專利名稱：一種蝦青素的工業(yè)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蝦青素的制備方法。
背景技術(shù)：
蝦青素(astaxanthin)化學(xué)名稱為3，二羥基礎(chǔ)-β，β -胡蘿卜素-4，4、_ 二 酮，又稱蝦黃質(zhì)、蝦黃素、龍蝦殼色素，分子式為C4OH52O4，是一種非維生素A源類胡蘿卜素， 廣泛存在于生物界中，特別是水產(chǎn)動(dòng)物的蝦、蟹、魚和鳥類的羽毛中。蝦青素具有水溶性和 親脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有機(jī)溶劑。
蝦青素為極具發(fā)展前景的營(yíng)養(yǎng)色素和抗氧化劑類的物質(zhì)，能吸收活性純態(tài)氧而防 止其它分子或組織的過氧反應(yīng)。它具有強(qiáng)抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗機(jī)體著色等多種生物 活性，在醫(yī)藥、功能性食品、化妝品、飼料添加劑、化工等行業(yè)已有著廣闊的市場(chǎng)需求并具有 廣闊的開發(fā)前景。蝦青素是一種極具潛力的類胡蘿卜素添加劑，具有以下幾方面的功能具 有獨(dú)特的著色功能，在進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后可以不經(jīng)修飾或生物轉(zhuǎn)化而直接儲(chǔ)存、沉積在組織 中，從而使魚類的肉質(zhì)、蝦殼和家禽的表皮及卵黃著色，使其色澤鮮艷；其次蝦青素還具有 許多重要的生理功能，其在促進(jìn)抗體的產(chǎn)生、增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能、抗氧化、清除自由基的 產(chǎn)生等方面的能力均強(qiáng)于胡蘿卜素；另外，養(yǎng)殖方面的研究也表明，蝦青素對(duì)魚類的生 長(zhǎng)繁殖有重要的作用，可作為激素促進(jìn)魚卵受精，減少胚胎發(fā)育的死亡率，促進(jìn)個(gè)體生長(zhǎng)， 增加成熟度和生殖力，如瑞士羅氏公司的研究者們注意到高色素魚卵比低色素魚卵對(duì)光敏 感度低，且繁育率高。而蝦青素具有的免疫刺激作用對(duì)于解決當(dāng)今集約化生產(chǎn)引起的疾病 問題具有重要的意義。目前，進(jìn)入市場(chǎng)的蝦青素根據(jù)其生產(chǎn)來源可分為1、化學(xué)合成的蝦青素用化學(xué)法生產(chǎn)蝦青素不僅生產(chǎn)成本高，難以在飼料中推廣應(yīng)用，而且還存在一定 殘留毒性，F(xiàn)DA(美國(guó)食品和藥物管理局)只批準(zhǔn)其在飼料工業(yè)中應(yīng)用，不能應(yīng)用于藥品及 食品領(lǐng)域。而且，在歐盟已經(jīng)開始質(zhì)疑化學(xué)合成蝦青素對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的安全性，并擬就是否允 許其繼續(xù)在飼料中運(yùn)用展開討論。2、天然來源的蝦青素，其中天然蝦青素的生產(chǎn)方法主要有三種1)從水產(chǎn)下腳料(蝦、蟹的殼等)中提取，但從水產(chǎn)下腳料(蝦、蟹的殼等)中提 取蝦青素常由于原料不穩(wěn)定、蝦青素含量低及工藝復(fù)雜等而無實(shí)際生產(chǎn)意義。2)從露天養(yǎng)殖的藻類中提取，藻類養(yǎng)殖法生產(chǎn)蝦青素主要是利用雨生紅球藻，該 藻不僅蝦青素含量較高[折0. 16 % 1. 61 % (干藻體)]，而且具有耐高溫，耐極端ρΗ值， 易在戶外培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是一種具有產(chǎn)業(yè)化前景的天然蝦青素資源。但是該藻生 長(zhǎng)及合成、積累蝦青素需要強(qiáng)光照、高溫、高滲透壓，需采用露天大水面(海水)養(yǎng)殖，因此 這種養(yǎng)殖方法存在如下弱點(diǎn)①受地理和氣候條件的限制，如只有少數(shù)地區(qū)具備相對(duì)適宜氣候環(huán)境，且受季 節(jié)、天氣等變化的影響明顯；如養(yǎng)殖期間遇到暴雨因養(yǎng)殖水體滲透壓急劇降低導(dǎo)致藻體細(xì)胞破潰死亡等；②雨生紅球藻生長(zhǎng)極慢，養(yǎng)殖周期長(zhǎng)(一個(gè)培養(yǎng)周期常需一個(gè)月)，生產(chǎn)效 率低；③在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期內(nèi)抵抗細(xì)菌和原生動(dòng)物污染的能力差，不易建立穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)技 術(shù)體系；④占用場(chǎng)地大，養(yǎng)殖水體中藻體密度小，折算為，且含有其它浮游生物雜質(zhì)；⑤雨 生紅球藻中的蝦青素是以酯化的形式存在的，動(dòng)物的消化利用率及生物活性都偏低。3)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然蝦青素，具有使用場(chǎng)地小，不受地 理和氣候條件限制，發(fā)酵液中蝦青素合成積累快，含量高(濃度大)、雜質(zhì)少，生產(chǎn)周期短， 效率高，蝦青素產(chǎn)品活性強(qiáng)、安全等許多優(yōu)勢(shì)。通過高產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵工藝控制等可提 高蝦青素的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在于提供一種利用優(yōu)選的高產(chǎn)菌種，結(jié)合生物技術(shù)與發(fā)酵工程技 術(shù)，低成本、高產(chǎn)量地生產(chǎn)天然蝦青素的方法。所說的蝦青素的制備方法如下1)按體積比菌種培養(yǎng)基為1 (5 10)，將菌種接種至裝有培養(yǎng)基的250ml搖 瓶中，在20 25V的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)20 30小時(shí)；然后按照8 12 %的 接種量接種至裝有培養(yǎng)基的IOOOml的搖瓶，在20 25°C的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng) 20 30小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為6 8g/L ；2)按照8 12%的接種量接種到裝有培養(yǎng)基的1000L種子發(fā)酵罐，整個(gè)發(fā)酵過程 采用28 % 30 %氨水控制pH在5. 5 6. 0，培養(yǎng)溫度20 25 °C，通氣量12m3/h，培養(yǎng)20 30小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為18 20g/L ；3)按照8 12%的接種量接種到裝有培養(yǎng)基的8000L種子發(fā)酵罐，整個(gè)發(fā)酵過程 采用28 % 30 %氨水控制pH在5. 5 6. 0，培養(yǎng)溫度20 25 °C，通氣量37m3/h，溶氧控制 在10% 60%，葡萄糖濃度維持在5g/L以下；通過流加碳源發(fā)酵培養(yǎng)120 130小時(shí)，放 罐，測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為80 100g/L，蝦青素含量達(dá)到400mg/L。上述菌種為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌種。上述搖瓶培養(yǎng)基配方為葡萄糖25 35g/L，酵母粉20 30g/L。上述1000L種子罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 25g/L ；蔗糖9. 8 12g/L ；酵母 膏14 16g/L ；乙酸銨2. 3 2. 5g/L ；硫酸鎂2. 0 2. 4g/L ；磷酸二氫鉀5. 7 6. Ig/ L0上述8000L種子發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 25g/L ；蔗糖9. 8 12g/L ； 酵母膏14 16g/L ；乙酸銨2. 3 2. 5g/L ；硫酸鎂-.2. 0 2. 4g/L ；磷酸二氫鉀5. 7 6. lg/L ；氯化鈣0. 19 0. 21g/L ；硫酸銨5. 4 5. 6g/L ；硫酸錳4. 9 5. lg/L ；七水硫 酸鋅6. 9 7. lmg/L ；五水硫酸銅2. 6 3. Omg/L ；鉬酸鈉0. 16 0. 19mg/L ；維生素B6 2. 9 3. lmg/L ；甘氨酸3. 9 4. lg/L ；谷氨酸2. 0 2. 2g/L ；色氨酸1. 7 2. 0g/L ；賴 氨酸0. 6 0. 8g/L。本發(fā)明選用紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)通過優(yōu)化培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)條件， 采用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，經(jīng)過5天培養(yǎng)，在8000L發(fā)酵罐中發(fā)酵液的細(xì)胞干重達(dá)到80 IOOg/ L，蝦青素達(dá)到400mg/L，蝦青素生產(chǎn)率達(dá)到80毫克/ (升 天)，比已見報(bào)道的蝦青素生產(chǎn) 率高出20倍以上。其生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高，發(fā)酵過程工藝控制簡(jiǎn)單，適用于蝦青素的發(fā)酵法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 1)按葡萄糖30g/L，酵母粉25g/L配制搖瓶培養(yǎng)基，配制完 成后利用氫氧化鈉調(diào) 節(jié)pH7. 5，121°C，30min滅菌，滅菌后調(diào)節(jié)pH 6. 0備用；2)取保藏于超低溫冰箱的甘油管紅法夫酵母菌種5ml，接種至裝有50ml培養(yǎng)基的 250ml的搖瓶中，在22°C的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24小時(shí)；然后按照10%的接種量 接種至裝有300ml培養(yǎng)基的IOOOml的搖瓶，在22°C的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24小 時(shí)。測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為7g/L。3)按葡萄糖23g/L，蔗糖10g/L，酵母膏15g/L，乙酸銨2. 4g/L，硫酸鎂2. 2g/ L,磷酸二氫鐘5. 8g/L配制1000L種子罐培養(yǎng)基，配制完成后利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7. 5， 121°C，30min滅菌，滅菌后調(diào)節(jié)pH 6. 0備用；4)將搖瓶種子按照10%的接種量接種到裝有500L培養(yǎng)基的1000L種子發(fā)酵罐 后，整個(gè)發(fā)酵過程利用28%氨水控制pH在5. 5 6. 0之間，培養(yǎng)溫度22 °C，通氣量12m3/h， 培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為20g/L。5)按照葡萄糖23g/L，蔗糖10g/L，酵母膏15g/L，乙酸銨，硫酸鎂2.2g/L， 磷酸二氫鉀5. 8g/L，氯化鈣0. 20g/L，硫酸銨5. 5g/L，硫酸錳4. 9g/L，七水硫酸鋅7mg/ L，五水硫酸銅2. 6mg/L,鉬酸鈉0. 17mg/L,維生素B6 :3mg/L，甘氨酸4. Og/L,谷氨酸 2. lg/L，色氨酸1. 9g/L，賴氨酸0. 7g/L進(jìn)行8000L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配制，配制完成后利用 氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH7. 5，12rC,30min滅菌，滅菌后調(diào)節(jié)pH 6. 0備用；6)將1000L種子罐按照10%接種量接種至裝有5000L培養(yǎng)基料液的8000L發(fā)酵 罐，整個(gè)發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度22 °C，通氣量37m3/h ；用28 %氨水控制pH在5. 5 6. 0之間，利 用攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧在10% 60%之間；通過流加碳源進(jìn)行發(fā)酵，始終使發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖 濃度維持在5g/L以下，在以上培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)5天，放罐。在8000L發(fā)酵罐中發(fā)酵液 的細(xì)胞干重達(dá)到100g/L，蝦青素含量達(dá)到400mg/L，蝦青素生產(chǎn)率達(dá)到80毫克/ (升 天)。實(shí)施例2 1)按葡萄糖35g/L，酵母粉20g/L配制搖瓶培養(yǎng)基，配制完成后利用氫氧化鈉調(diào) 節(jié)pH7. 5，121°C，30min滅菌，滅菌后調(diào)節(jié)pH 6. 0備用；2)取保藏于超低溫冰箱的甘油管紅法夫酵母菌種10ml，接種至裝有50ml培養(yǎng)基 的250ml的搖瓶中，在25°C的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)30小時(shí)；然后按照12%的接種 量接種至裝有300ml培養(yǎng)基的IOOOml的搖瓶，在22°C的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24 小時(shí)。測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為8g/L。3)按葡萄糖:25g/L,蔗糖9. 8g/L，酵母膏14g/L，乙酸銨2. 3g/L，硫酸鎂 2. Og/L,磷酸二氫鉀6. lg/L,配制1000L種子罐培養(yǎng)基，配制完成后利用氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH7. 5，121°C，30min滅菌，滅菌后調(diào)節(jié)pH 6. 0備用；4)將搖瓶種子按照8%的接種量接種到裝有500L培養(yǎng)基的1000L種子發(fā)酵罐后， 整個(gè)發(fā)酵過程利用30%氨水控制pH在5. 5 6. 0之間，培養(yǎng)溫度25°C，通氣量12m3/h，培養(yǎng)30小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)胞干重為18g/L。5)照葡萄糖25g/L，蔗糖9.8g/L，酵母膏14g/L，乙酸銨2.5g/L，硫酸鎂 2. 4g/L，磷酸二氫鉀5. 7g/L，氯化鈣0. 21g/L，硫酸銨5. 4g/L，硫酸錳5. Og/L，七水硫酸 鋅6. 9mg/L,五水硫酸銅2. 9mg/L,鉬酸鈉0. 19mg/L,維生素B6 3. lmg/L,甘氨酸3. 9g/ L,谷氨酸-.2. 2g/L，色氨酸1. 8g/L，賴氨酸0. 8g/L，進(jìn)行8000L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配制，配制 完成后利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH7. 5，12rC,30min滅菌，滅菌后調(diào)節(jié)pH 6. 0備用；6)將1000L種子罐按照8%接種量接種至裝有5000L培養(yǎng)基料液的8000L發(fā)酵罐，整個(gè)發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度25°C，通氣量37m3/h ；用30%氨水控制pH在5. 5 6. 0之間，利用 攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧在40% 60%之間；通過流加碳源進(jìn)行發(fā)酵，始終使發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖濃 度維持在5g/L以下，在以上培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)5天，放罐。在8000L發(fā)酵罐中發(fā)酵液的 細(xì)胞干重達(dá)到80g/L，蝦青素含量達(dá)到400mg/L，蝦青素生產(chǎn)率達(dá)到80毫克/ (升 天)。
權(quán)利要求
一種蝦青素的工業(yè)制備方法，其特征在于所說的蝦青素的制備方法如下1)按體積比菌種培養(yǎng)基為1∶(5～10)，將菌種接種至裝有培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在20～25℃的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)20～30小時(shí)；然后按照8～12％的接種量接種至裝有培養(yǎng)基的1000ml的搖瓶，在20～25℃的搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)20～30小時(shí)；2)按照8～12％的接種量接種到裝有培養(yǎng)基的1000L種子發(fā)酵罐，整個(gè)發(fā)酵過程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培養(yǎng)溫度20～25℃，通氣量10～12m3/h，培養(yǎng)20～30小時(shí)；3)按照8～12％的接種量接種到裝有培養(yǎng)基的8000L種子發(fā)酵罐，整個(gè)發(fā)酵過程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培養(yǎng)溫度20～25℃，通氣量35～37m3/h，溶氧控制在10％～60％，葡萄糖濃度維持在5g/L以下；通過流加碳源發(fā)酵培養(yǎng)120～130小時(shí)，放罐。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蝦青素的工業(yè)制備方法，其特征在于上述菌種為紅法夫酵 母(Phaffia rhodozyma)胃禾1f1。
3.如權(quán)利要求1所述的一種蝦青素的工業(yè)制備方法，其特征在于上述搖瓶培養(yǎng)基配方 為葡萄糖25 35g/L，酵母粉20 30g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的一種蝦青素的工業(yè)制備方法，其特征在于上述1000L種子罐培 養(yǎng)基配方為葡萄糖20 25g/L ；蔗糖9. 8 12g/L ；酵母膏14 16g/L ；乙酸銨2. 3 2. 5g/L ；硫酸鎂2. 0 2. 4g/L ；磷酸二氫鉀5. 7 6. lg/L。
5.如權(quán)利要求1所述的一種蝦青素的工業(yè)制備方法，其特征在于上述8000L種子發(fā)酵 罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 25g/L ；蔗糖9. 8 12g/L ；酵母膏14 16g/L ；乙酸銨 2. 3 2. 5g/L ；硫酸鎂2. 0 2. 4g/L ；磷酸二氫鉀5. 7 6. lg/L ；氯化鈣0. 19 0. 21g/ L ；硫酸銨5. 4 5. 6g/L ；硫酸錳4. 9 5. lg/L ；七水硫酸鋅6. 9 7. lmg/L ；五水硫酸 銅2. 6 3. Omg/L ；鉬酸鈉0. 16 0. 19mg/L ；維生素 B6 2. 9 3. lmg/L ；甘氨酸3. 9 4. lg/L ；谷氨酸2. 0 2. 2g/L ；色氨酸1. 7 2. Og/L ；賴氨酸0. 6 0. 8g/L。
全文摘要
一種蝦青素的工業(yè)制備方法，涉及蝦青素的制備方法。提供一種利用優(yōu)選的高產(chǎn)菌種，結(jié)合生物技術(shù)與發(fā)酵工程技術(shù)，低成本、高產(chǎn)量地生產(chǎn)天然蝦青素的方法。所說的制備方法如下按體積比菌種培養(yǎng)基為1∶(5～10)，將菌種在搖瓶中培養(yǎng)到發(fā)酵液中細(xì)胞干重為6～8g/L，然后再按8～12％的接種量接種到1000L種子發(fā)酵罐中培養(yǎng)到發(fā)酵液中細(xì)胞干重為18～20g/L，最后按8～12％的接種量接種到8000L種子發(fā)酵罐，經(jīng)過5天培養(yǎng)，在8000L發(fā)酵罐中發(fā)酵液的細(xì)胞干重達(dá)到80～100g/L，蝦青素達(dá)到400mg/L，蝦青素生產(chǎn)率達(dá)到80毫克/(升·天)。其生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高，比已見報(bào)道的蝦青素生產(chǎn)率高出20倍以上。且發(fā)酵過程工藝控制簡(jiǎn)單，適用于蝦青素的發(fā)酵法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P23/00GK101812497SQ20091013062
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者鐘惠昌 申請(qǐng)人:廈門匯盛生物有限公司