專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從外周血中快速提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的組合物和試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及從一種從外周血中快速提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的組合物 及試劑盒，以及該組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、或手動(dòng)臨床檢驗(yàn)操作或用于借助 于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
提取并檢測(cè)外周血中的循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤上皮細(xì) 胞)的巨大臨床意義早已被人們所證實(shí)。目前常用的提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的方法 是利用抗體與這些細(xì)胞表面的特殊標(biāo)識(shí)物相結(jié)合從而達(dá)到直接捕獲的目的。然而這種直接 捕獲的技術(shù)手段敏感性低，重復(fù)性差，且因表面標(biāo)識(shí)物對(duì)于不同種類(lèi)的細(xì)胞表達(dá)量差異極 大，從而不能作為一種提取血液樣品中的非血緣性有核細(xì)胞的通用手段。近來(lái)大量的科研與臨床實(shí)驗(yàn)已證明通過(guò)去除血中的血緣性有核細(xì)胞(如白細(xì) 胞等)從而達(dá)到富集提取血中的非血緣性有核細(xì)胞是最為有效的手段。雖然此手段 過(guò)程中涉及的某些單一方法已經(jīng)有所報(bào)道，如免疫磁性顆粒法去除白細(xì)胞，血型糖蛋 白-Afelycophorin Α)交聯(lián)法去除紅細(xì)胞，以及必須借助特殊細(xì)胞分離器械的免疫磁性顆 粒與密度離心結(jié)合的初步嘗試等，但這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，白細(xì)胞去除率低，靶細(xì)胞回收率差， 且須使用特殊器材從而帶來(lái)應(yīng)用的不便。由于上述原因，本發(fā)明將基于利用特殊的密度分離劑的組合物或試劑盒的離心方 法與去除白細(xì)胞試劑及低滲融破紅細(xì)胞的手段相結(jié)合，令人意料不到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用 此組合物或試劑盒結(jié)合上述方法能夠快速、高效、特異性地去除血液樣品中的絕大部分血 緣性有核細(xì)胞、紅細(xì)胞及血漿蛋白質(zhì)，從而能夠快速富集并提取外周血中循環(huán)的非血緣性 有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將基于特殊的密度分離劑的離心方法與去除血緣性有核細(xì)胞試劑及低滲 融破紅細(xì)胞的手段相結(jié)合，一方面提供了一種獨(dú)特高效地從外周血中分離循環(huán)的非血緣性 有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的組合物。另一方面，本發(fā)明還提供了一種獨(dú)特高效地從外周血中分離循環(huán)的非血緣性有核 細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的試劑盒。又一方面，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、或手動(dòng)臨 床檢驗(yàn)操作或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞 的組合物，包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí) 物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)，其中，所述緩沖液的滲 透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1. 07156 1. 07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩 種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種 含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。優(yōu)選地，所述免疫微球的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免 疫顆粒共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合有特異性地識(shí)別下述的白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體 CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或 CD102。優(yōu)選地，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮來(lái)源的任何實(shí) 體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來(lái)源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞， 以及免疫細(xì)胞。 優(yōu)選地，其中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kgH20、pH為6. 85 7. 75， 所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷 酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇 聚合而成的非離子聚合物，所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液如右旋糖苷、多聚糖和泛 影酸鈉或其衍生物、或蔗糖等，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1. 07260 1. 07650克 /毫升。優(yōu)選地，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞在所采集的所述血液樣本中的比例占 所有有核細(xì)胞的0. 1 %以下，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸 癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤 等；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì) 胞的試劑盒，包括一種組合物，所述組合物包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血 緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)； 其中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介 質(zhì)在20°C下的比重為1. 07156 1. 07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑 中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛 影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物；容納該組合物的容器以及帶有抗凝劑的采血管；以及所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。優(yōu)選地，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免 疫微球或免疫顆粒共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合有特異性地識(shí)別下述的白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或 多種的抗體CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84、或 CD102。優(yōu)選地，其中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kgH20、pH為6. 85 7. 75，所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液如右旋糖苷，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物， 或蔗糖等。優(yōu)選地，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮來(lái)源的任何實(shí) 體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來(lái)源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎 兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞。優(yōu)選地，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞在所采集的所述血液樣本中的比例占所有有核細(xì)胞的0. 以下，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸 癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤 等；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。又一方面，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、或手動(dòng)臨 床檢驗(yàn)操作或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中的應(yīng)用。相對(duì)于目前市場(chǎng)上通用的商品化離心介質(zhì)而言，本發(fā)明的新的組合物或試劑盒的 使用可極大地縮短離心時(shí)間，并將細(xì)胞回收率從原有的60士20%穩(wěn)定地提高到95%以上。 該組合物與去除白細(xì)胞試劑和低滲融破紅細(xì)胞的手段相結(jié)合，可以有效地快速富集提取外 周血中循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞，如腫瘤上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等，對(duì)腫瘤及心臟 病的早期診斷具有極大的現(xiàn)實(shí)臨床意義。而且本發(fā)明提供的上述組合物或試劑盒用于生物 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，或手動(dòng)臨床檢驗(yàn)操作或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中可極 大地簡(jiǎn)化操作并提高效率。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將基于特殊密度的分離劑的離心方法與去除血緣性有核細(xì)胞試劑及低滲 融破紅細(xì)胞的手段相結(jié)合，在一具體實(shí)施例中提供了一種獨(dú)特高效地從外周血中分離循環(huán) 的非血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的組合物。在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了一種獨(dú)特高效地從外周血中分離循環(huán)的非 血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的試劑盒。在又一具體實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實(shí) 驗(yàn)、或手動(dòng)臨床檢驗(yàn)操作或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中的應(yīng)用。一個(gè)具體實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核 稀有細(xì)胞的組合物，包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞 表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)，其中，所述緩沖 液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的 比重為1.07156 1.07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種 或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍 生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比 重，所述免疫微球或免疫顆粒共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合有特異性地識(shí)別下述的白細(xì)胞表面標(biāo)示物 的一種或多種的抗體CD3，CD31, CD34, CD45, CD50, CD69, CD84,或 CD102。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮 來(lái)源的任何實(shí)體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來(lái)源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干 細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為 6. 85 7. 75，所述含糖溶液為選自以下糖的溶液如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸鈉或其衍 生物、或蔗糖等，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1. 07260 1. 07650克/毫升。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞在所采集的所述血液樣 本中的比例占所有有核細(xì)胞的0. 1 %以下，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞， 如黑色素瘤等。在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性 有核稀有細(xì)胞的試劑盒，包括一種組合物，所述組合物包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血 緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球，以及細(xì)胞分離介質(zhì)；其中，所述緩 沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下 的比重為1. 07156 1. 07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一 種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化娃，聚糖，泛影酸鈉或其衍生 物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物；容納所述組合物的容器以及帶有抗凝劑的采血管；以及所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的 比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合有特異性地識(shí)別下述的白細(xì)胞表面標(biāo)示 物的一種或多種的抗體⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，⑶84，或⑶102。在另一優(yōu)選實(shí) 施例中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kgH20、pH為6. 85 7. 75，所述含糖溶液 為選自以下的糖的溶液如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物、或蔗糖等。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮 來(lái)源的任何實(shí)體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤 干細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞在所采集的所述血液樣 本中的比例占所有有核細(xì)胞的0. 1 %以下，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞， 如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞， 如黑色素瘤等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，去除血緣性有核細(xì)胞的試劑是將一種或多種識(shí)別白 細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物的抗體與磁性或非磁性固體顆?；蚬腆w表面共價(jià)偶聯(lián)而成為免疫顆粒。 離心分離介質(zhì)的密度為1. 07156 1. 07738克/毫升，比重可用任何滲透壓介于280 320m0sm/kg H20、pH6. 8 7. 8的緩沖液調(diào)制而成。此分離介質(zhì)可將非血緣性有核細(xì)胞從紅 細(xì)胞及結(jié)合了血緣性有核細(xì)胞的免疫顆粒中進(jìn)行有效的分離。在又一具體實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實(shí) 驗(yàn)，或手動(dòng)臨床檢驗(yàn)操作或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中的應(yīng)用。名詞解釋血緣性有核細(xì)胞指白細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞等)；嗜中性粒細(xì)胞；嗜 酸性粒細(xì)胞；嗜堿性粒細(xì)胞等。循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞主要指在血液中循環(huán)的具有上皮來(lái)源的或不具有上皮 來(lái)源的腫瘤細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，某些免疫細(xì) 胞等稀有細(xì)胞。本發(fā)明主要用于從血液樣品中快速去除血漿蛋白、紅細(xì)胞以及血緣性有核細(xì)胞， 從而達(dá)到富集血液樣品中的非血緣性有核細(xì)胞的目的。
在本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程中，將血液采集于任意一種商品化的含抗凝劑的采血管中。采用本發(fā)明的組合物用于富集血液樣品中非血緣性有核細(xì)胞的主要步驟，包括去除血漿蛋白；加入低滲裂解液融破紅細(xì)胞；應(yīng)用抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體包被的免疫微球或免疫顆粒(將抗體共 價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于固體表面)；加入比重為1.07156 1.07738克/毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)，進(jìn)行基于特殊密度的 細(xì)胞分離介質(zhì)的離心，從而富集血中的非血緣性有核細(xì)胞。在本發(fā)明的組合物中，細(xì)胞分離介質(zhì)的比重為1.07156 1.07738克/毫升(gr/ ml或gr/cm3)。細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯 烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；多聚糖 (polysucrose)與泛影酸鈉(sodium diatrizoate)或其衍生物的混合物；由蔗糖和表氯醇 聚合而成的非離子聚合物；以及可選的任意蛋白溶液。細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透 壓介于280 320m0sm/kg H20、pH6. 8 7. 8的緩沖液調(diào)制而成。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為 6. 85 7. 75。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1. 07260 1. 07650 克/毫升。實(shí)施例1利用本發(fā)明組合物從人的血液樣品中快速獲取非血緣性循環(huán)有核細(xì)胞采集IOml人的外周血于任何一種含抗凝劑(如EDTA、肝素、或A⑶等)的采血管 中(BD, New Jersey，USA)。離心(1000 X g，15分鐘)后，去掉血漿蛋白。加50毫升低滲紅細(xì)胞融破液(BD Pharmingen, California, USA)后，于4°C孵育 30分鐘。將樣品標(biāo)本再次離心(1000Xg，15分鐘)。將沉積的細(xì)胞重懸于30毫升緩沖液中。向其中加入2毫升包被有抗⑶45和/或 CD50的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，室溫孵育30分鐘。將反應(yīng)液 加到20毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)上方(該細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1. 07260 1. 07650 克/毫升，該細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖 和泛影酸鈉；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物)，然后離心 1000 Xg, 15 分鐘。取上清液，將上清液再離心1500 X g，10分鐘。棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的非血緣性有核細(xì)胞。離心后得到的沉積細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液后可做進(jìn)一步分析。該實(shí)施例中本發(fā)明的組合物中的細(xì)胞分離介質(zhì)是這樣制備的將5. 8%的多聚糖 (polysucrose)與9. 的泛影酸鈉(Sigma，Missouri，UDA)的混合物在高精度數(shù)字密度儀 于20°C監(jiān)測(cè)下，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將其密度準(zhǔn)確調(diào)節(jié)至1. 07260 1. 07650克/毫升 之間。利用本發(fā)明的組合物，相對(duì)于目前市場(chǎng)上通用的商品化離心介質(zhì)而言，可極大地縮短利用上述步驟從人的血液樣品中獲取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的離心時(shí)間，并將循環(huán) 的非血緣性有核細(xì)胞回收率從原有的60士20%穩(wěn)定地提高到96%。具體地，在本發(fā)明的組合物中，免疫微球或免疫顆粒由特異性識(shí)別白細(xì)胞標(biāo)示物 的抗體與微球表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而形成，所述微球的表面可經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué) 處理以適于與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，所述微球的直徑介于10納米 100微米，所述免疫微球或免 疫顆粒包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅，右旋糖苷，瓊脂糖，或交聯(lián)葡聚糖。用 于制備所述免疫微球的微球?yàn)榇判曰蚍谴判缘摹Ｔ诒景l(fā)明的組合物中，用于制備免疫微球或免疫顆粒的抗體特異性地識(shí)別下述但 不局限于這些白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或幾種⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，⑶84， 或CD102等。在本發(fā)明的組合物中，所述免疫微球或免疫顆粒是將任何經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處 理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面如二氧化硅顆粒與配體或特異的單克隆或多克隆抗體包括 抗白細(xì)胞表面標(biāo)示物如CD45和/或CD50的抗體進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而制備而成。在本發(fā)明的組合物中，所述獨(dú)特的細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C溫度下比重范圍優(yōu)選介于 1. 07260 1. 07650克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，這一特定范圍內(nèi)的密度適于將幾乎所有 有核細(xì)胞與紅細(xì)胞及免疫微球或免疫顆粒進(jìn)行分離。所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種 或任意兩種或兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖；泛影 酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構(gòu)成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋 糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液。所述 細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于285 315m0sm/kgH20、pH6. 8 7. 8的緩沖液在 20°C溫度下調(diào)制在1. 07260 1. 07650克/毫升范圍內(nèi)。所述免疫微球或免疫顆粒的比重 高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重?；谒黾?xì)胞分離介質(zhì)的離心在普通的商品化的離心管內(nèi) 進(jìn)行。迄今所有檢測(cè)循環(huán)稀有細(xì)胞的技術(shù)手段都基于免疫熒光方法。但來(lái)源于熒光染料 自身負(fù)電荷引起的與靶細(xì)胞的非特異結(jié)合這一主要缺點(diǎn)卻無(wú)可避免。該缺點(diǎn)給人們?cè)趨^(qū)分 真假陽(yáng)性染色信號(hào)的過(guò)程中帶來(lái)了極大的困擾。本發(fā)明提供的組合物或試劑盒，能夠克服 免疫熒光帶來(lái)的非特異染色，并使得對(duì)染色的循環(huán)稀有細(xì)胞的檢測(cè)得以在普通光學(xué)顯微鏡 下或者基于顯微鏡原理的掃描儀下進(jìn)行。已被證明為一種高特異性，快速，簡(jiǎn)單，低成本的 技術(shù)手段，而且不再需要任何熒光染料及昂貴的熒光顯微鏡。在本發(fā)明的組合物中，可識(shí)別角蛋白，如角蛋白8，18，19或廣譜角蛋白中任意一 種或任意兩種或兩種以上的單克隆或多克隆抗體被用于識(shí)別從具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體 腫瘤脫落入血液的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。另外一種可識(shí)別白細(xì)胞表面標(biāo)志CD45的單克隆或多克 隆抗體用于白細(xì)胞染色以區(qū)分假陽(yáng)性。本發(fā)明的目的還在于提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀 有細(xì)胞的試劑盒，包括一種組合物，所述組合物包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血 緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)； 其中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介 質(zhì)在20°C下的比重為1. 07156 1. 07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種或兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚 糖，泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。該試劑盒還包括用于容納所述組合物的容器以及可選地帶有抗凝劑的采血管。該試劑盒還包括說(shuō)明書(shū)，用于說(shuō)明試劑盒的使用。在本發(fā)明的試劑盒中，緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面 標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)被分開(kāi)容納在不同的 容器中。該容器可以是安瓿瓶或密封的袋。帶有抗凝劑的采血管可以含有如EDTA、肝素、或 ACD等任一種抗凝劑。在本發(fā)明的試劑盒中，免疫微球或免疫顆粒由特異性識(shí)別白細(xì)胞標(biāo)示物的抗體與 微球或顆粒的表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而形成，所述微球或顆粒的表面可經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng) 過(guò)化學(xué)處理以適于與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，所述微球或顆粒的直徑介于10納米 100微米，所述 微球或顆粒包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅，右旋糖苷，瓊脂糖，或交聯(lián)葡聚 糖。用于制備所述免疫微球的微球?yàn)榇判曰蚍谴判缘?。在本發(fā)明的試劑盒中，用于制備免疫微球或免疫顆粒的抗體特異性地識(shí)別下述但 不局限于這些白細(xì)胞表面標(biāo)示物中的一種或多種⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，⑶84， 或CD102等。在本發(fā)明的試劑盒中，免疫微球或免疫顆粒是將任何經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的 適宜結(jié)合蛋白的固體表面如二氧化硅微球，或右旋糖苷、瓊脂糖、或交聯(lián)葡聚糖微球與配體 或特異的單克隆或多克隆抗體包括抗白細(xì)胞表面標(biāo)示物如CD45和/或CD50的抗體進(jìn)行共 價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而制備而成。在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選該細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C溫度下比重范圍優(yōu)選介于 1. 07260 1. 07650克/毫升(gr/ml或gr/cm3)，這一特定范圍內(nèi)的密度適于將幾乎所有 有核細(xì)胞與紅細(xì)胞及免疫微球進(jìn)行分離。所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種或兩種以上的試劑成份聚乙烯 吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖加泛影酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構(gòu)成的非 離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影 酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液。所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于 280 320m0sm/kg Η20、ρΗ6· 8 7. 8的緩沖液在20°C溫度下調(diào)制在1. 07260 1. 07650克 /毫升范圍內(nèi)。所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重?；谒?細(xì)胞分離介質(zhì)的離心在普通商品化的離心管內(nèi)進(jìn)行。實(shí)施例2利用本發(fā)明的試劑盒從人的血液樣品中快速獲取非血緣性循環(huán)有核細(xì)胞采集IOml人的外周血于試劑盒中攜帶的含以下任何一種抗凝劑，如EDTA、肝素、 或A⑶等的采血管中。離心(1000Xg，15分鐘)后，去掉血漿蛋白。加入試劑盒中攜帶的50毫升低滲紅細(xì)胞融破液(BDPharmingen，California, USA)后，于4°C孵育30分鐘。將樣品標(biāo)本再次離心(lOOOXg，15分鐘)。將沉積的細(xì)胞重懸于試劑盒中攜帶的30毫升緩沖液中。向其中加入試劑盒中攜 帶的2毫升包被有抗CD45和/或CD50的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，室溫孵育30分鐘。將反應(yīng)液加到試劑盒中攜帶的20毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)上方(該 細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1. 07260 1. 07650克/毫升，該細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列 成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；含右旋糖苷的糖溶液，其中聚乙烯吡咯烷酮 包被的膠質(zhì)二氧化硅為0. 2%，含右旋糖苷的糖溶液為0. 35%，在糖溶液中的右旋糖苷為 60%)。然后離心1000Xg，15分鐘。取上清液，將上清液再離心1500 X g，10分鐘。棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的非血緣性有核細(xì)胞。將離心后得到的沉積細(xì)胞重懸于試劑盒攜帶的磷酸鹽緩沖液后可做進(jìn)一步分析。利用本發(fā)明的試劑盒，相對(duì)于目前市場(chǎng)上通用的商品化離心介質(zhì)而言，可極大地 縮短利用上述步驟從人的血液樣品中獲取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的離心時(shí)間，并將循環(huán) 的非血緣性有核細(xì)胞回收率提高到95%。本發(fā)明提供的上述組合物或試劑盒可以用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，或手動(dòng)臨床檢驗(yàn)操作 或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床檢驗(yàn)操作中，上述操作都屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的常規(guī)操作，在此無(wú)需贅述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，上述優(yōu)選實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的具體說(shuō)明，并不構(gòu) 成對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)需要可以對(duì)其進(jìn)行多種改進(jìn)，組合，亞組合以及變換，所有的改進(jìn)， 組合，亞組合、變換以及等效替換都落入在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)，其中，所述緩沖液的滲透壓介于280～320mOsm/kg H2O、pH為6.8～7.8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20℃下的比重為1.07156～1.07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種或兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì) 胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合有特異性地識(shí)別下述的白 細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84、或⑶102。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自 循環(huán)的具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來(lái)源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管 內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 85 7. 75，所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液右旋糖苷，多 聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，或蔗糖，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為1.07260 1.07650克/毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞 在所采集的所述血液樣本中的比例占所有有核細(xì)胞的0. 以下，所述腫瘤細(xì)胞選自所有 上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具 有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干 細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。
6.一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，包括一種組合物，所述組合物包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血緣性 有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)；其中， 所述緩沖液的滲透壓介于280 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在 20°C下的比重為1. 07156 1. 07738克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的 任意一種或任意兩種或兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和 泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物；容納所述組合物的容器以及可選擇地帶有抗凝劑的采血管；載玻片以及所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì) 胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合有特異性地識(shí)別下述的白 細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84、或⑶102。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自 循環(huán)的具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來(lái)源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管 內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞 在所采集的所述血液樣本中的比例占所有有核細(xì)胞的0. 1 %以下，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具 有上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞，如黑色素瘤；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞， 干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的組合物或根據(jù)權(quán)利要求6 9任一項(xiàng)所述的試 劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、或手動(dòng)臨床檢驗(yàn)操作或用于借助于自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備的臨床 檢驗(yàn)操作中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于快速高效地從外周血中提取非血緣性有核細(xì)胞的組合物和試劑盒。本發(fā)明的用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，包括下述成份緩沖液，低滲紅細(xì)胞融破液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)物抗體的磁性或非磁性免疫微球，以及一定密度的細(xì)胞分離介質(zhì)。相對(duì)于目前市場(chǎng)上通用的商品化離心介質(zhì)而言，本發(fā)明的新的組合物的使用可極大地縮短離心時(shí)間，并將細(xì)胞回收率從原有的60±20％穩(wěn)定地提高到95％以上。該組合物與去除白細(xì)胞試劑和低滲融破紅細(xì)胞手段相結(jié)合，可以有效地快速富集提取外周血中的非血緣性循環(huán)稀有細(xì)胞，如腫瘤上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等，對(duì)腫瘤及心臟病的早期診斷具有極大的現(xiàn)實(shí)臨床意義。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101880650SQ200910137289
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2009年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月4日
發(fā)明者李彥萍 申請(qǐng)人:李彥萍