專利名稱：一種新型甲型流感病毒h1n1亞型雙色熒光pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本試發(fā)明涉及檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)以及甲型流感病毒各 亞型(IAV-U)mRNA的方法，特別是涉及使用雙色熒光探針定量PCR技術(PCR-雙色熒光探 針法)快速準確的檢測出樣品(包括咽拭子標本、血清、分泌物及病死動物肺臟組織等標 本)中新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型mRNA的方法。本發(fā)明進一步 涉及用于該病毒臨床檢測的試劑盒。
背景技術：
新型甲型流感病毒Hmi亞型是引起豬流感(Swine Influenza, Si)的主要病原 體，該種疾病是一種急性、人畜共患呼吸道傳染性疾病。1931年分離并鑒定了第一株甲型 流感病毒Hmi亞型。1976年，經典的甲型流感病毒Hmi亞型首次從意大利北部豬場中分 離到，這些病毒分離株與當時流行于美國的經典的豬流感有非常近的相關性。同年在美國 約500人感染了甲型流感病毒Hmi亞型，該病毒與當時從豬體內分離的病毒相同，首次證 實了在自然條件下，豬流感病毒可從豬傳播給人。國內報道多為Hmi和H3N2導致豬流感。 近年來，世界各地都有人感染豬流感病毒病不同毒株特別是Hmi亞型的報道，但并沒有大 規(guī)模流行。但是2009年4月份以來墨西哥及美國等國家地區(qū)暴發(fā)了人感染甲型流感病毒的 疫情。隨后，該疫情迅速在世界范圍內蔓延，短時間內，墨西哥、美國、加拿大、瑞士、奧地利、 秘魯、西班牙、英國、澳大利亞、韓國等國家和地區(qū)陸續(xù)有人感染甲型流感病毒疫情發(fā)生，不 到一個月內，全球確診病例和疑似累計幾千例，死亡幾百例，爆發(fā)之快，發(fā)展之迅速，令世人 震驚和恐懼，世界衛(wèi)生組織2009年4月29日將流感警戒級別上調至第五級，表明大流行迫 在眉捷。對此疫情，我國衛(wèi)生部和相關部門高度重視，已經采取相應應對措施，包括疫情預 防控制和病原檢測。全國各大疾病預防控制中心、各省級疾病預防控制中心、醫(yī)院、各級出 入境檢驗檢疫局和各級動物疫病控制中心對此高度重視。根據世界衛(wèi)生組織研究證實，墨西哥和美國等地區(qū)發(fā)生的人感染豬流感病毒為新 型甲型流感病毒Hmi亞型毒株，該毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基 因片斷，是一種新型流感病毒。人感染后的臨床早期癥狀與流感類似，有發(fā)燒、咳嗽、疲勞、 食欲不振等，還可以出現腹瀉或嘔吐等癥狀。病情可迅速進展，突然高熱、肺炎，重者可以出 現呼吸衰竭、多器官損傷，導致死亡。新型甲型流感病毒Hmi亞型屬于于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感 病毒屬(Influenza virusA)。病毒顆粒呈球狀，直徑為80nm 120nm，有囊膜。病毒由8個 分節(jié)段的單股負鏈RNA組成，病毒蛋白質含有5種多肽，即血凝素、神經氨酸酶、基質蛋白、 核蛋白和多聚酶。目前對于該種新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒的實驗室檢查主要 包括以下方面1.外周血象白細胞總數一般不高或降低。重癥患者多有白細胞總數及淋巴細胞減少，并有血小板降低；2.血清學診斷可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免 疫法等；3.逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR) ；3.病毒分離從患者呼吸道標本中(咽拭 子、口腔含漱液、鼻咽或氣管吸出物、痰或肺組織等)分離并培養(yǎng)該病毒。但是確診依賴于 從呼吸道標本或血清中分離到特定病毒；RT-PCR對上述標本檢測，有病毒RNA存在，并要經 過測序證實。以上主要分為兩類方法免疫學檢測方法和核酸檢測方法。免疫學方法主要 是檢測血清中是否存在新型甲型流感病毒Hmi亞型病毒的特異性抗體，具體是用ELISA的 方法進行檢測，然而這種方法必須是建立在已經發(fā)生病毒感染并產生抗體的基礎上，而且 鑒于流感病的的高度變異性以及與其他病毒血清學的交叉性，其特異性難以保證，容易出 現假陽性和假陰性。從標本中分離豬流感病毒，進行雞胚接種和細胞培養(yǎng)可能會比較敏感， 但是這種方法需要2-3周的時間，操作程序上比較繁瑣，不宜在所有檢測實驗特別是一些 基層實驗室，比如醫(yī)院、疾病預防控制中心、檢驗檢疫中心以及動物疫病控制中心推廣。另 有普通PCR進行新型甲型流感病毒Hmi亞型核酸檢測的方法比如反轉錄-聚合酶鏈式反 應(RT-PCR)，雖然具靈敏度比上述方法略有提高，但是這種方法僅是基于用一對核酸引物 進行擴增，結果容易產生非特異性擴增，甚至會因為操作的原因出現假陽性，而且普通PCR 擴增法其結果的判斷需要對產物進行凝膠電泳分析，操作繁瑣。熒光定量PCR技術其原理是在常規(guī)PCR擴增系統(tǒng)中加入一段與靶基因特異互補的 熒光標記探針。探針的5'端標記有報告基團，如FAM、VIC等，3'端標記有熒光淬滅基團， 如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不 到熒光信號。隨著PCR擴增的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針就會將探 針切斷產生熒光信號。用熒光檢測儀檢測熒光值的變化，即可準確判定擴增產物的量。熒 光定量PCR方法就是根據此原理。在PCR過程中，連續(xù)不斷地檢測反應體系中熒光信號的 變化。當信號增強到某一閾值，此時的循環(huán)次數(用循環(huán)閾值Ct表示)就被記錄下來。CT 值和PCR體系中起始模板的對數之間有著嚴格的線性關系，利用各梯度陽性定量標準品擴 增的Ct和定量模板數經對數擬合作圖制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值就可以準確 定出起始模板核酸的數量。雙色或多色熒光定量PCR技術是指在同一個熒光定量PCR擴增試驗中同時擴增兩 個或者多個目的基因，而每個目的基因采用的不用波長的熒光探針進行檢測。熒光標記的 探針有多種，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種熒光標記的探針在PCR擴增過程中所產 生的熒光信號不同。利用該原理發(fā)明的試劑盒在同一個標本的檢測中，不但可以檢測新型 甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-Hmi)，還可以檢測流感病毒各亞型(iav-u)，實現了一個標 本中同時檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型和甲型流感病毒各亞型的功能，達到實時精確 檢測并對病毒進行分型的目的，應用極為方便。由于該方法引入了特異性擴增引物和熒光 探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性 不高容易漏診和誤診的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型和甲型流感病毒各亞型mRNA的方 法，特別是提供了一種使用雙色熒光定量PCR技術(PCR-雙色熒光探針法)快速準確的檢 測出樣品(包括咽拭子標本、血清、分泌物及病死動物肺臟等標本)中新型甲型流感病毒HlNl亞型或者甲型流感病毒各亞型mRNA的方法。本發(fā)明進一步提供了用于該類病毒疑似 病人臨床快速準確檢測的試劑盒。目前針對該種新型甲型流感病毒Hmi亞型所致疾病實驗室檢查主要包括血清學 診斷中的間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等，核酸檢測方法如逆轉錄-聚合酶鏈式 反應(RT-PCR)，.病毒分離和接種法等。但是這幾種方法有分別有靈敏度和特異性差，容易 出現假陽性和假陰性的不足，甚至有些檢測方法過程繁瑣耗時較長，難以達到快速準確檢 測的目的。為了克服現有檢測技術中的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種使用雙色熒光定量 PCR技術(PCR-雙色熒光探針法)快速準確的檢測出樣品(包括咽拭子標本、血清、分泌物 及病死動物肺臟等標本)中新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型的mRNA 的方法。該方法包括(1)采集和運送感染或疑似病人樣本(包括咽拭子標本、血清、分泌 物及病死動物肺臟等)；(2)樣本預處理和提取RNA ； (3) 一步PCR-雙色熒光探針體外擴增 法對樣本進行檢測合成特定引物和熒光探針，用雙色熒光定量PCR反應技術并用新型甲 型流感病毒Hmi亞型PCR反應液(PCR MIX)對樣本進行擴增檢測；(4)擴增反應結束后根 據每個擴增反應的熒光強度對相應樣本進行分析，從而判斷所采集的樣本中新型甲型流感 病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型的存在并根據陽性質控品對其標本中的病毒進行 定量檢測。檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型的特定寡核苷酸弓I物和熒光探針位于該型病毒 各亞型的變異區(qū)，與其他亞型基因序列沒有同源性，對Genbank上所有發(fā)表的甲型流感病 毒Hmi亞型(包括新型甲型流感病毒Hmi亞型)病毒基因序列，經過生物新信息學分析， 甲型流感病毒的八個基因片段中血凝素(HA)的變異性最大，新型甲型流感病毒Hmi亞型 的HA基因某些區(qū)域與其它甲型流感病毒明顯不同，其中很多基因序列發(fā)生變異和重組。經 過比對，選擇如下區(qū)域作為擴增新型甲型流感病毒Hmi亞型特異性目標區(qū)域GGTACGGTTA TCACCATCA AAATGAGCAGG GGTCA GGATAGCAGCCGACC TGAAGAGCAC ACAGAATGCC ATTGACGAG A TTACTAAC(SEQ ID NO. 1)引物和探針序列如下(1)新型甲型流感病毒Hmi亞型上游引物5，-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3，(SEQ ID NO. 2)(2)新型甲型流感病毒Hmi亞型下游引物5，-GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3，(SEQ ID NO. 3)(3)新型甲型流感病毒Hmi亞型熒光探針5’-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 4)經過生物信息學分析，甲型流感病毒的八個基因片段中基質(M)基因的變異性 最小。經過比對，選擇如下區(qū)域作為擴增甲型流感病毒各亞型也即甲型流感病毒通用型 (IAV-U)特異性目標區(qū)域TGTGCCACTT GTGAACAGAT TGCTGATTCA CAGCATCGGTCTCACAGACA GATGGCTACT ACCACCAATC CACTAATCAG GC(SEQID NO. 5)(4)甲型流感病毒通用型上游引物5，-TGTGCCACTTGTGAACAGATTG-3，(SEQ ID N0. 6)
(5)甲型流感病毒通用型下游引物5，-GCCTGATTAGTGGATTGGTG-3，(SEQ ID NO. 7)(6)甲型流感病毒通用型熒光探針5’-VIC-TGATTCACAGCATCGGTCTCACAGAC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 8)根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說檢測病毒即為世界衛(wèi)生組織2009年4 月公布的一種引起許多國家和地區(qū)流感疫情的新型甲型流感病毒Hmi亞型。該毒株包含 有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片斷，是一種變異了的新型甲型流感病毒。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的樣本來自被檢者咽拭子標本、血清、 分泌物及病死動物肺臟等。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的樣本處理過程使用的是一種病毒濃 縮液試劑并經過高速離心從而可以獲得濃縮后的病毒顆粒。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的提取RNA使用的是一種Trizol reagents RNA提取液對樣本充分處理。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的檢測新型甲型流感病毒Hmi亞 型的特異性基因為血凝素(HA)基因，檢測甲型流感病毒各亞型(甲型流感病毒通用型 (IAV-U))的特異性基因為基質蛋白(M)基因。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的雙色熒光標記是指檢測新型甲型流 感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)血凝素(HA)基因的探針的熒光標記為FAM，檢測檢測甲型 流感病毒各亞型(甲型流感病毒通用型(IAV-U))基質蛋白(M)基因的探針的熒光標記為 VIC，淬滅基團為TAMRA。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的新型的甲型流感病毒Hmi亞型雙 色熒光定量PCR反應體系(PCR MIX)是由新型甲型流感病毒Hmi亞型(A-HlNl)特異性 上游和下游引物、一條特異性熒光探針(Fam熒光標記)、甲型流感病毒通用型(IAV-U)的 特異性上游和下游引物、一條特異性熒光探針(VIC熒光標記)、熒光定量PCR反應緩沖液 (FQ-Buffer,內含鎂離子、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體(dNTPs)、PCR擴增增強劑和去離 子水等成分構成的反應體系。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的的擴增過程是在一種多通道并實時 檢測熒光信號的的熒光定量擴增裝置上進行的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于快速檢測新型的甲型流感病毒Hmi亞型 (IAV-HlNI)的試劑盒，該試劑盒包括(1)病毒核酸提取試劑；(2)逆轉錄酶系和Taq酶系； (3)新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光PCR反應體系(PCRMIX) ； (4)新型甲型流感病毒 HlNl亞型陽性和陰性質控品。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的新型甲型流感病毒Hmi亞型陽性 質控品是指89bp的擴增片段經過克隆連接到T載體上構成的重組質粒，經過嚴格定量，其 濃度為107COpieS/ml。陽性質控、新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)、甲型流感病毒 普通定性PCR的擴增結果見圖1。對陽性質控品進行梯度稀釋，其擴增的標準曲線和動力學 曲線如圖2和3。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說試劑盒由于采用的是雙色熒光探針 PCR技術，不但可以檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型，還可以對甲型流感病毒各亞型進行檢測，即所謂的甲型流感病毒通用型(IAV-U)的檢測。也就是說本試劑盒的每份試劑一次 檢測就同時具有檢測兩種病毒的能力。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的快速實時定量檢測是通過一步 PCR-雙色熒光探針體外擴增法同時對新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNI)和甲型流感 病毒通用型(IAV-U)RNA進行擴增并進行定量檢測，無需專門的逆轉錄反應過程，簡化了檢 測流程節(jié)省了檢測時間。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的熒光定量擴增裝置可以是ABIPRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應蓋)、ABI RISM7300/7500 (使用 8 聯(lián)管)、MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，也可以是LightCycler等使用毛 細管的儀器，根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的結果判斷要滿足陽性質控品擴增結 果的Ct值均應小于30，且呈標準S型擴增曲線。否則，此次試驗視為無效，全部試驗應重新 進行。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的結果分析時需要使用手動調整閾值 使陰性質控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間， 為灰區(qū)，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽 性，沒有熒光值增長為陰性。為了完成本發(fā)明的方法，首先采集標本放在離心管中，密閉送檢。然后取500μ1 樣品液加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清， 保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫 放置5min。對于血清或血漿等，取500 μ 1血清加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷 凍離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。對于肺臟等組織等，取50mg左右組織用 玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振蕩，轉 移到1. 5mL的EP管中，室溫放置5min。然后加入IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min， 4°C 13，OOOrpm離心lOmin。小心將上層水相轉移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混 勻，13，OOOrpm離心IOmin0棄上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm 離心lOmin，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈， 用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。根據根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，取出新型甲型流感病毒Hmi亞型-PCR 反應液(PCRMIX，內含有擴增用的引物探針和離子等)、Taq酶系、逆轉錄酶系，室溫融化并 振蕩混勻后，10，OOOrpm離心10s。每個測試反應體系配制如下表 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈0.2ml離心管中，充分混勻， 10，OOOrpm離心10s，向設定每個PCR反應管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣品 (提取的RNA)、陽性質控品和陰性質控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陽性質控品、陰性質控品以及未知標本，并設 置樣品名稱和標記熒光基團種類(報告基團設置為FAM和VIC、淬滅基團TAMRA)。
根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，用于擴增的條件為ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp7000 (需要剪掉反應蓋)、ABI PRISM 7300/7500 (使用 8 聯(lián)管)、 MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件42°C—20分鐘，然后93°C—2 分鐘，然后93°C 30秒一550C 45秒，檢測熒光信號，40個循環(huán)。LightCycler等使用毛細管 的儀器循環(huán)條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，然后93°C 5秒一58°C 45秒，檢測熒光 信號，共40個循環(huán)。反應結束后，使用手動調整閾值使陰性質控品Ct值在40以上，Ct值 小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。重復試 驗之后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。判斷結 果時要注意以下問題陰性質控品應為全部陰性；新型甲型流感病毒Hmi亞型-陽性質控 品，陽性質控品的Ct值均應小于30，且呈標準S型擴增曲線。以上條件應同時滿足，否則此 次試驗視為無效全部試驗應重新進行。 本發(fā)明的試劑盒主要用于檢測一種新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病 毒各亞型，前者是一種新的變異株病毒，它整合了豬流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒的 基因片段，是一種新的重組的病毒，它導致了 2009年四月世界范圍內流感疫情的爆發(fā)。本 發(fā)明的試劑盒整個檢測過程包括提取樣品中甲型流感病毒Hmi亞型mRNA、一步法雙色熒 光定量PCR檢測病毒mRNA，以及結果的分析等步驟。為了完成這些步驟，本發(fā)明的試劑盒 又可分為病毒核酸提取試劑和雙色熒光定量PCR反應試劑兩個部分。其中，前者主要包括 病毒濃縮液和RNA提取液等，后者主要包括PCR 10乂(14 11各引物和探針、20(^11(1^1\501111 Tris-HCl (ρΗ8· 3)、3· 5mM MgC12、50mM KCl、25mM(NH4) 2S04 等)、逆轉錄酶、耐熱 Taq 酶、陽 性質控品、陰性質控品和DEPC處理過的水等。本發(fā)明的試劑盒經過多次不同的重復實驗驗證證實，本試劑盒具有較好的重復 性、特異性和穩(wěn)定性的性能和優(yōu)點。本發(fā)明的方法中，由于使用了針對新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病 毒各亞型核酸序列所設計的引物和雙色熒光探針擴增特異性基因片段，不但可以檢測新型 甲型流感病毒Hmi亞型，同時還可以檢測流甲型感病毒各亞型，從而實現了一個標本中同 時對新型甲型流感病毒Hmi亞型和甲型流感病毒各亞型同時實時精確檢測的目的，應用 極為方便。由于該方法引入了特異性擴增引物和雙色熒光探針，使得檢測具有更好的靈敏 度和特異性，從而避免了其他檢測方法特異性不高的問題。同時本發(fā)明引入了陽性標準品 作為實驗的對照和定量標準，對新型甲型流感病毒Hmi亞型及甲型流感病毒各亞型的RNA 進行快速檢測并定量。另外一個方面，本發(fā)明使用了一步法熒光定量PCR擴增技術，簡化了 試驗過程提高了檢測效率。一般來說，從處理樣本到結果的判斷僅需要2小時左右。所以 與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明具還具有有操作簡單、快速方便的優(yōu)點。因此，本發(fā)明的試劑盒為 臨床標本的快速檢測和大樣本普查提供了新的方法，并為疑似病人的篩查使用提供了可靠 的方法學依據。
四

圖1顯示常規(guī)PCR擴增特異性片段，2%的瓊脂糖凝膠電泳，經PCR擴增后，其擴增產物經2 %的瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下觀察，可看到與目的片段大小一致的電泳條帶，從 左到右依次是分子量Marker、陽性對照、IAV-Hmi特異性擴增片段、IAV-U特異性擴增片 段、陰性對照。圖2顯示陽性定量標準模板PCR擴增電泳圖，右側泳道為DNA分子量Marker ； 從0到6依次對應=IOciUO1UO2UO3UO4UO5UO6稀釋的陽性質控品擴增產物；圖3顯示陽 性質控品標準模板擴增動力曲線，梯度稀釋；圖4為陽性質控品標準曲線。
五具體實施例方式實施例1 標本采集適用樣品類型包括咽拭子標本、血清、分泌物及病死動物肺臟等。首先，對于咽拭 子標本，需要采集病人發(fā)病3日內的咽拭子標本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和 兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有1 2ml保存液(維持液或生理鹽 水)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密閉送檢；對于血清，無菌條件下 取疑似病人外周靜脈血3ml，轉至5ml干燥管中，室溫靜置30min，3000g離心5min，取Iml 血清轉至1. 5ml潔凈的離心管中，密閉送檢。對于標本的保存，標本短期內可保存于-20°C， 長期保存可置-70°C，但不能超過6個月，標本運送應采用0°C冰壺，采集標本應立即(12h 內)送達檢測。實施例2 甲型流感病毒mRNA的提取對于咽拭子等樣品，取500 μ 1樣品液加入500μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍 離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500 μ ITrizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。對于血清或血漿等，取500 μ 1血清加 入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1 左右的樣品液體，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。 對于肺臟等組織等，取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振蕩，轉移到1. 5mL的EP管中，室溫放置5min。然后加入 IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4°C 13，OOOrpm離心lOmin。小心將上層水相轉移 到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin。棄上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口 在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。實施例3 用本試劑盒檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl)和甲型流感 病毒各亞型(IAV-U)取出甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光PCR MIX、Taq酶系，逆轉錄酶系，室溫融化 并振蕩混勻后，10，OOOrpm離心10s。每個測試反應體系配制如下，PCRMIX 20μ l，Taq酶系 和逆轉錄酶各lul，計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈0. 2ml離心管中，充分混 勻，10, OOOrpm離心10s，向設定的PCR反應管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣品 (提取RNA)或IAV-陽性質控品和陰性質控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性質控品，陽性質 控品以及未知標本，并設置樣品名稱、標記熒光基團種類(報告基團FAM和VIC猝滅基 團 TAMRA)和循環(huán)條件ABI PRISM 7700, ABI PRISM5700, ABIGeneAmp 7000 (需要剪掉反 應蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJOpticon (使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器循環(huán)條件42°C— 20分鐘，后93°C— 2分鐘，后93°C 30秒一55°C 45秒，40個循環(huán)。 LightCycler等使用毛細管的儀器，循環(huán)條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，后93°C 5秒 —580C 45秒，共40個循環(huán)。實施例4 結果分析和判定反應結束后，使用手動調整閾值使陰性質控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循 環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果 Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。需要滿足陰性質控 品應為全部陰性；陽性質控品的Ct值均應小于30，且呈標準S型擴增曲線。以上條件應同 時滿足，否則此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。實施例5 本發(fā)明方法的臨床應用使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對600份采自廣東省珠海出入境檢驗檢疫局實驗室 的標本進行一步法雙色熒光定量PCR檢測，并于其他同類產品進行比對實驗，最終經測序 實驗驗證。結果顯示本發(fā)明方法的試劑盒，靈敏度為102copies，準確性和特異性達100%， 重復性和穩(wěn)定性較好，本試劑盒的保存條件和有效期為-20°C，12個月。本方法的發(fā)明可 為新型甲型流感病毒Hmi亞型以及甲型流感病毒各亞型mRNA的檢測和疫情的預防控制方 案的制定提供科學的、個體化的分子生物學實驗數據，為病人的診斷提供可靠的分子病毒 學證據。如果病人咽拭子或者血清中出現甲型流感病毒Hmi亞型mRNA病毒存在，則要立 即采取相應措施，也避免產生不必要的后果。本發(fā)明的試劑盒結果的判斷有如下幾種情況， 見表1 表1.新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光定量PCR檢測試劑盒結果判斷 六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奧生物技術有限公司<120> 一種新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒<130><160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>88<212>DNA0078]<213>IAV-H1N1 HA 基因0079]<400>10080]ggtacggtta tcaccatcaa aatgagcagg0081]acagaatgcc attgacgaga ttactaac0082]<210>20083]<211>220084]<212>DNA0085]<213>人工序列(引物)0086]<400>20087]ggtacggtta tcaccatcaa aa0088]<210>30089]<211>240090]<212>DNA0091]<213>人工序列(引物)0092]<400>30093]gttagtaatc tcgtcaatgg catt0094]<210>40095]<211>270096]<212>DNA0097]<213>人工序列(探針)0098]<400>40099]atatgcagcc gacctgaaga gcacaca0100]<210>50101]<211>820102]<212>DNA0103]<213>IAV-U M 基因0104]<400>50105]tgtgccactt gtgaacagat tgctgattca0106]accaccaatc cactaatcag gc0107]<210>60108]<211>220109]<212>DNA0110]<213>人工序列(引物)0111]<400>60112]tgtgccactt gtgaacagat tg0113]<210>70114]<211>200115]<212>DNA0116]<213>人工序列(引物)
ggtcaggata gcagccgacc tgaagagcac 60
88
22
24
27
cagcatcggt ctcacagaca gatggctact 60
82
<400>7gcctgattag tggattggtg20<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列(探針)<400>8tgattcacag catcggtctc acagac 2權利要求
本發(fā)明為一種新型甲型流感病毒H1N1(甲型H1N1病毒)亞型雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒，從樣品中提取新型甲型流感病毒H1N1亞型(IAV-H1N1)RNA，通過一步PCR-雙色熒光探針體外擴增法對新型甲型流感病毒H1N1亞型和甲型病毒各亞型RNA進行擴增，達到快速實時定量檢測之目的。
2.根據權利要求ι所述的一種新型甲型流感病毒Hmi(甲型Hmi病毒)亞型雙色熒 光PCR檢測方法及其試劑盒，特征在于用于檢測新型甲型流感病毒Hmi亞型(IAV-HlNl) 的是該型病毒變異性較強的血凝素(Hemagglutinin)基因，特異性引物和熒光探針序列如 下⑴新型甲型流感病毒Hmi亞型上游引物5，-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3，；⑵新型 甲型流感病毒Hmi亞型下游引物5’ -GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3’ ； (3)新型甲型流感 病毒 Hmi 亞型熒光探針5，-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3，。用于檢測甲型流感病毒各亞型(IAV-U)的是該型病毒較保守的的基質蛋白 (Matrix Protein)基因，特異性引物和探針序列如下(4)甲型流感病毒通用型 上游引物5，-TGTGCCACTTGTGAACAGATTG-3，； (5)甲型流感病毒通用型下游引物 5，-GCCTGATTAGTGGATTGGTG-3' ； (6)甲型流感病毒通用型熒光探針5，-VIC-TGATTCACAGCA TCGGTCTCACAGAC-TAMRA-3‘。
3.根據權利要求1所述一種新型甲型流感病毒Hmi亞型雙色熒光定量PCR檢測試劑 盒，其特征在于，按照如下方式配制反應體系PCR反應液(PCR MIX) 20 μ 1，Taq酶系和逆轉 錄酶各1 μ 1共22 μ 1加入一適當體積潔凈0. 2ml離心管中，充分混勻，10，OOOrpm離心IOs, 向每管中加入處理后樣品(即提取的RNA)、陽性質控品和陰性質控品進行擴增檢測。
4.根據權利要求3所述PCR反應液(PCRMIX)主要為以下成分1 μ M各引物和探針、 200uMdNTP、50mM Tris-HCl (ρΗ8· 3)、5mM MgCl2、50mMKCl、25mM(NH4)2SO4組成，一步法擴增程 序為ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon 等，42°C— 20分鐘，然后93°C— 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒(檢測熒光)，40個 循環(huán)；LightCycler等擴增程序為42°C — 20分鐘，然后93°C — 2分鐘，然后93 °C 5秒 —580C 45秒(檢測熒光)，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用雙色熒光定量PCR技術(PCR-雙色熒光探針法)快速準確的檢測出樣品中新型甲型流感病毒H1N1亞型(IAV-H1N1)以及甲犁流感病毒各亞型(IAV-U)的mRNA的方法。該方法包括(1)采集和運送感染或疑似病人樣本；(2)樣本預處理和提取RNA；(3)一步PCR-熒光探針體外擴增法對樣本進行檢測(4)擴增反應結束后根據每個擴增反應的熒光強度對相應樣本進行分析，從而判斷所采集的樣本中新型甲型流感病毒H1N1亞型和(或)甲型流感病毒各亞型的存在，并能夠對對其進行準確定量(圖3)，實現了對該新型甲型流感病毒H1N1亞型和甲型流感病毒各亞型實時快速精確檢測之目的。
文檔編號C12R1/93GK101886139SQ20091013663
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月11日 優(yōu)先權日2009年5月11日
發(fā)明者史成軍, 徐貴峰, 羅寶正 申請人:北京索奧生物技術有限公司;珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心