所述的方法，進(jìn)一步包括發(fā)酵材料的蒸餾。
19)17)所述的方法，其中所述方法為同時液化和糖化過程，或同時液化、糖化和發(fā)酵方法。
20)17)所述的方法，其中方法包括向包含發(fā)酵微生物的發(fā)酵介質(zhì)內(nèi)加入α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和酯酶。
21)17)所述的方法，其中所述酯酶為脂肪酶。
22)17)所述的方法，其中所述酯酶為磷脂酶。
23)17)所述的方法，其中所述酯酶為角質(zhì)酶。
24)17)所述的方法，其中所述酯酶為脂肪酶、角質(zhì)酶、磷脂酶或其組合。
25)17)所述的方法，其中所述微生物為酵母。
26)用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，該方法包括發(fā)酵步驟，其包括使發(fā)酵微生物或發(fā)酵介質(zhì)與至少一種漆酶接觸。
27)26)所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)品為乙醇。
28)1)-27)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物為酵母，并進(jìn)一步包括加入酵母生長刺激物。
29)28)所述的方法，其中刺激物為維生素或礦物質(zhì)。
30)28)所述的方法，其中所述刺激物選自多種維生素劑、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸及其組合。
31)一種供發(fā)酵方法中使用的酵母增殖方法，包括至少一種蛋白酶存在時的酵母增殖。
32)31)所述的方法，包括應(yīng)用1)所述發(fā)酵方法中的酵母。
33)31)所述的方法，包括酵母在乙醇生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。
發(fā)明詳述 ＂發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或任何包括發(fā)酵步驟的方法。發(fā)酵方法(fermentation process)包括但不限于用于生產(chǎn)下列物質(zhì)的發(fā)酵方法醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如檸檬酸、乙酸、亞甲基丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如核黃素、B12、β-胡蘿卜素)和激素。發(fā)酵方法還包括應(yīng)用于食用(consumable)乙醇工業(yè)(例如啤酒和酒劑)、乳品加工業(yè)(例如發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)。優(yōu)選的發(fā)酵方法包括乙醇發(fā)酵方法，為本領(lǐng)域眾所周知。優(yōu)選的發(fā)酵方法為厭氧發(fā)酵方法，為本領(lǐng)域眾所周知。
＂發(fā)酵介質(zhì)＂或＂發(fā)酵培養(yǎng)基＂指進(jìn)行發(fā)酵的環(huán)境，其包括發(fā)酵底物，即發(fā)酵微生物代謝的碳源?？刹捎美缭诎l(fā)酵方法之前或同步進(jìn)行的粉碎、液化和糖化過程或其它需要的過程，對發(fā)酵介質(zhì)，包括發(fā)酵底物以及用于發(fā)酵方法的其他原材料進(jìn)行加工。因此，發(fā)酵介質(zhì)可以指加入發(fā)酵微生物前的介質(zhì)，例如處于或來自液化或糖化過程的介質(zhì)，以及含有發(fā)酵微生物的介質(zhì)，例如同步進(jìn)行糖化和發(fā)酵方法(SSF)所用的介質(zhì)。
發(fā)酵介質(zhì)或發(fā)酵底物還可包括脫胚芽的谷類顆粒，優(yōu)選脫胚(de-germed)的玉米(corn)，即胚乳和焙烤過的玉米(例如經(jīng)加熱處理和爆裂的玉米)或任何其它谷類。谷類顆?？梢越?jīng)粉碎或以全粒形式用于發(fā)酵。
＂發(fā)酵微生物＂指適合目的發(fā)酵方法的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵微生物能夠發(fā)酵，即直接或間接地將糖類例如葡萄糖或麥芽糖轉(zhuǎn)變成目的發(fā)酵產(chǎn)品。發(fā)酵微生物的實(shí)例包括真菌生物例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種(Saccharomyces spp.)菌株，特別是釀酒酵母(Sacchromycescerevisiae)。商品化酵母包括，例如RedStar/Lesaffre Ethanol Red(購自美國Red Star/Lesaffre)，F(xiàn)ALI(購自美國Burns Philp FoodInc.分公司Fleischmann′sYeast)，SUPERSTART(購自Alltech)，GERT STRAND(購自瑞典Gert StrandAB)和FERMIOL(購自DSM Specialties)。
＂酯酶＂，也稱羧酸酯水解酶，指作用于酯鍵的酶，包括根據(jù)酶命名法分類于EC 3.1.1羧酸酯水解酶類的酶(可訪問http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme或參考Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，Califomia，分別發(fā)表于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250；1-6和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增刊1(1993)，增刊2(1994)，增刊3(1995)，增刊4(1997)和增刊5)。酯酶的非限制性實(shí)例包括芳基酯酶、三酰甘油酯酶、乙酰酯酶、乙酰膽堿酯酶、膽堿酯酶、脫品酯酶(tropinesterase)、果膠酯酶、甾醇酯酶、葉綠素酶，L-阿拉伯乳糖酶(L-arabinonolactonase)、葡糖酸內(nèi)酯酶、糖醛酸內(nèi)酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶、棕櫚酸視黃酯酶、羥丁酸二聚體水解酶、脂酰甘油脂肪酶、3-氧已二酸烯醇-內(nèi)酯酶(3-oxoadipate enol-lactonase)、1，4-內(nèi)酯酶、半乳糖脂肪酶、4-吡哆醇內(nèi)酯酶、酰基肉毒堿水解酶、氨酰-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖內(nèi)酯酶(D-arabinonolactonase)、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶、磷酸脂酶A1、6-乙酰葡萄糖脫乙?；?、脂蛋白脂肪酶、苯并二氫吡喃酮脂肪酶，檸檬苦素-D-環(huán)-內(nèi)酯酶、類甾醇內(nèi)酯酶、三乙酸酯內(nèi)酯酶、放線菌素內(nèi)酯酶、苔色酸縮酚酸水解酶、頭孢菌素-C脫乙酰酶、氯原酸(chlorogenate)水解酶、α-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酶、亞甲羧基丁烯醇酶(carboxymethylenebutenolidase)、脫氧檸檬苦素A-環(huán)-內(nèi)酯酶(deoxylimonate A-ring-lactonase)，2-乙酰1-烷基甘油磷酸膽堿酯酶、鐮孢氨酸-C鳥氨酸酯酶、芥子酸膽堿酯酶、蠟-酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脫乙酰酶、唾液酸-O-乙酰酯酶(sialateO-acetylesterase)、乙酸基丁炔并噻吩脫乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水楊酸脫乙酰基酶(acetylsalicylatedeacetylase)、甲基傘形乙酸鹽脫乙酰酶(amethylumbelliferyl-acetate deacetylase)、2-吡喃-4，6-二羧酸內(nèi)酯酶、N-乙酰半乳糖胺聚糖脫乙?；?、保幼激素酯酶、二(2-乙基己基)鄰苯二甲酸鹽酯酶、蛋白-谷氨酸鹽甲基酯酶、11-順式棕櫚酸視黃酯水解酶、全反式棕櫚酸視黃酯水解酶、L-鼠李糖-1，4-內(nèi)酯酶、5-(3，4-雙乙酰氧基丁炔(but)-1-ynyl)2，2-并噻吩脫乙?；?、脂酰乙酯合成酶、木糖1，4-內(nèi)酯酶、N-乙酰葡糖胺磷脂酰肌醇脫乙酰酶、cetraxate苯甲基酯酶(cetraxatebenzylesterases)、乙酰烷基甘油乙酰水解酶(acetylalkylglycerol acetylhydrolase)和乙酰木糖酯酶。
本發(fā)明所用酯酶優(yōu)選脂肪水解酶，例如脂肪酶(分類為EC31.1.3，EC31.1.23，EC31.1.26)和磷酸脂酶(分類為EC31.1.4和/或EC31.1.32，包括分類于EC31.1.5的磷酸脂酶)。其它的優(yōu)選酯酶為角質(zhì)酶(分類于EC31.1.74)。
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法和組合物，其中至少一種酯酶用于發(fā)酵方法。酯酶處理可應(yīng)用于發(fā)酵方法的任一階段。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在發(fā)酵方法中，例如在發(fā)酵起始階段加入有效劑量的酯酶(例如通過與發(fā)酵培養(yǎng)基作用)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在發(fā)酵前，例如在發(fā)酵微生物增殖階段，或液化、糖化或預(yù)糖化階段，加入有效劑量的酯酶。在發(fā)酵方法中加入酯酶，例如可提高發(fā)酵微生物的乙醇耐受限制，從而通過發(fā)酵培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)變來提高該發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量(乙醇產(chǎn)量)，例如，將谷類基質(zhì)中的油類轉(zhuǎn)變成發(fā)酵微生物可利用的組分，例如不飽和脂肪酸和甘油。如該實(shí)例所闡述，通過根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的酯酶(例如脂肪酶)處理使乙醇產(chǎn)量顯著改善。
任何適當(dāng)?shù)幕|(zhì)或原料均可用于本發(fā)明的發(fā)酵方法。通常根據(jù)目的發(fā)酵產(chǎn)品和采用的過程來選擇基質(zhì)，其為本領(lǐng)域眾所周知。適于本發(fā)明過程使用的基質(zhì)實(shí)例包括含淀粉材料例如塊莖、根、全粒(whole grains)、玉米、玉米穗(cobs)、小麥、大麥、黑麥、高梁或谷類；含糖原材料例如糖漿、果料、糖、甘蔗或甜菜、馬鈴薯；含纖維素材料，例如木材或植物殘體。適當(dāng)?shù)幕|(zhì)還包括碳源，具體為為可被發(fā)酵微生物代謝的低分子量糖DP1-3，其可通過直接加入發(fā)酵介質(zhì)中供給。
加入有效劑量的酯酶可改善發(fā)酵，例如改變發(fā)酵微生物內(nèi)部和/或外部或發(fā)酵微生物細(xì)胞膜內(nèi)脂類的組成/濃度，從而導(dǎo)致發(fā)酵期間發(fā)酵微生物溶質(zhì)向內(nèi)和/或向外運(yùn)動的改善，和/或提供更易代謝的能源(例如，如通過轉(zhuǎn)變發(fā)酵底物或發(fā)酵培養(yǎng)基組分，例如將谷類基質(zhì)中的油類轉(zhuǎn)變成對發(fā)酵微生物可利用組分如不飽和脂肪酸和甘油)，以提高乙醇產(chǎn)量。有效劑量的酯酶實(shí)例包括發(fā)酵介質(zhì)中0.5-1000U/g DS％(干物質(zhì)百分比)，優(yōu)選1-400U/g％DS，更優(yōu)選1-20U/g DS％，例如1-5U/g DS％。此后可采用本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步優(yōu)化酯酶劑量。
酯酶處理?xiàng)l件(例如pH、溫度和處理時間)取決于其應(yīng)用環(huán)境(例如，在粗制淀粉水解過程中使用的酯酶處理，就不同于讓淀粉底物糊化的常規(guī)淀粉水解過程)。因此選擇酯酶時考慮的因素應(yīng)包括處理期間所采用的條件。例如，粗制淀粉水解加工優(yōu)選在32.2℃進(jìn)行64h，起始pH約4.5-5.0。一些情況下下可采用分段溫度以減輕對酵母的影響。發(fā)酵時間可依據(jù)預(yù)期的乙醇產(chǎn)量而改變。
酯酶處理還將依發(fā)酵使用的酵母的作用而改變，具體為，依酵母遺傳學(xué)和酵母生理學(xué)而改變。因此，酯酶處理的最適條件(例如pH、溫度、處理時間、酯酶選擇和濃度)依據(jù)使用的酵母而變化。例如盡管念珠菌屬(Candida)脂肪酶對SUPERSTART酵母(可從Alltech購買)和ETHANOL RED酵母(可從美國Red Star/Lesaffre購買)都有作用，念珠菌屬脂肪酶對SUPERSTART酵母的作用更強(qiáng)。此外，酯酶處理可能對較少耐受乙醇的酵母有很大作用(即提高酵母的乙醇耐受性)。例如SUPER START酵母通常比ETHANOL RED酵母較少耐受乙醇。另一方面已知FALI酵母對乙醇相當(dāng)耐受。因此，針對發(fā)酵方法所使用的酵母，可對酯酶處理采用的例如階段性條件、酯酶濃度和酯酶的選擇進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)選在高乙醇濃度即濃度高達(dá)22％條件下進(jìn)行酯酶處理。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酯酶為脂肪分解酶，更優(yōu)選脂肪酶。此處使用＂脂肪分解酶＂指脂肪酶和磷酸脂酶(包括糖磷酸脂酶(glyso-phospholipases))。脂肪分解酶優(yōu)選來自微生物，具體為來自細(xì)菌、真菌或酵母。使用的脂肪分解酶可來自以下任何來源，包括，例如犁頭霉屬(Absida)菌株，具體為Absidia blakesleena和傘枝犁頭霉(Absidacorymbifera)；無色桿菌屬(Achromobacter)菌株，具體為解毒無色桿菌(Achromobacter iophagus)；產(chǎn)氣單孢菌屬(Aeromonas)菌株；鏈格孢屬(Alternaria)菌株，具體為甘藍(lán)鏈格孢(Alternaria brassiciola)；曲霉屬(Aspergillus)菌株，具體為黑曲霉(Aspergillus niger)和黃曲霉(Asperillusflavus)；無色桿菌屬菌株，具體為解毒無色桿菌；短梗霉屬(Aureobasidium)菌株，具體為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株，具體為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstrearothermophilus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；白僵菌屬(Beauveria)菌株；索絲菌屬(Brochothrix)菌株，具體為熱殺索絲菌(Brochothrixthermosohata)；念珠菌屬(Candida)菌株，具體為柱狀念珠菌(Candidacylindracea)(Brochothrix)(皺褶假絲酵母(Candida rugosa))、Candidaparalipolytica(Candida)和南極念珠菌(Candida antarctica)；色桿菌屬(Chromobacter)菌株，具體為粘稠色桿菌(Chromobacter viscosum)；鬼傘屬(Coprinus)菌株，具體為灰蓋鬼傘(Coprinus cinerius)；鐮孢屬(Fusarium)菌株，具體為尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、腐皮鐮孢(Fusarium solani)、豌豆腐皮鐮孢(Fusarium solani pisi)和大刀粉紅鐮孢(Fusarium roseum culmorum)；地霉屬(Geotricum)菌株，具體為潘氏地霉(Geotricum penicillatum)；漢遜氏酵母屬(Hansenula)菌株，具體為異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)；腐質(zhì)霉屬(Humicola)菌株，具體為短孢腐質(zhì)霉(Humicola brevispora)、短腐質(zhì)霉變種(Humicola brevis var)、短腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola brevis var.thermoidea)和特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)；Hyphozyma菌株；乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株，具體為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)；綠僵菌屬(Metarhizium)菌株；毛霉屬(Mucor)菌株；擬青霉屬(Paecilomyces)菌株；青霉屬(penicillium)菌株，具體為圓弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillumcrustosum)和擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)；假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株，具體為綠濃假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、假單胞菌屬產(chǎn)堿桿菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)(同物異名洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia))、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)，嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)、門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、Pseudomonas mephitica lipolytica、產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、植物假單胞菌(Pseudomonas plantari)、類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)和Pseudomonas wisconsinensi；絲核菌屬菌株(Rhizoctonia)，具體為茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)；根毛霉屬(Rhizomucor)菌株，具體為米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)；根霉菌屬(Rhizopus)菌株，具體為日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和結(jié)節(jié)根霉(Rhizopus nodosus)；紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)菌株，具體為念珠狀紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；紅酵母屬(Rhodotorula)菌株，具體為粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)；擲孢酵母屬(Sporobolomyces)菌株，具體為Sporobolomyces shibatanus；嗜熱霉屬(Thermomyces)菌株，具體為細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyces lanuginosus)(以前為疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa))，Thiarosporella菌株，具體為Thiarosporella phaseolina；木霉屬(Trichoderma)菌株，具體為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)；和/或輪枝孢菌屬(Verticillium)菌株。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所用的脂肪分解酶來自曲霉屬菌株、無色桿菌屬菌株、芽孢桿菌屬菌株、念珠菌屬菌株、色桿菌屬菌株、鐮孢屬菌株、腐質(zhì)霉屬菌株、Hyphozyma菌株、假單胞菌屬菌株、毛霉屬菌株、根霉屬菌株、或嗜熱霉屬菌株。
在更多的優(yōu)選實(shí)施方案中，脂肪分解酶為脂肪酶。此處可利于脂肪酶例如其能使發(fā)酵介質(zhì)(包括發(fā)酵酵母)例如谷類基質(zhì)中的甘油三酯油脂和脂肪的結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變。脂肪酶催化各種類型的甘油三酯轉(zhuǎn)化，例如水解、酯化和酯基轉(zhuǎn)移。適當(dāng)?shù)闹久赴ㄋ嵝?、中性和堿性脂肪酶，為本領(lǐng)域眾所周知，雖然在低濃度下，酸性脂肪酶(例如，如脂肪酶G AMANO 50，購自Amano)似乎比中性或堿性脂肪酶更為有效。本發(fā)明使用的脂肪酶優(yōu)選包括南極念珠菌脂肪酶和柱狀念珠菌脂肪酶。更優(yōu)選脂肪酶為純化的脂肪酶例如南極念珠菌脂肪酶(脂肪酶A)，南極念珠菌脂肪酶(脂肪酶B)、柱狀念珠菌脂肪酶，和沙門氏柏干酪青霉(Penicillium Camembertii)脂肪酶。
優(yōu)選商品化脂肪酶包括LIPOLASE和LIPEX(購自Novozymes A/S)和GAMANO 50(購自Amano)。
優(yōu)選在發(fā)酵介質(zhì)中加入脂肪酶的劑量大約為0.5-1000LU/g DS％，優(yōu)選1-400LU/g DS，更優(yōu)選1-20LU/g DS％，例如1-10LU/g DS％和1-5LU/gDS％。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一種酯酶為角質(zhì)酶(cutinase)。角質(zhì)酶是能夠分解角質(zhì)的酶。角質(zhì)酶可從任何來源獲得。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，角質(zhì)酶來自曲霉屬菌株，具體為米曲霉(Aspergillus oryzae)；鏈格孢屬(Alternaria)菌株，具體為甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternaria brassiciola)；鐮孢屬菌株，具體為腐皮鐮孢(Fusarium solani)、豌豆腐皮鐮孢(Fusarium solani pisi)、大刀粉紅鐮孢或接骨木粉紅鐮孢(Fusarium roseum sambucium)；長蠕孢屬(Helminthosporum)菌株，具體為蒜頭長蠕孢(Helminthosporum sativum)；腐質(zhì)霉屬菌株，具體為特異腐質(zhì)霉，假單胞菌屬菌株，具體為門多薩假單胞菌或腐臭假單胞菌；絲核菌屬菌株，具體為茄屬絲核菌；鏈霉菌屬菌株，具體為瘡痂病鏈霉菌(Streptomyces scabies)；或細(xì)基格孢屬(Ulocladium)菌株，具體為群生細(xì)基格孢(Ulocladium consortiale)。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，角質(zhì)酶來自特異腐質(zhì)霉菌株，具體為特異腐質(zhì)霉菌株DSM1800。特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶的描述見WO 96/13580，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。優(yōu)選的角質(zhì)酶包括JC492(購自Novozymes A/S)。
加入發(fā)酵介質(zhì)中的角質(zhì)酶的劑量優(yōu)選為約0.5-1000U/g DS％，優(yōu)選1-400U/g DS％，例如40-400U/g DS％，更優(yōu)選1-20U/g DS％，例如1-10U/gDS％和1-5U/g DS％。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種酯酶為磷脂酶。磷脂酶為具有針對磷脂活性的酶。磷脂例如卵磷脂或磷脂酰膽堿，由酯化甘油組成，酯化部位為外部(sn-1)和中間(sn-2)的2個脂肪酸，第3個酯化部位為磷酸；磷酸可依次被酯化成氨基醇。磷脂酶為參與磷脂水解的酶。已鑒別出若干種類的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其水解一個脂?；?分別在sn-1和sn-2位置)形成溶血磷酸脂；溶血磷脂酶(磷脂酶B)可水解溶血磷脂中剩余的脂酰基。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二脂酶)分別釋放二酰基甘油或磷脂酸。
術(shù)語磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(A1或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。
本申請中使用的術(shù)語＂磷脂酶A＂與本發(fā)明所述的酶結(jié)合在一起，意在將所有具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶都包括在內(nèi)。磷脂酶活性可由同時具有額外活性的酶，例如，如具有磷脂酶活性的脂肪酶提供。磷脂酶活性可來自例如具有額外的磷脂酶副(side)活性的脂肪酶。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，磷脂酶活性由基本上僅具有磷脂酶活性的酶提供，其中磷脂酶酶活性不屬副活性。
磷脂酶可來自任何來源，例如動物來源(例如，如哺乳動物)，例如來自胰腺(例如?；蜇i的胰腺)，或蛇毒或蜂毒。或者，磷脂酶也可從微生物來源獲得，例如來自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌，例如曲霉菌屬或種，例如黑色曲霉；網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)，例如盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum)；毛霉屬，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、細(xì)孢毛霉(M.Subtilissimus)；脈孢菌屬(Neurospora)，例如粗糙脈孢菌(N.crassa)；根毛霉屬，例如微小毛霉(R.pusillus)；根霉屬(Rhizopus)，例如少根根霉(R.arrhizus)，日本根霉，葡枝根霉(R.stolonifer)；核盤菌屬(Sclerotinia)，例如大豆核盤菌(S.libertiana)；發(fā)癬菌屬(Trichophyton)，例如深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)；Whetzelinia，例如W.sclerotiorum；芽孢桿菌屬，例如巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、枯草芽孢桿菌；檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，例如氟氏檸檬酸桿菌(C.freundii)；腸桿菌屬(Enterobacter)，例如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)；愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、遲鈍愛德華氏菌(E.tarda)；歐文氏菌屬(Erwinnia)，例如草生歐文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌(E.coli)；克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；變形桿菌屬(Proteus)，例如普通變形桿菌(P.vulgaris)；普羅威登斯菌屬(Providencia)，例如斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii)；沙門氏菌屬(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌屬(Serratia)，例如乳紅化沙雷氏菌(S.liguefasciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcascens)；志賀氏菌屬(Shigella)，例如氟氏志賀氏菌(S.flexneri)；鏈霉菌屬(Streptomyces)，例如紫紅鏈霉菌(S.violeceoruber)，耶爾森氏菌屬(Yersinia)，例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)。因此，磷脂酶可來自真菌，例如來自核菌綱(Pyrenomycetes)，例如鐮孢屬，例如大刀鐮孢、異孢鐮孢(F.heterosporum)、腐皮鐮孢(F.solani)菌株，或尖鐮孢(F.oxysporum)菌株。磷脂酶還可來自曲霉屬的絲狀真菌屬，例如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)菌株、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉或米曲霉。優(yōu)選的商品化磷脂酶包括LECITASE和LECITASEULTRA(可從Novozymes A/S購買)。
在發(fā)酵介質(zhì)中優(yōu)選加入磷脂酶的量約為0.5-1000PLA/U/g DS％，優(yōu)選1-400PLA/U/g DS％，更優(yōu)選1-20PLA/U/g DS％，例如1-10LU/g DS％。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種酯酶選自脂肪酶、角質(zhì)酶、磷脂酶。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，組合使用酯酶，例如(1)脂肪酶和角質(zhì)酶；(2)脂肪酶和磷脂酶；(3)磷脂酶和角質(zhì)酶；和(4)脂肪酶，磷脂酶和角質(zhì)酶。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可將一種或多種其他的酶活性與本發(fā)明的酯酶處理組合使用(例如之前、期間或之后)。除組合使用通常用于加工淀粉的酯酶外，例如α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，優(yōu)選其它的酶還包括蛋白酶，植酸酶，木聚糖酶，纖維素酶，麥芽糖α-淀粉酶和β-淀粉酶。更優(yōu)選其他酶為蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶、麥芽糖α-淀粉酶和β-淀粉酶。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將酯酶處理和植酸酶組合使用。根據(jù)該實(shí)施方案，可以利用植酸酶，例如促進(jìn)存在于培養(yǎng)基中的植酸(肌醇六磷酸)或其任何鹽類(植酸鹽)釋放無機(jī)磷酸。植酸酶可在發(fā)酵期間加入，或在發(fā)酵前例如在增殖期間或發(fā)酵前的某一階段，例如，液化和/或糖化階段加入。加入植酸酶，例如可改善酵母必需礦物質(zhì)的生物利用度，如PCT申請WO01/62947所述，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此引入作為參考。
＂植酸酶＂是一種能夠影響使植酸(肌醇六磷酸)或其任何鹽類(植酸鹽)釋放無機(jī)磷酸的酶。植酸酶可以根據(jù)其起始水解步驟的特異性，即第一個被水解的磷酸酯基團(tuán)進(jìn)行分類。本發(fā)明所用植酸酶可具有任何特異性，例如3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)，6-植酸酶(例如E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(無E.C.編號)特異性。
植酸酶可來自植物或微生物，例如細(xì)菌或真菌，例如酵母或絲狀真菌。植物植酸酶可來自小麥麩皮、玉米、大豆或百合花粉。適當(dāng)?shù)闹参镏菜崦傅拿枋鲆奣homlinson等，Biochemistry，1(1962)，166-171；Barrientos等，plant.Physiol.，106(1994)，1489-1495；WO98/05785；WO98/20139。
細(xì)菌植酸酶可來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬或埃希氏菌屬，優(yōu)選枯草桿菌或大腸桿菌種系。適當(dāng)?shù)募?xì)菌植酸酶的描述見Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 1511102-1108；Cosgrove，1970，AustralianJournal of Biological Sciences 231207-1220；Greiner等，Arch.Biochem.Biophys.，303,107-113，1993；WO98/06856；WO97/33976；WO97/48812。
酵母植酸酶或肌醇單磷酸酶可來自酵母屬或糖酵母屬(Saccharomyces)或許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)，優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或西方許旺氏酵母(Schwanniomyces occidantalis)。適當(dāng)?shù)慕湍钢菜崦傅拿枋鲆奛ayini等，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 1724-26；Wodzinski等，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303；AU-A-24840/95； 絲狀真菌植酸酶可來自真菌門子囊菌(Ascomycota)(子囊菌綱(ascomycetes))或擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，例如曲霉屬、嗜熱霉屬(也稱作腐質(zhì)霉屬)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、紅曲霉屬(Manascus)、青霉屬、隔孢伏革菌屬(Peniophora)、田頭霉屬(Agrocybe)、樁菇屬(Paxillus)，或栓菌屬(Trametes)，優(yōu)選土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉、黑曲霉泡盛變種(var.Awamori)、無花果曲霉(Aspergillus ficuum)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、米曲霉，細(xì)毛嗜熱酶(也稱為疏棉狀腐質(zhì)霉)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)，Peniophoralycii、平田頭菇(Agrocybe pediade)、紅曲霉(Manascus anka)、卷緣樁菇(Paxilusinvoltus)，或絨毛栓菌(Trametes pubescens)。適當(dāng)?shù)恼婢菜崦傅拿枋鲆奩amada等，1986，Agric.Biol.Chem.3221275-1282；Piddington等，1993，Gene 13355-62；EP684,313；EP0 420 358；EP0 684 313；WO98/28408；WO98/28409；JP7-67635；WO98/44125；WO97/38096；WO98/13480。
經(jīng)修飾的植酸酶或植酸酶變體可利用本領(lǐng)域已知方法獲得，具體為利用公開于EP897010；EP897985；WO99/49022；WO99/48330的方法獲得。商品化植酸酶包括BIO-FEEDPHYTASE TM，PHYTASENOVO CT或L(Novozymes A/S)，或NATUPHOSTM NG 5000(DSM)。
優(yōu)選加入植酸酶劑量為0.005-250FYT/g DS％，優(yōu)選10-100FYT/gDS％。優(yōu)選適當(dāng)?shù)闹菜崦竸┝繛?.005-25FYT/g DS％，更優(yōu)選0.01-10FYT/g，例如0.1-1FYT/g DS％。此處植酸酶活性用FYT單位定義，一個FYT指在下列條件下每分鐘釋放1微摩爾無機(jī)ortho-磷酸鹽pH5.5；溫度37℃；底物濃度為0.0050摩爾/升的植酸鈉(C6H6O24P6Na12)。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酯酶處理與蛋白酶組合使用。蛋白酶可用來，例如消化蛋白質(zhì)生成游離氨基氮(FAN)。這種游離氨基酸可作為酵母的營養(yǎng)源，從而促進(jìn)酵母的生長并因此提高乙醇產(chǎn)量。
此外，雖然酯酶處理引起甘油濃度增加可提高酵母的乙醇耐受并提高乙醇產(chǎn)量，但甘油濃度過高可能會對酵母性能產(chǎn)生不利影響。因此在這種情況下，可采用蛋白酶處理將甘油濃度降至或控制在優(yōu)選對發(fā)酵微生物所期望的控制范圍內(nèi)。
蛋白酶已為本領(lǐng)域熟知，指的是能催化肽鍵裂解的酶。適當(dāng)?shù)牡鞍酌赴ㄕ婢图?xì)菌蛋白酶。優(yōu)選蛋白酶為酸性蛋白酶，即蛋白酶的特征在于能夠在低于pH7的酸性條件下水解蛋白。適當(dāng)?shù)乃嵝哉婢鞍酌赴▉碜郧箤?、毛霉屬、根霉菌屬、念珠菌屬、草蓋菌屬(Coriolus)、疫病霉屬(Endothia)、Enthomophtra、耙菌屬(zrpex)、青霉屬、小核菌屬(Sclerotium)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特別傾向使用來自黑曲霉的蛋白酶(見，例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，Aspergillussaitoi(見，例如Yoshida(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO95/02044)，或米曲霉；來自微小毛霉(Mucorpusillus)或米赫毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
商品化的蛋白酶包括GC106和SPEZYME FAN(可從Genencor購買)。適當(dāng)?shù)募?xì)菌蛋白酶，盡管不是酸性蛋白酶，包括商品化產(chǎn)品Alcalase

和Neutrase

(可從Novozymes A/S購買)。
蛋白酶優(yōu)選為天冬氨酸蛋白酶，例如描述于蛋白水解酶手冊，A.J.Barrett編輯，N.D.Rawlings和J.F.Woessner，Academic Press，SanDiego，1998，Chapter 270。適當(dāng)?shù)奶於彼岬鞍酌笇?shí)例包括例如，R.M.等發(fā)表于Gene，96,313(1990))；(R.M.等，Gene125，195-198(1993))；和Gomi等Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)，在此引入作為參考。
優(yōu)選可加入蛋白酶的量為10-7-10-5克活性蛋白酶蛋白/克DS％，尤其優(yōu)選10-7-5×10-6克活性蛋白酶蛋白/克DS％。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將酯酶處理與生麥芽糖α-淀粉酶組合使用。＂生麥芽糖α-淀粉酶＂(葡萄糖1，4-Δ-麥芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯獬搔?構(gòu)型的麥芽糖。生麥芽糖α-淀粉酶的實(shí)例包括來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(嗜熱脂肪芽孢桿菌)菌株NCIB 11837的生麥芽糖α-淀粉酶。生麥芽糖α-淀粉酶的描述見美國專利US4,598,048、US4,604,355和US6,162,628，在此引用作為參考。商品化的生麥芽糖淀粉酶有MALTOGENASETM(可從Novozymes A/S購買)。優(yōu)選地，將生麥芽糖α-淀粉酶用于粗制淀粉水解過程促進(jìn)退減(retrograded)淀粉的生成。優(yōu)選在液化過程中酯酶與麥芽糖α-淀粉酶結(jié)合使用。優(yōu)選生麥芽糖α-淀粉酶的加入劑量為0.02-1.0g/DS％。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酯酶處理與β-淀粉酶結(jié)合使用。β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是外作用(exo-acting)麥芽糖淀粉酶的傳統(tǒng)命名，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和葡萄糖相關(guān)聚合物中1，4-α-糖苷鍵的水解。以遞進(jìn)方式依次從非還原鏈端除去麥芽糖單元，直至該分子被分解，或就支鏈淀粉而言直至到達(dá)分支點(diǎn)。所釋放的麥芽糖具有β異頭構(gòu)型，因此命名為β-淀粉酶。
已經(jīng)從多種植物和微生物中分離出β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。這些β-淀粉酶的特征在于具有40℃-65℃的最適溫度和4.5-7的最適pH值。其它的β-淀粉酶實(shí)例包括描述于美國專利號5,688,684的β-淀粉酶。商品化的β-淀粉酶包括NOVOZYM WBA(可從NovozymesA/S購買)、SPEZYMETM1500和OPTIMALT(可從美國GenencorInt.購買)。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酯酶處理和木聚糖酶組合使用。木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)活性可從任何適當(dāng)?shù)膩碓传@得，包括真菌和細(xì)菌生物體，例如曲霉屬、Disporotrichum、青霉屬、脈孢菌屬、鐮孢屬和木霉屬。優(yōu)選包含木聚糖酶的商品化制劑包括

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(Novozymes A/S)和

(Genencor Int.)。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，處理酯酶和纖維素酶組合使用。根據(jù)本發(fā)明所用的纖維素酶活性可從任何適當(dāng)?shù)膩碓传@得，優(yōu)選纖維素酶來源于微生物，例如可來源于絲狀真菌菌株(例如曲霉屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬)?？捎玫陌w維素酶的商品化制劑包括


和

(Novozymes A/S)，LAMINEXTM和

CP(Genenco Int.)和

7069 W(來自

GmbH)。
本申請所述的發(fā)酵方法優(yōu)選與液化或糖化過程結(jié)合使用。任何液化或糖化均可用于本發(fā)明的發(fā)酵方法。根據(jù)本發(fā)明所述與發(fā)酵方法預(yù)組合。根據(jù)本發(fā)明，糖化和液化可與發(fā)酵方法同時或分開進(jìn)行。在本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案中，液化、糖化和發(fā)酵方法同時進(jìn)行。
＂液化＂是粉碎(完整)的谷類原材料被分解(水解)成麥芽糖糊精(糊精)的過程。液化通常要對漿料進(jìn)行三步熱漿化過程。在60-95℃，優(yōu)選80-85℃，加熱漿料并加入酶啟動液化(稀化)。然后在95-140℃，優(yōu)選105-125℃溫度下噴射蒸煮(jet-cooked)漿料，使?jié){料徹底糊化。然后將漿料冷卻至60-95℃，加入更多的酶以結(jié)束水解(二級液化)。液化過程通常在pH4.5-6.5，具體為pH5-6條件下進(jìn)行。粉碎并液化的全粒稱為醪(mash)。
液化過程通常由α-淀粉酶完成。優(yōu)選α-淀粉酶來源于真菌或細(xì)菌。更優(yōu)選α-淀粉酶為芽孢桿菌α-淀粉酶，例如來自菌株地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌。其它α-淀粉酶包括來自芽孢桿菌種的菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM9375的α-淀粉酶，所有這些酶的詳細(xì)描述見WO95/26397，以及Tsukamoto等，Biochemical andBiophysical Research Communications，151(1988)，pp.25-31一文中描述的α-淀粉酶。其它α-淀粉酶的變體和雜化物的描述見WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467。其它α-淀粉酶包括來自曲霉屬菌株的α-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，α-淀粉酶為酸性α-淀粉酶。術(shù)語＂酸性α-淀粉酶＂指在pH 3.0-7.0。優(yōu)選pH3.5-6.0，更優(yōu)選pH4.0-5.0條件下，加入有效劑量的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)具有活性。任何適當(dāng)?shù)乃嵝驭?淀粉酶均可用于本發(fā)明。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酸性α-淀粉酶為真菌酸性α-淀粉酶或細(xì)菌酸性α-淀粉酶。本發(fā)明所用酸性α-淀粉酶優(yōu)選來自菌株地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌。更優(yōu)選酸性α-淀粉酶為真菌酸性α淀粉酶，例如SP288(可從Novozymes購買)。
優(yōu)選的包含α-淀粉酶的商品組合物包括MYCOLASE(Gist Brocades)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X和SANTMSUPER、SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE L-40,000，DEX-LOTM、SPEYME FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTAAA(Genencornt.)。
可加入α-淀粉酶的劑量為本領(lǐng)域眾所周知。當(dāng)按AAU單位計(jì)量時，優(yōu)選酸性α-淀粉酶的活性為5-500000AAU/kg DS、500-50000 AAU/kgDS，更優(yōu)選100-10000AAU/kg DS，例如500-1000AAU/kg DS。優(yōu)選加入真菌酸性α-淀粉酶10-10000 AFAU/kg，500-2500 AFAU/kgDS，更優(yōu)選100-1000AFAU/kg DS，例如大約500AFAU/kg DS。
＂糖化＂是把麥芽糖糊精(例如由液化過程產(chǎn)生)變成可被發(fā)酵生物例如酵母代謝的低分子量糖DP1-3(例如碳源)。糖化過程為本領(lǐng)域眾所周知，通常由葡糖淀粉酶酶解完成。作為選擇或附加，可使用α-葡萄糖苷酶或酸性α-淀粉酶。整個糖化過程可持續(xù)約24-72小時，且通常在大約30-65攝氏溫度，pH4-5，通常約pH4.5條件下進(jìn)行。然而，通常優(yōu)選執(zhí)行預(yù)糖化步驟，其持續(xù)約40-90分鐘，溫度30-65℃，通常約60℃，隨后在發(fā)酵期間的同時糖化和發(fā)酵方法(SSF)中進(jìn)行徹底糖化。
糖化過程所用葡糖淀粉酶可從任何適當(dāng)來源獲得，例如來自微生物植物。優(yōu)選的葡萄糖淀粉酶來自真菌或細(xì)菌，選自曲霉屬葡萄糖淀粉酶，具體為黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其變體，例如公開于WO92/00381和WO00/04136；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其變體或其片斷。
其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性的變體，例如G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot Engng.9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot Engng.8,575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem J.301，275-281)；二硫鍵，A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；以及在適當(dāng)位置引入Pro殘基的A435和S436(Li等(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204。其它葡糖淀粉酶包括踝節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，具體為來自Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美國專利號Re.32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(美國專利號4,587,215)。細(xì)菌葡糖淀粉酶傾向考慮包括來自梭菌屬(Clostridium)，具體為熱解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和熱硫化氫梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
包含葡糖淀粉酶的商品化組合物包括AMG200L；AMG300L；SANTTMSUPER、SAN EXTRA L、SPIRIZYME PLUS和AMGTM(來自Novozymes A/S)；AMIGASE和AMIGASE PLUS(來自DSM)；OPTIDEXTM300，G-ZYMETMG900，G-ZYMETTM和G990ZR(來自GenencorInt.)。
在一個實(shí)施方案中，可加入葡糖淀粉酶的劑量為0.02-2AGU/g DS，優(yōu)選0.1-1AGU/g DS，例如0.2AGU/g DS。
用于生產(chǎn)乙醇最普遍的方法是同步進(jìn)行糖化和發(fā)酵(SSF)過程，其中不經(jīng)過糖化保溫階段，這意味著發(fā)酵生物例如酵母和酶將被一起加入。在SSF過程中，通常在發(fā)酵前引入預(yù)糖化步驟，在50℃以上進(jìn)行。
更優(yōu)選液化、糖化或發(fā)酵方法同步進(jìn)行，即液化-糖化-發(fā)酵(LSF)過程作為單一的酶促過程，其中液化、糖化和發(fā)酵方法均在一個過程內(nèi)完成，換言之，所有用于液化、糖化和發(fā)酵的酶(或可替代的或其它的非酶促試劑)和酵母，均在同一工序內(nèi)加入，更優(yōu)選在同一工序內(nèi)同時加入。優(yōu)選的LSF過程條件包括溫度約26-40℃，優(yōu)選約32℃，pH約4-8，優(yōu)選pH約為pH5，過程時間約48-72小時，優(yōu)選約72小時。
優(yōu)選LSF過程或單一酶促過程為粗制淀粉水解(RSH)過程，更優(yōu)選用于醇類例如乙醇的生產(chǎn)。＂粗制淀粉水解＂過程(RSH)不同于傳統(tǒng)的淀粉處理過程，其中用于乙醇發(fā)酵方法的未煮過(uncooked)的粗制淀粉也指顆粒狀淀粉。此處所用術(shù)語＂顆粒狀淀粉＂指未煮過的粗制淀粉，即處于天然狀態(tài)例如谷物、塊莖或谷粒中的淀粉。淀粉在植物細(xì)胞內(nèi)形成不溶于水的微小顆粒。置于冷水中時，淀粉顆粒可吸收少量液體并膨脹。在溫度高至50-75℃時膨脹是可逆的。然而，更高的溫度開始產(chǎn)生不可逆的膨脹，稱之為糊化(gelatinization)。
術(shù)語＂起始糊化溫度＂指淀粉開始糊化的最低溫度。在水中加熱淀粉，于50-75℃開始糊化；確切的糊化溫度取決于特定的淀粉，熟練的技術(shù)人員可輕易地確定該溫度。例如，起始糊化溫度可能依植物種屬、依植物種屬的特定種類以及生長條件而改變。在本發(fā)明背景下，給定淀粉的起始糊化溫度，為使用Gorinstein.S.和Lii.C.所述方法Starch/St

ke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)，淀粉顆粒雙折射(birefringence)損失5％時的溫度。
根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選酯酶與淀粉酶和/或葡糖淀粉酶結(jié)合使用，以提高粗制淀粉過程中的乙醇產(chǎn)量。雖然未限定于任何一種工作原理，但普遍認(rèn)為酯酶處理可通過下列一種或多種機(jī)制改善粗制淀粉水解過程 a)由酯酶-生成的外源性不飽和脂肪酸補(bǔ)養(yǎng)酵母。例如在玉米發(fā)酵中，酯酶例如脂肪酶，可通過將玉米油轉(zhuǎn)換成不飽和脂肪酸，促進(jìn)酵母的增殖和性能。
b)通過酯酶-生成的外源性不飽和脂肪酸抑制酯類的合成。供給酵母以外源性不飽和脂肪酸還具有另外的優(yōu)勢，因?yàn)橥庠葱圆伙柡椭舅峥梢种平湍傅拇家阴；D(zhuǎn)移酶，從而抑制乙酯合成，因此不飽和脂肪酸可增加乙醇產(chǎn)量。而且，脂肪酸例如在粗制淀粉水解過程生成的玉米來源的脂肪酸，也是很有價值的副產(chǎn)品。亞油酸，例如可作為維生素F和一類必需脂肪酸組份，α-亞油酸可被人體轉(zhuǎn)換成具有許多重要調(diào)節(jié)功能的Ω-3脂肪酸。
c)促進(jìn)淀粉釋放。在粗制淀粉水解時，可使用酯酶例如脂肪酶和磷脂酶，通過作用于淀粉質(zhì)體膜和淀粉脂類復(fù)合物而促進(jìn)淀粉的釋放。
d)甘油形成/濃縮。從葡萄糖生成乙醇是氧化還原中和過程，其中以將碳水化合物轉(zhuǎn)化成乙醇為代價，生成甘油維持酵母的氧化還原平衡。作為酵母增殖的結(jié)果，大多數(shù)甘油在發(fā)酵早期生成，幾乎所有NADH是在從氨和葡萄糖從頭合成氨基酸時形成的?？刹捎悯ッ柑幚硪栽黾痈视蜐舛?，這對酵母的乙醇耐受產(chǎn)生有益的影響。但如果甘油濃度過高，則可加入蛋白酶或其它適當(dāng)?shù)母视瓦€原劑以降低甘油濃度。
e)游離脂肪酸可起到泡沫破泡劑的作用。游離脂肪酸的存在與泡沫不穩(wěn)定性有關(guān)，酯酶處理也可減少發(fā)酵方法中泡沫的形成。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶、酵母和至少一種酯酶，在低于顆粒狀淀粉起始糊化溫度的溫度下，處理顆粒狀淀粉漿料。優(yōu)選酵母為乙醇紅(Ethanol Red)酵母。淀粉酶優(yōu)選酸性α-淀粉酶，更優(yōu)選真菌酸性α-淀粉酶，例如SP288(來自Novozymes) 在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，粗制淀粉水解過程需要在低于顆粒狀淀粉起始糊化溫度0-20℃的條件下，使用葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶，對顆粒狀淀粉漿料進(jìn)行處理，然后在10-35℃溫度下用葡糖淀粉酶和/或α淀粉酶，酵母和至少一種酯酶處理漿料。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該過程需要下列連續(xù)步驟(a)在低于顆粒狀淀粉起始糊化溫度0-20℃溫度下，用酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶處理顆粒狀淀粉漿料，優(yōu)選時間為5分鐘-12小時，(b)在10-35℃溫度下，用酸性α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酵母和至少一種酯酶處理漿料，優(yōu)選時間為20-250小時，以生成乙醇。
在RSH過程中，可將其它的酶和發(fā)酵刺激物與酯酶處理結(jié)合使用。優(yōu)選其它的酶選自植酸酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶、麥芽糖α-淀粉酶及其組合。在RSH過程中存在大量的植酸。因此在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，如前所述，使用植酸酶可以促進(jìn)存在于培養(yǎng)基中的植酸(肌醇六磷酸)(myo-inositol hexakisphosphate)或其任何鹽類(植酸鹽)釋放無機(jī)磷酸。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在RSH過程中麥芽糖α-淀粉酶與酯酶處理結(jié)合使用。
本申請所述的發(fā)酵方法和組合物優(yōu)選應(yīng)用于醇類生產(chǎn)過程(例如，如用作燃料或燃料添加劑的乙醇)，更優(yōu)選使用粗制淀粉水解過程的醇類生產(chǎn)過程。本申請所述的過程例如可提高乙醇生產(chǎn)的速度和/或產(chǎn)量。加入有效劑量的至少一種酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶、角質(zhì)酶或其組合)，可提高發(fā)酵微生物的乙醇耐受性，由此通過將組分例如谷類基質(zhì)中的油類組分轉(zhuǎn)變成發(fā)酵微生物可利用組分，提高發(fā)酵產(chǎn)品中乙醇的產(chǎn)量。如實(shí)施方案中所闡述，根據(jù)本發(fā)明的酯酶處理可促使乙醇產(chǎn)量增加。
乙醇生產(chǎn)過程通常包括以下步驟粉碎、液化、糖化、發(fā)酵和蒸餾。在乙醇及其他的基于淀粉的產(chǎn)品生產(chǎn)中，需要粉碎原材料例如全粒，優(yōu)選谷粒，以便打破結(jié)構(gòu)容許進(jìn)一步加工。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選兩種方法濕法粉碎和干法粉碎(dry milling)。優(yōu)選乙醇生產(chǎn)中采用干法粉碎，其中將整個籽粒磨碎應(yīng)用于過程其余部分。也可采用濕法粉碎，濕法粉碎可使胚芽(germ)和粗粉(淀粉顆粒和蛋白)得到較好的分離，除少數(shù)情況外濕法粉碎用于平行生產(chǎn)糖漿(syrup)。干濕粉碎法均為本領(lǐng)域眾所周知。
在乙醇生產(chǎn)中，發(fā)酵生物優(yōu)選酵母，其應(yīng)用于醪。優(yōu)選酵母來源于酵母菌spp.，更優(yōu)選來自釀酒酵母。在優(yōu)選實(shí)施方案中，向醪液中加入酵母，發(fā)酵持續(xù)24-96小時，例如通常35-60小時。在優(yōu)選實(shí)施方案中，溫度通常為26-34℃，具體為約32℃，pH值通常為pH3-6，優(yōu)選pH4-5左右。優(yōu)選加入酵母細(xì)胞數(shù)為105-1012，優(yōu)選107-1010，具體為每毫升發(fā)酵肉湯活酵母計(jì)數(shù)5×107。在乙醇生成期，優(yōu)選酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在107-1010，具體為在2×108左右。關(guān)于使用酵母發(fā)酵的更多指導(dǎo)可參見，例如＂醇類教程＂(EditorsK.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall，諾丁漢大學(xué)出版社，英國1999)，在此引用作為參考。
發(fā)酵后，可蒸餾醪液以提取醇類產(chǎn)物(乙醇)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明過程獲得的終產(chǎn)物為乙醇時，其可用作例如燃料用乙醇；飲用乙醇，即可飲用酒精；或工業(yè)用乙醇。
此處涉及的酯酶及其它的酶可來自任何適當(dāng)來源，包括來自細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動物。術(shù)語＂來源＂即指該酶可以從其天然存在的生物體中分離出來，即其氨基酸序列測定與天然酶一致。所述術(shù)語＂來源＂也指酶可由宿主生物體重組產(chǎn)生，重組生成的酶與天然酶的氨基酸序列相一致同一性或氨基酸序列有所改變，例如具有一個或幾個(多個)氨基酸缺失，插入和/或替換，即重組生成的酶為突變體和/天然氨基酸序列的片斷，或通過本領(lǐng)域已知的核酸改組方法生成的酶。在該意義上天然的酶包括在天然變體范圍內(nèi)。此外，所述術(shù)語＂來源＂包括通過合成例如肽合成制備的酶。術(shù)語＂來源＂還包括在體內(nèi)或體外經(jīng)過修飾例如糖基化、磷酸化或其它化學(xué)修飾的酶。本文術(shù)語＂獲得＂指具有與天然酶氨基酸相同序列的酶。該術(shù)語包括從其天然存在的生物體分離的酶，或從重組表達(dá)該酶的同種或不同種類的生物體中分離的酶，或通過合成例如肽合成制備的酶。就重組生成的酶而言，術(shù)語＂獲得＂和＂來源＂指的是該酶本身而非生成該酶的宿主生物體的同一性。
酶也可以純化。用于此處的術(shù)語＂純化＂包括使酶和來自其生物體來源的其它組份分開。用于此處的術(shù)語＂純化＂包括使酶與獲得該酶的天然生物體分開。酶可以純化至僅有少量的其它蛋白存在。表述＂其它蛋白＂具體為指其它的酶類。此處所用術(shù)語＂純化＂也指除去其它組分，具體為存在于本發(fā)明酶的來源細(xì)胞中的其它蛋白，更具體為為其它的酶。酶可以是＂基本純的＂，即與生成該酶的有機(jī)體例如生成重組酶的宿主生物的其它組份分開。在優(yōu)選實(shí)施方案中，酶的純度至少為75％(w/w)，更優(yōu)選純度至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酶的純度為100％。
用于本發(fā)明的酶可采用適合此處描述方法的任何一種形式(組合物)，例如，如采用干粉或?；?、無粉塵?；⒁后w、穩(wěn)定液體或受保護(hù)酶的形式。?；赏ㄟ^例如，如公開于美國專利號4,106,991和美國4,661,452所述生成，并且可選擇性地采用本領(lǐng)域已知方法包被?？筛鶕?jù)已制定方法通過例如加入穩(wěn)定劑，例如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有機(jī)酸來穩(wěn)定液體酶制劑。受保護(hù)酶可根據(jù)公開于EP238,216的方法制備。
當(dāng)與使用其它酶的過程或處理結(jié)合應(yīng)用時，例如淀粉酶和葡糖淀粉酶用于液化和/或糖化過程，優(yōu)選酯酶組合物不抑制其它的酶，例如酯酶組合物優(yōu)選不含或僅含微量的鈣結(jié)合復(fù)合物。同樣地，優(yōu)選酯酶組合物不抑制發(fā)酵方法，例如優(yōu)選酯酶組合物不含或僅含微量的甘油。
根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，發(fā)酵刺激物可與本申請所述的任何酶促過程結(jié)合使用以進(jìn)一步改善發(fā)酵方法，具體為，改善發(fā)酵微生物的性能，例如提高速度和乙醇產(chǎn)量。＂發(fā)酵刺激物＂指發(fā)酵微生物，具體為酵母的生長刺激物。優(yōu)選發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物質(zhì)。維生素實(shí)例包括多種維生素(multivitamin)、生物素、泛酸(pantothenate)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和A、B、C、D、E族維生素。參見，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisia by a vitaminfeeding strategy duringfed-batchprocess，＂Springer-Verlag(2002)，在此引用作為參考。礦物質(zhì)實(shí)例包括可提供營養(yǎng)的無機(jī)物和無機(jī)鹽，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
本發(fā)明另一方面涉及發(fā)酵方法，其發(fā)酵方法中至少應(yīng)用一種漆酶或漆酶相關(guān)的酶。可在發(fā)酵期間應(yīng)用有效劑量的漆酶，和/或在發(fā)酵之前例如，在發(fā)酵生物增殖期間應(yīng)用有效劑量的漆酶。
在本發(fā)明文本中，漆酶包括任何酶分類(EC 1.10.3.2)所包含的漆酶、任何酶分類(EC 1.10.3.1)所包含的兒茶酚氧化酶、任何酶分類(EC 1.3.3.5)所包含的膽紅素氧化酶或酶分類(EC 1.14.18.1)所包含的單酚單加氧酶和任何其它漆酶相關(guān)酶。
上述酶可來自植物、細(xì)菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)，適當(dāng)?shù)膶?shí)例包括來自下列菌屬的漆酶曲霉屬；脈孢菌屬，例如粗糙脈孢菌；柄孢殼菌屬(Podospora)；萄萄孢屬(Botrytis)；金錢菌屬(Collybia)；層孔菌屬(Fomes)；香菇屬(Lentinus)；側(cè)耳屬(Pleurotus)；栓菌屬(Trametes)，例如長絨毛栓菌(T.villosa)和變色栓菌(T.versicolor)；絲核菌屬(Rhizoctonia)，例如立枯絲核菌(R.solani)；鬼傘屬(Coprinus)，例如灰蓋鬼傘、毛頭鬼傘(C.comatus)、費(fèi)賴斯鬼傘(C.friesii)和折蓋鬼傘(C.plicatilis)；脆柄菇屬(Psathyrella)，例如白黃脆柄菇(P.condelleana)；斑褶菇屬(Panaeolus)，例如蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)；毀絲霉屬，例如嗜熱毀絲霉(M.thermophila)；柱頂孢霉屬(Schytalidium)，例如嗜熱柱頂孢(S.thermophilum)；多孔菌屬(Polyporus)，例如薄蓋多孔菌(P.pinsitus)；密孔菌屬(Pycnoporus)，例如朱紅密孔菌(P.cinnabarinus)；射脈菌屬(Phlebia)，例如輻射射脈菌(P.radita)(WO92/01046)，或革蓋菌屬(Coriolus)，例如毛革蓋菌(C.hirsutus)(JP2-238885)。
優(yōu)選來自下列菌屬的漆酶鬼傘屬(Coprins)、毀絲霉屬、多孔菌屬、密孔菌屬、柱頂孢霉屬(Scytalidium)或絲核菌屬，具體為來自下列菌種的漆酶灰蓋鬼傘(Coprins cinereus)、嗜熱毀絲霉、薄蓋多孔菌、朱紅密孔菌、嗜熱柱頂孢或立枯絲核菌。
本發(fā)明另一方面涉及方法，通過在至少有一種蛋白酶存在時增殖發(fā)酵微生物，制備發(fā)酵方法使用的發(fā)酵微生物。雖然未限定于任何一種工作原理，但是在存在有效劑量的至少一種蛋白酶時增殖發(fā)酵微生物，當(dāng)該發(fā)酵微生物隨后被用于發(fā)酵方法時，同相同條件不加入該蛋白酶相比，發(fā)酵微生物的遲滯期減少。在增殖過程中蛋白酶的作用被認(rèn)為是直接或間接地導(dǎo)致基因的抑制或表達(dá)，該基因在發(fā)酵期間對發(fā)酵微生物的性能分別有害或有益，從而降低遲滯期并加快發(fā)酵循環(huán)。
在增殖中使用的蛋白酶優(yōu)選包括如上所述的蛋白酶，包括酸性蛋白酶。
實(shí)施例 實(shí)施例1 加入一種酯酶，具體為一種脂肪酶，在類似于乙醇發(fā)酵方法的厭氧發(fā)酵條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照液化-糖化-發(fā)酵(LSF)同步方案，在研磨粉碎的黃色干玉米中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用數(shù)量為0.0(對照)；0.8；1.0和1.2GAU/g DS的葡糖淀粉酶(Spirizyme Plus，購自Novozymes A/S)和數(shù)量為1.6AFAU/g DS的真菌α-淀粉酶(SP288，購自Novozymes A/S)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將其與采用脂肪酶(南極念珠菌脂肪酶)的發(fā)酵相比較，后者脂肪酶277L/U g DS結(jié)合使用1.0GAU葡糖淀粉酶(Spirizyme Plus)和1.6AFAU/g DS真菌α-淀粉酶(SP288)。所有發(fā)酵在pH＝5.0，32℃進(jìn)行72小時。通過時間監(jiān)控過程，并分析CO2重量損失、乙醇生成百分比和淀粉理論轉(zhuǎn)換值。
表1說明使用脂肪酶和不使用脂肪酶進(jìn)行發(fā)酵的差異。于32℃經(jīng)72小時，加入脂肪酶可獲得20％的乙醇產(chǎn)量且速度提高，其優(yōu)于使用任何濃度葡糖淀粉酶而不使用脂肪酶處理。
表1
實(shí)施例2 實(shí)施例2按照液化-糖化-發(fā)酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黃色玉米中進(jìn)行試驗(yàn)。使用數(shù)量為0.8GAU/g DS的葡糖淀粉酶(Spirizyme Plus，購自Novozymes A/S)和數(shù)量為2.6AFAU/g DS的真菌α淀粉酶(SP288，購自Novozymes A/S)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入下列酶用于乙醇發(fā)酵 (A)脂肪酶(LIPOLASE，購自Novozymes A/S)， (B)南極念珠菌脂肪酶， (C)角質(zhì)酶(JC492，購自Novozymes A/S) (D)磷脂酶(LECITASE購自Novozymes A/S) (E)滅活的南極念珠菌脂肪酶(通過煮沸3小時滅活)，和 (F)對照(不使用酯酶的葡糖淀粉酶和淀粉酶)。
加入酯酶的劑量相當(dāng)于200U/g DS。發(fā)酵在pH＝5.0，32℃條件下進(jìn)行數(shù)小時。通過時間監(jiān)控過程并分析CO2重量損失、乙醇生成百分比和淀粉理論轉(zhuǎn)換值。
如表2所示，在所有活性酯酶實(shí)驗(yàn)中均觀察到乙醇速度和產(chǎn)量(相應(yīng)的脂肪酸增加)的提高。效率定義為每單位固體生成的乙醇量。在南極念珠菌脂肪酶實(shí)驗(yàn)中觀察到最佳結(jié)果。
表2
實(shí)施例3 實(shí)施例3采用與實(shí)施例2相同的方法，只不過南極念珠菌脂肪酶僅部分滅活(通過煮沸10分鐘實(shí)現(xiàn))。如表3所示，盡管有部分失活，使用南極念珠菌脂肪酶仍然獲得了顯著改善。
表3
實(shí)施例4 實(shí)施例4按照液化-糖化-發(fā)酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黃色玉米中進(jìn)行試驗(yàn)。如實(shí)施例2和3所描述，分別在有和無脂肪酶存在時，使用葡糖淀粉酶和α淀粉酶在粉碎的黃色玉米中進(jìn)行乙醇發(fā)酵。發(fā)酵在pH＝5.0，32℃進(jìn)行數(shù)小時。除南極念珠菌脂肪酶和滅活的南極念珠菌脂肪酶外，還對硫酸亞鐵和純化的柱狀念珠菌脂肪酶以及南極念珠菌脂肪酶A進(jìn)行了比較。純化的脂肪酶用量少4倍。
如表4所示，在所有脂肪酶實(shí)驗(yàn)中，具體為在2個純化的脂肪酶(柱狀念珠菌脂肪酶和南極念珠菌脂肪酶A)中，經(jīng)48小時均觀察到乙醇產(chǎn)量的顯著改善。南極念珠菌脂肪酶A結(jié)果最佳，顯示效率為94.9％，48小時產(chǎn)量為18％。柱狀念珠菌脂肪酶顯示效率為89.2％，48小時產(chǎn)量17.8％。南極念珠菌脂肪酶顯示效率為89％，48小時產(chǎn)量17.6％。盡管酶的用量少4倍，仍然是純化的脂肪酶性能最佳。
表4
實(shí)施例5 實(shí)施例5按照液化-糖化-發(fā)酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黃色玉米中進(jìn)行試驗(yàn)。使用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，在有和沒有生長刺激物條件下，在粉碎的黃玉米中進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵在pH＝5.0，32℃進(jìn)行數(shù)小時。
如下加入維生素和礦物質(zhì) ACentrum(一種多種維生素)； B維生素E、Mg、Zn和Cr； C維生素A、C、D、E和維生素B1、核黃素、煙酸、葉酸、B-12，泛酸(鹽)； D葡糖胺和維生素C E對照，無加入 表5說明在48小時，加入維生素和礦物質(zhì)可獲得進(jìn)一步改善。
表5
實(shí)施例6 在實(shí)施例6-13中，設(shè)計(jì)25毫升一次性發(fā)酵罐用于實(shí)驗(yàn)。該發(fā)酵罐由購自美國Becton Dickinson Labware的50毫升聚丙烯錐形管組成。發(fā)酵閉合裝置(lock)由購自美國Fisher Scientific的一次性聚乙烯移液管，連接在5毫升注射器上制作而成。注射器裝有購自美國Fisher Scientific的0.45-IImWhatman PVDF注射器過濾器。
使用該25毫升一次性發(fā)酵罐，可在同一恒溫水浴箱內(nèi)操作多個樣品，以便消除由水溫變化所引起的普遍實(shí)驗(yàn)誤差。發(fā)酵完成后不需轉(zhuǎn)移樣品。還能在同一試管中將待分析樣品自旋沉淀下來，這大大減少了分析所需的時間。
酵母(Ethanol Red酵母，36％DS)于有氧、500轉(zhuǎn)/分鐘，32.2℃，在麥芽糖糊精中增殖16小時。通過將粉碎的玉米(2-毫米篩)和水混合制備玉米漿料，然后用無機(jī)酸調(diào)整pH值。
在即將用所得培養(yǎng)基裝填發(fā)酵罐前，將淀粉酶(1.1AFAU/g DS SP288)、葡糖淀粉酶(1.5GAU/g DS Spirizyme Plus)和酵母加入漿料中。
在裝填發(fā)酵罐之前加入下列相當(dāng)于200U/g DS數(shù)量的酯酶 A)脂肪酶(lipolase)100T(脂肪酶可從Novozymes購買)， B)南極念珠菌脂肪酶B(CALB)， C)Lecitase10L(磷脂酶，可從Novozymes購買)， D)JC492(角質(zhì)酶，可從Novozymes A/S購買)。
在25毫升發(fā)酵罐中發(fā)酵，不混合，于32.2℃72小時。于24，48和72小時測定CO2重量損失。發(fā)酵結(jié)束時，樣品在20℃，以3,000轉(zhuǎn)/分鐘向下旋轉(zhuǎn)15分鐘，使其通過0.45pm的過濾器，抽取約2毫升發(fā)酵醪液級分用于HPLC分析。
如上所述進(jìn)行不使用酯酶的對照實(shí)驗(yàn)。
如表6所示，所有酯酶實(shí)驗(yàn)均顯著提高乙醇產(chǎn)量。根據(jù)CO2重量損失計(jì)算24小時和48小時的數(shù)據(jù)，72小時數(shù)據(jù)通過HPLC獲得。
用純化的酯酶處理的過程效率也顯著增加，具體為，在使用南極念珠菌脂肪酶B時達(dá)到95.1％，如下表7所示。
表6
表7 實(shí)施例7 實(shí)例7使用Alltech SuperStart酵母，36％DS，1GAU/g DS SpirizymeFuel，0.8AFAU/g DS SP288進(jìn)行。酵母在麥芽糖糊精內(nèi)增殖。對濃度為.8LU/g DS、4LU/g DS和20LU/g DS的南極念珠菌脂肪酶A，以及濃度為.007％和.014％的蛋白酶(GC 106，購自Genencor)進(jìn)行了比較。發(fā)酵在25毫升發(fā)酵罐中進(jìn)行，不混合，于32.2℃持續(xù)72小時。
如表8所示，脂肪酶和蛋白酶對乙醇產(chǎn)量均有影響。但使用.8LU/g DS、4LU/g DS和20LU/g DS的脂肪酶效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用.007％DS和.014％DS的蛋白酶。
表8 實(shí)施例8 使用與實(shí)施例6所述相同的實(shí)驗(yàn)條件和酶濃度進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，只不過在發(fā)酵培養(yǎng)基中還加入加大樣品體積的蛋白酶(Novozyme 50006，0.007％DS)樣品。
同時使用滅活的CALB，以消除CALB制劑材料對獲得效果產(chǎn)生影響的可能性。通過煮沸3小時制備滅活的CALB對照。煮沸結(jié)束后，用DI水調(diào)整體積至初始值，樣品以3,000轉(zhuǎn)/分鐘向下旋轉(zhuǎn)20分鐘。由此該酶被徹底滅活。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表9所示。效率值為91.04％-95.87％，使用脂肪酶CALB顯示最佳結(jié)果。在對照樣品和滅活CALB處理樣品之間，乙醇產(chǎn)量沒有顯著差異(結(jié)果未顯示)。
實(shí)施例9 實(shí)施例9使用與實(shí)施例7所述相同的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，只不過在增殖時加入蛋白酶(Novozyme50006，0007％DS)。
在本實(shí)驗(yàn)中，純化的脂肪酶來自柱狀念珠菌，純化的脂肪酶A來自南極念珠菌(CALA)，加入量為100LU/g DS，純化的脂肪酶B來自南極念珠菌(CALB)，加入量為400LU/g DS。如表9所示，這些脂肪酶對乙醇產(chǎn)量和效率均有很大影響。
實(shí)施例10 本實(shí)施例比較了Lipolase100T和純化的Lipolase(兩者均購自Novozymes A/S)。實(shí)驗(yàn)條件如下Ethanol Red酵母，36％DS，1.5GAU/g DSSpirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麥芽糖糊精和蛋白酶中增殖。發(fā)酵在25毫升發(fā)酵罐中進(jìn)行，不混合，于32.2℃持續(xù)72小時。如上所述進(jìn)行不使用脂肪酶的對照實(shí)驗(yàn)。
如表9所示，這些脂肪酶對乙醇產(chǎn)量也有很大影響。
實(shí)施例11 比較了酸性脂肪酶(Amano G，購自Amano Enzyme，美國)和純化的柱狀念珠菌脂肪酶。實(shí)驗(yàn)條件如下Ethanol Red乙醇紅酵母，36％DS，2.0GAU/g DS Spirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麥芽糖糊精和蛋白酶中增殖(Novozym 50006)。在25毫升發(fā)酵罐中，不混合，于32.2℃72小時實(shí)施發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0.08％DS的蛋白酶(Novozym50006)。
如表9所示，酸性脂肪酶和純化的柱狀念珠菌脂肪酶顯示結(jié)果優(yōu)于對照。
實(shí)施例12 本實(shí)驗(yàn)比較了酸性脂肪酶(Amano G，購自Amano Enzyme，美國)，純化的磷脂酶(Lecitase Ultra，購自Novozymes)和純化的脂肪酶(Lipex，購自Novozymes)。實(shí)驗(yàn)條件如下Ethanol Red乙醇紅酵母，36％DS，2.0GAU/gDS Spirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麥芽糖糊精和蛋白酶Novozym 50006中增殖。在25毫升發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，不混合，于32.2℃72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.02％DS的Novozym 50006。
如表9所示，這些脂肪酶也得到優(yōu)于對照的結(jié)果。
實(shí)施例13 本實(shí)驗(yàn)比較了酸性脂肪酶(購自Amano Enzyme，美國)、純化的磷脂酶(Lecitase Ultra，購自Novozymes)、純化的脂肪酶(Lipex，購自Novozymes)和脂肪酶(Lipase100T，購自Novozymes)。實(shí)驗(yàn)條件如下Ethanol Red乙醇紅酵母，36％DS，2.0GAU/g DS Spirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麥芽糖糊精和Novozym 50006中增殖。
發(fā)酵在25毫升發(fā)酵罐中進(jìn)行，不混合，于32.2℃持續(xù)72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.02％DS的Novozym 50006。如表9所示，這些脂肪酶對乙醇產(chǎn)量也有顯著的影響。
表9 脂肪酶對乙醇產(chǎn)量和效率的影響。
實(shí)施例14 在類似于乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的厭氧發(fā)酵條件下加入漆酶進(jìn)行試驗(yàn)。按照液化-糖化-發(fā)酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黃色玉米中進(jìn)行試驗(yàn)。在使用和不使用漆酶的情況下，用葡糖淀粉酶(Spirizyme plus，購自NovozymesA/S)進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵在pH＝5.0，32℃進(jìn)行數(shù)小時。通過時間監(jiān)控過程，并分析CO2重量損失、乙醇生成百分比和淀粉理的論換算值。如表10所示，加入漆酶也能提高乙醇產(chǎn)量。
表10

權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，該方法包括發(fā)酵步驟，其包括使發(fā)酵步驟中所用的發(fā)酵微生物或發(fā)酵培養(yǎng)基與至少一種酯酶接觸，其中所述的酯酶是角質(zhì)酶。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中還包含脂肪酶、磷脂酶或它們的組合。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述微生物為酵母。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)品為乙醇。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟為同時糖化和發(fā)酵方法的一部分。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟為粗淀粉水解方法的一部分。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟在葡糖淀粉酶和淀粉酶存在的條件下進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵步驟為干法粉碎或濕法粉碎方法的一部分。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中用于粉碎方法的原材料為含淀粉的原材料。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中用于粉碎方法的原材料選自下組玉米、小麥、大麥或買羅高粱。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括去胚的谷物谷粒。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括去胚的玉米。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，還包括使發(fā)酵微生物或發(fā)酵培養(yǎng)基與選自下組的酶接觸蛋白酶、肌醇六磷酸酶和纖維素酶。
14.一種生產(chǎn)乙醇的方法，其包括
(a)粉碎完整谷粒；
(b)將步驟(a)的產(chǎn)物液化；
(c)將液化的材料糖化；
(d)使用微生物將糖化的材料發(fā)酵，其中所述發(fā)酵方法還包括使發(fā)酵微生物或含發(fā)酵微生物的培養(yǎng)基與至少一種酯酶接觸，其中所述的酯酶是角質(zhì)酶。
15.權(quán)利要求14所述的方法，還包括將發(fā)酵材料蒸餾。
16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述方法為同時液化和糖化方法，或同時液化、糖化和發(fā)酵方法。
17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括將α-淀粉酶、葡糖淀粉酶加入包含發(fā)酵微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基。
18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中還包含脂肪酶、磷脂酶或它們的組合。
19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物為酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵方法和組合物。本發(fā)明提供改進(jìn)的發(fā)酵方法，包括在乙醇生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。所述改進(jìn)的發(fā)酵方法包括在發(fā)酵方法中應(yīng)用酯酶(例如脂肪酶、磷酸脂酶和角質(zhì)酶)、漆酶、植酸酶和/或蛋白酶。所述改進(jìn)的發(fā)酵方法還包括加入刺激發(fā)酵微生物生長的多種生長刺激物，包括維生素和礦物質(zhì)。
文檔編號C12G3/02GK101532032SQ20091012992
公開日2009年9月16日 申請日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月26日
發(fā)明者瓦瓦拉·格里奇科 申請人:諾維信北美公司