專利名稱：朝鮮淫羊藿的分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材來源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，采用特異性引物進行PCR擴增鑒定的 分子方法。
二.
背景技術(shù)：
中藥淫羊藿為來源于小檗科淫羊藿屬多個種植物的干燥地上部分，在我國有悠 久的使用歷史。其功效除了傳統(tǒng)的補腎壯陽祛風(fēng)濕之外，臨床上還被用于治療骨質(zhì)疏松、 更年期綜合癥、高血壓、冠心病等疾病，另外淫羊藿還具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、抗 艾滋病等作用，因此受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。藥典規(guī)定藥材淫羊藿的來源物種包括淫羊 藿 Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum(Sieb. et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubscens Maxim.、卓月鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 和巫山淫羊藿Epimediumwushanense T. S. Ying等5個種；《貴州省中藥材、民族藥材標(biāo) 準(zhǔn)》中還收載了粗毛淫羊藿Epimedium acuminamm Franch.、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Stearn、it嶺淫羊藿Epimedium leptorrhizum Steam禾口租毛淫羊藿Epimedium coactum H. R. Liang.，其來源之多在中藥中是很罕見的。不同植物來源的淫羊藿藥材其有 效成分的含量存在很大的差異，再加上藥材和飲片難以進行形態(tài)鑒別，這就對藥材質(zhì)量控 制造成了很大的障礙，這就需要尋找到一種穩(wěn)定可靠的方法將不同來源的淫羊藿藥材和飲 片加以鑒定區(qū)分。通過比較不同藥用淫羊藿品種的一段DNA堿基序列，找到了朝鮮淫羊藿 和其他藥用淫羊藿品種存在差異的一段序列，這種差異可以通過進行鑒定性PCR來區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在藥用淫羊藿品種中準(zhǔn)確鑒定朝鮮淫羊藿的鑒定性PCR 分子鑒定方法，該方法包括朝鮮淫羊藿的特征性DNA堿基序列、兩對鑒定性PCR引物及其鑒 定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先從各藥材中提取基因組DNA，然后利用該方法進行鑒定。本發(fā)明設(shè)計的朝鮮淫羊藿聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鑒定引物DNA序列為引物 1 :kor. -aF :5，-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3，引物 2 kor· -bR 5，-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3，引物 3 kor· -bF 5，-CGAACTTGTGAAAAACAC-3，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進行合成，即得到鑒定引物的白 色粉末結(jié)晶。中藥材朝鮮淫羊藿聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定的方法為1、藥材DNA的提取按照常規(guī)植物DNA的提取方法或者用市售植物基因組提取試 劑盒進行，用無菌去離子水溶解供試品DNA模版，并將模版濃度調(diào)整到能夠進行常規(guī)PCR反 應(yīng)的濃度；
2、模版DNA質(zhì)量的鑒定用另一對引物鑒別模版DNA的質(zhì)量，該對引物能夠擴增淫 羊藿屬植物的線粒體基因組nadl第2內(nèi)含子序列。引物的DNA序列為nadl-2intron-up 5’ -GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3，，nadl-2intron-low :5’ -TTC GTC TAT ACCAGA CCA TAA GG-3，。反應(yīng)體系為引物各OluM，IOul 的 2XPCR StarMix，模版DNA約 20ng，用無 菌去離子水補充反應(yīng)體積到20ul。PCR擴增程序為95°C預(yù)變性3min ；94°C變性30s，54°C 退火30s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。取5ul的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖 凝膠(包括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結(jié)果。如果得到ISOObp左右的條帶，則表明 DNA模版合格，可以進行后續(xù)的鑒定試驗，如果沒有陽性條帶，則需要改進DNA提取方法，以 得到合格的模版DNA。對于模版DNA質(zhì)量的鑒定，也可以選擇其他能夠在淫羊藿屬植物中成 功擴增的引物對進行；3、鑒定性PCR反應(yīng)引物用無菌去離子溶解并稀釋至2umol/uL。以25uL反應(yīng)體 系為參照，各物品的用量為IOXPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5uldNTPs (2. 5mM)1. 6ulprimer 1(2um)2ulprimer 2 (2um)2ulEasy Taq(5U/ul) 0. 3ulDNA 模版20ngddH20補充體積到25uL4、PCR反應(yīng)程序；在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應(yīng)
94 0C30s 一 η
50 °C30s個循環(huán)
72 V1min J
72 °C5min5、電泳檢測取5uLPCR反應(yīng)液與IuL加樣緩沖液混合，1 %瓊脂糖凝膠電泳(含 0. 5%溴化乙錠)檢測PCR擴增產(chǎn)物；反應(yīng)體系可以因為酶的活性、模版DNA的質(zhì)量等原因進行調(diào)整；檢測結(jié)果有陽性條帶，則檢測對象為朝鮮淫羊藿；如果是陰性結(jié)果，則檢測對象不 是朝鮮淫羊藿，檢測結(jié)果參看說明書附圖1和附圖2。四、說明書


圖1 為引物組合Kor. -aF&Kor. _bR的PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。1、 2為朝鮮淫羊藿樣品，3、4為粗毛淫羊藿樣品，5、6為黔嶺淫羊藿樣品，7、8為箭葉淫羊藿樣 品，9、10為柔毛淫羊藿樣品，11、12為巫山淫羊藿樣品，13、14為淫羊藿樣品，15、16為天平山淫羊藿樣品，M為DL2000 DNA marker ；圖2 為引物組合Kor. -bF&Kor. _bR的PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。M 為DL2000DNAmarker，1、2為朝鮮淫羊藿樣品，3、4為粗毛淫羊藿樣品，5、6為黔嶺淫羊藿樣 品，7、8為箭葉淫羊藿樣品，9、10為柔毛淫羊藿樣品，11、12為巫山淫羊藿樣品，13、14為淫 羊藿應(yīng)聘，15、16為天平山淫羊藿樣品；圖3 用兩對引物分別對8份來自于藥材市場的朝鮮淫羊藿藥材進行PCR鑒定的 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。前8個為引物組合Kor. -bF&Kor. _bR的PCR擴增結(jié)果，其中7個 有陽性條帶，一個為陰性結(jié)果；后8個條帶為引物組合Kor. -aF&Kor. _bR的PCR擴增結(jié)果， 其中7個有陽性條帶，一個為陰性結(jié)果；該結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致，其中編號為1、2、3、4、 5、7、8的樣品為未經(jīng)炮制的生飲片，而編號為6的樣品為經(jīng)過羊油炙的飲片。五、實施例
1、從藥材市場上收集了來自于不同藥材公司的8份樣品，分別取30mg葉片材料， 在液氮中研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。2、用弓I 物 nadl-2intron-up :5，-GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3，， nadl-2intron-low :5，-TTC GTC TAT ACC AGA CCA TAA GG-3，檢測提取的樣品總 DNA 的質(zhì) 量。反應(yīng)體系為引物各0. IuM, IOul的2 XPCR StarMix，模版DNA約20ng，用無菌去離子 水補充反應(yīng)體積到20ul。PCR擴增程序為95°C預(yù)變性3min ；94°C變性30s，54°C退火30s， 72°C延伸2min，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。取5ul的PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠(包 括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結(jié)果。結(jié)果顯示5uL約20ng的總DNA能夠得到很好的 陽性結(jié)果，證實提取的總DNA質(zhì)量達到檢測要求；3、分別用鑒定引物Kor. -bF&Kor. -bR和Kor. -aF&Kor. -bR對8個樣本的總DNA進 行PCR擴增，反應(yīng)體系和PCR擴增程序如下IOXPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5uldNTPs (2. 5mM)1. 6ulprimer 1 (2um)2ulprimer 2 (2um)2ulEasy Taq(5U/ul) 0. 3ulDNA 模版5ulddH20補充體積到25uL 4、分別取5ul的PCR擴增產(chǎn)物上樣，用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后在凝膠 成像儀上檢測結(jié)果。結(jié)果參看說明書附圖3，顯示市售的8個朝鮮淫羊藿藥材中有7個得到 陽性條帶，1個為陰性結(jié)果，表明其中7個為朝鮮淫羊藿，而1個被誤售為朝鮮淫羊藿，經(jīng)專 家鑒定是原植物為 淫羊藿(Epimedium brevicornu)的藥材。
權(quán)利要求
一種來源為朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum的中藥淫羊藿藥材聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定引物，其特征在于可分別用兩對鑒定引物kor.-aF&kor.-bR以及kor-bF&kor.-bR對朝鮮淫羊藿進行分子鑒定。鑒定引物DNA序列為kor.-aF5’-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3’，kor.-bR5’-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3’以及kor.-bF5’-CGAACTTGTGAAAAACAC-3’，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進行合成，即得到鑒定引物的白色粉末結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定引物鑒定朝鮮淫羊藿原植物以及來源于朝鮮淫羊藿的中 藥淫羊藿藥材和飲片的方法，其特征在于朝鮮淫羊藿聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定的步驟 為(1)藥材DNA的提取按照常規(guī)植物DNA的提取方法或者用市售植物基因組提取試劑 盒進行，用無菌去離子水溶解共試品DNA模版，并將模版濃度調(diào)整到能夠進行常規(guī)PCR反應(yīng) 的濃度；(2)模版DNA質(zhì)量的鑒定用另一對引物鑒別模版DNA的質(zhì)量，該對引物能夠擴增淫 羊藿屬植物的線粒體基因組nadl第2內(nèi)含子序列。弓丨物的DNA序列為nadl-2intron-up 5，-GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3，，nadl-2intron_low :5’ -TTC GTC TAT ACC AGA CCA TAA GG-3’。反應(yīng)體系為引物各 0. luM，IOul 的 2XPCR StarMix，模版 DNA 約 20ng， 用無菌去離子水補充反應(yīng)體積到20ul。PCR擴增程序為95°C預(yù)變性3min ；94°C變性30s， 54°C退火30s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。取5ul的PCR產(chǎn)物在瓊 脂糖凝膠(包括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結(jié)果。如果得到ISOObp左右的條帶，則 表明DNA模版合格，可以進行后續(xù)的鑒定試驗，如果沒有陽性條帶，則需要改進DNA提取方 法，以得到合格的模版DNA，對于模版DNA質(zhì)量的鑒定，也可以選擇其他能夠在淫羊藿屬植 物中成功擴增的引物對進行；(3)鑒定性PCR反應(yīng)引物用無菌去離子溶解并稀釋至2um0l/uL。以25uL反應(yīng)體系為 參照，各物品的用量為10XPCR反應(yīng)緩沖液 2. 5uldNTPs (2. 5mM) 1. 6ulprimer 1(2um) 2ulprimer 2(2um) 2ulEasy Taq(5U/ul) 0. 3ulDNA 模版20ngddH20補充體積到25uL(4)PCR反應(yīng)程序在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應(yīng) (5)電泳檢測取5uLPCR反應(yīng)液與IuL加樣緩沖液混合，瓊脂糖凝膠電泳(含0. 5% 溴化乙錠)檢測PCR擴增產(chǎn)物；反應(yīng)體系可以因為酶的活性、模版DNA的質(zhì)量等原因進行調(diào)整； 檢測結(jié)果有陽性條帶，則檢測對象為朝鮮淫羊藿；如果是陰性結(jié)果，則檢測對象不是朝鮮淫羊藿。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，是用于鑒定朝鮮淫羊藿的分子鑒定方法。發(fā)明方法設(shè)計的朝鮮淫羊藿聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鑒定引物DNA序列為kor-aF5’-CGAACTTGTGAAAAACAC-3’，kor.-bR5’-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3’以及kor.-bF5’-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3’。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)朝鮮淫羊藿原植物、藥材、生飲片和羊油炙飲片的快速、準(zhǔn)確鑒定。
文檔編號C12N15/11GK101886116SQ20091013666
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者王川易, 肖培根, 郭寶林 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所