專利名稱：成熟miRNA定量檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中一種標(biāo)本中成熟miRNA的定量檢測方法及試劑盒，可用于 標(biāo)本中成熟miRNA的表達(dá)量分析及臨床檢測。
背景技術(shù)：
miRNA (microRNA)是一類非編碼、內(nèi)源性的小RNA，長約21 25核苷酸 (nucleotides，nt)。目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并被miRBase數(shù)據(jù)庫收錄的人類miRNA有695種，絕大 多數(shù)miRNA可以通過與靶基因的3-UTR區(qū)互補結(jié)合，抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而在細(xì)胞 及組織水平影響生物體的發(fā)育，并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。一系列的研究表明miRNA 在細(xì)胞成長、細(xì)胞分化及凋亡、同源異性盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元極性、胰島素分泌、胚胎發(fā)育中 的大腦形成及心臟發(fā)生、代謝等過程中都發(fā)揮著重要作用。成熟miRNA作為體液中客觀存 在的標(biāo)志物，其表達(dá)量的檢測也將有很重要的臨床意義。自1993年首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來，檢測其表達(dá)水平的技術(shù)方法也發(fā)展了許多種，目 前已有的檢測方法主要有(I)Northern雜交法從1993年始，Northern雜交法就被應(yīng)用 于miRNA表達(dá)譜研究，也是首個用于半定量檢測miRNA的實驗技術(shù)，通過將已知濃度梯度的 寡核苷酸參照物與待測樣品進(jìn)行平行雜交，實現(xiàn)對miRNA的半定量檢測。而后，Northern 雜交法成為檢測細(xì)胞中miRNA表達(dá)的常規(guī)研究方法之一。但Northern雜交法最大的缺點 是對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時樣品量需要達(dá)到40yg才 會出現(xiàn)明顯雜交信號；(2)原位雜交法原位雜交分為細(xì)胞和組織內(nèi)原位雜交，該技術(shù)檢測 miRNA表達(dá)，可更直觀的展示出miRNA的時空表達(dá)模式。該技術(shù)可以檢測同一細(xì)胞系中單 個細(xì)胞中的miRNA表達(dá)，也可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細(xì)胞系中miRNA的表達(dá) 水平，是分析miRNA表達(dá)的組織和時序特異性的有力工具。但其同樣存在跟Northern雜交 的缺點，那就是對樣品的需求量高，很難在一般的檢測實驗中推廣；(3)基因芯片最初的 miRNA基因芯片，是將反義DNA探針點在尼龍膜上，然后以5'端放射性標(biāo)記的miRNA樣品 雜交，再經(jīng)放射自顯影獲得信號。經(jīng)過發(fā)展，基因芯片技術(shù)敏感度有了很大提高，且可用于 多個miRNA同時檢測，但仍有很多不足之處基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設(shè)備、 結(jié)果是半定量的、重復(fù)性較差、不能同時優(yōu)化所有待測miRNA的雜交環(huán)境、不能區(qū)分高度類 似的miRNA等；(4)半定量RT-PCR =RT-PCR作為半定量檢測miRNA表達(dá)的常用實驗方法，在 研究miRNA表達(dá)的過程中不斷得到改進(jìn)。半定量RT-PCR是常用的一種簡潔、快速、特異的 相對定量的RNA檢測技術(shù)，有研究用該技術(shù)成功對比了待測和對照樣本之間特異miRNA的 表達(dá)差異，但只能測定miRNA的相對含量。該技術(shù)有以下優(yōu)點可在較短時間內(nèi)獲得結(jié)果； 高通量，可同時檢測多種miRNA的表達(dá)；與Northern雜交相比，僅需少量RNA，且不用放射 性同位素標(biāo)記；操作過程簡單。但該技術(shù)檢測miRNA表達(dá)時也有以下缺點有的miRNA和其 他miRNA具有同源區(qū)域，它們的引物序列就是miRNA基因序列5'端的一部分，檢測的特異 性不容易控制，不能很好的區(qū)分標(biāo)本中的成熟miRNA和前體miRNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種可以特異性定量檢測標(biāo)本中成 熟miRNA的簡便、實用的方法及成套的試劑盒，可用于多種類型標(biāo)本中成熟miRNA的表達(dá)量 分析及臨床檢測。本發(fā)明所涉及的miRNA檢測方法，其特征在于提取總RNA(含miRNA)，以發(fā)卡結(jié) 構(gòu)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA，以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進(jìn)行實時 熒光PCR定量檢測成標(biāo)本中成熟miRNA的含量。該檢測方法通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)⑴ 總RNA提取A、樣品處理；B、RNA分離；C、RNA沉淀；D、RNA洗滌；E、RNA溶解；F、RNA濃度測 定；G、RNA電泳檢測。(2) RNA的逆轉(zhuǎn)錄以一個包含20_230nt長度的發(fā)卡序列和6_30nt 特異性序列的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴增相應(yīng)的成熟miRNA的第一鏈cDNA。(3)熒光定量 PCR檢測以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進(jìn)行實時熒光PCR定量檢測標(biāo)本中成 熟miRNA的含量。檢測的基本原理示意圖見附圖1，下面將通過一個具體實施方式
詳細(xì)描述 該技術(shù)方案。該技術(shù)有以下優(yōu)點高度特異性，特異的發(fā)卡反轉(zhuǎn)錄引物確保反應(yīng)不受其前體及 基因組DNA污染等因素的干擾，對序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范 圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數(shù)量級；樣品消 耗少，僅需1 IOng的總RNA ；適用范圍廣，總RNA、細(xì)胞裂解物以及純化的RNA都可作為標(biāo) 本用于miRNA的定量檢測，也可用于其他小分子RNA的檢測，如siRNA。


圖1是檢測的基本原理示意圖；圖2是RNA的電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例一人血液中hsa-miR-29a miRNA的定量檢測1、總 RNA 提取(1)樣品處理取100 μ L 500 μ L血液標(biāo)本，加imL TRIzol試劑，反復(fù)混勻；(2) RNA分離室溫放置上述樣品液10分鐘，加入氯仿200 μ L，劇烈振蕩約1分鐘， 室溫靜置5分鐘，4°C 12000g離心15分鐘，小心取出樣品，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)樣品分三層， 其中最上層含有RNA組份；(3) RNA沉淀小心吸取上清液約450 μ L至含有600 μ L冰冷異丙醇的新離心管 中，混勻，4°C 12000g離心10分鐘；(4) RNA洗滌去上清，加入500 μ L冷凍的75%乙醇，彈起沉淀，4°C 12000g離心5 分鐘，去上清，4°C 12000g再離心5分鐘，吸去上清液；(5) RNA溶解風(fēng)干約5 10分鐘，加入DEPC處理水約30 μ L，溶解RNA ；(6) RNA濃度測定吸取1 μ L RNA用DEPC水稀釋10倍后，在微量分光光度計上測 定RNA濃度，以DEPC水做空白對照，同時記錄RNA濃度及其0D26(1/0D28(1，按照公式計算RNA 濃度，RNA濃度=40ng/μ LXOD260 X稀釋倍數(shù)；
(7) RNA電泳檢測A、變性膠制備取1. 2g瓊脂糖加75mL去離子水煮沸，冷卻至 70°C左右加入IOmL 10XMops和15mL甲醛及適量溴化乙錠，倒膠至插有梳子的膠板上；B、 電泳緩沖液配制(IXMops)取50mL 10 XMops，用去離子水稀釋至500mL，倒入電泳槽中； C、RNA樣品處理取RNA樣品約9yL，65°C變性IOmin后立即冷卻，加入IyLlO X RNA上樣 緩沖液；D、RNA電泳把RNA膠放入電泳槽中，100V作用電泳約5min，再在點樣孔中點入處 理過的RNA樣品，100V左右電泳至溴酚藍(lán)至膠的1/3處，取膠觀察或拍照；(8) RNA抽提結(jié)果RNA電泳圖見附圖2 ；(9)所得總RNA可立即使用或放-80°C保存；2、檢測用相關(guān)引物設(shè)計根據(jù)hsa-miR-29a的序列ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG設(shè)計實驗所需的弓丨物如下(1)發(fā)卡結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物為5 ’ GACCGACATCACGTACACTCCGAGGTACTTACGTGATGTC GGTCCTGAAC 3 ’，前面 55nt 的序 列是發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)，后面6nt的序列是針對miRNAhsa-miR-29am的特異性序列；(2)正向引物為5，ACTGATTTCTTTTGGTGTTCAG 3，；(3)反向引物為5，GACCGACATCACGTACACTCC 3，；3、RNA的逆轉(zhuǎn)錄(1)在冰上按如下比例配制RNA及引物混合液上述所得總RNA2 μ L，10 μ M逆轉(zhuǎn) 錄引物1 μ L，去RNA酶超純水7 μ L，總體積為10 μ L ；(2)混勻上述RNA及引物混合液，短暫離心，放65°C變性10分鐘，置冰上2分鐘；(3)按如下比例配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液RNA及引物混合液10μ L，5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖 液 5 μ L，IOmM dNTPs 4 μ L，25U/ μ L RNA 酶抑制劑 1 μ L, 200U/ μ L M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L，去 RNA酶超純水4 μ L，總體積為25 μ L ；(4)混勻上述反應(yīng)混合物，短暫離心，置42°C反應(yīng)60分鐘，95°C 5分鐘滅活處理；(5)所得產(chǎn)物是單鏈cDNA，可立即使用或放置于_20°C保存。4、熒光定量PCR檢測反應(yīng)(1)在冰上按如下比例配制熒光定量PCR的反應(yīng)液10X熒光定量PCR緩沖液 2 μ L, 5U/ μ L DNA 聚合酶 0. 5 μ L，40 X 熒光定量染料 0. 5 μ L，IOmM dNTPs 2μ ，2μΜ 正向 弓丨物2 μ L，2 μ M反向弓丨物2 μ L，單鏈cDNA 2 μ L，去RNA酶超純水9 μ L，總體積為20 μ L ；(2)混勻上述熒光定量PCR的反應(yīng)液，移至PCR反應(yīng)管，短暫離心使所有試劑到反 應(yīng)管底部；(3)熒光定量PCR反應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)的三步法進(jìn)行檢測，反應(yīng)循環(huán)設(shè)定如下95°C預(yù) 變性10分鐘；95°C變性10秒鐘，57°C退火20秒鐘，72°C延伸10秒鐘；40個循環(huán)；(4)擴增分析按照所用儀器的軟件分析擴增曲線及溶解曲線，確定標(biāo)本中的 has-miR-29a 的量。
權(quán)利要求
一種生物標(biāo)本中成熟miRNA的定量檢測方法，其特征在于提取總RNA(含miRNA)，以發(fā)卡結(jié)構(gòu)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA，以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進(jìn)行實時熒光PCR定量檢測標(biāo)本中成熟miRNA的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所采用的檢測標(biāo)本包含提純的總RNA、提純的小RNA及 未純化的全血、血清、血漿、唾液、尿液、組織液原液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，反轉(zhuǎn)錄引物采用的是發(fā)卡式結(jié)構(gòu)設(shè)計，包含發(fā)卡互補 區(qū)、發(fā)卡環(huán)狀區(qū)和特異性序列區(qū)。發(fā)卡序列的總長度為20-230nt，其中發(fā)卡互補區(qū)序列長 度為lO-lOOnt，發(fā)卡環(huán)狀區(qū)序列長度為lO-lOOnt，成熟miRNA特異性序列區(qū)的序列長度為 6-30nto
4.一種生物標(biāo)本中成熟miRNA的定量檢測試劑盒，其特征是包含以下組份(1)發(fā)卡 結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物；(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物；(3)熒光定量PCR反應(yīng)混合物；(4)無RNA酶超純 水。
5.如權(quán)利要求4所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物，其特征在于含有以下任何一種或多種組份 的組合(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，(2)dNTPs, (3)RNA酶抑制劑，(4)逆轉(zhuǎn)錄酶，(5)超純水。
6.如權(quán)利要求4所述的熒光定量PCR反應(yīng)混合物，其特征在于含有以下任何一種或多 種組份的組合(1)熒光定量PCR緩沖液，(2)DNA聚合酶，(3)熒光染料，(4)dNTPs，(5)正 向引物，(6)反向引物，(7)超純水。
7.上述任一項權(quán)利要求所述的內(nèi)容，用于任一種成熟miRNA的檢測試劑盒。
8.上述任一項權(quán)利要求所述的內(nèi)容，用于任一種成熟miRNA表達(dá)水平的分析及臨床檢測。全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物標(biāo)本中成熟miRNA的定量檢測方法及試劑盒。其主要步驟為提取總RNA(含miRNA)，以發(fā)卡結(jié)構(gòu)式引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA，以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進(jìn)行實時熒光PCR定量檢測成標(biāo)本中成熟miRNA的含量。本發(fā)明具有適用范圍廣、高特異性、高靈敏度及超寬的線性檢測范圍等優(yōu)點。該方法簡便快速，可廣泛用于成熟miRNA的表達(dá)量分析及臨床檢驗。
文檔編號C12Q1/68GK101871004SQ20091013571
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日
發(fā)明者馮長訪, 王保君, 陶建國 申請人:馮長訪