專利名稱：一種改進的線粒體基因組全序列測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進的線粒體基因組全序列測定方法及其在測定線粒體基因組 全序列中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
線粒體是存在于絕大多數(shù)真核細胞內(nèi)的一種基本的、重要的細胞器.它是細胞進 行氧化磷酸化的場所.人們把線粒體本身的遺傳物質(zhì)線粒體基因組(mtDNA)這一遺傳信息 系統(tǒng)歸于真核細胞的第二遺傳信息系統(tǒng)，或核外基因及其表達系統(tǒng).對大量不同動物線粒 體基因組全序列測定表明，動物線粒體基因由大致為15 20kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子組成。 線粒體基因編碼著大約22個tRNAs，大小2個rRNAs和13個疏水性蛋白質(zhì)多肽，這些多肽 包括了與線粒體內(nèi)膜相結(jié)合的酶復(fù)合體的亞單位細胞色素b(Cytb)、2個ATP酶的亞單位、 3個細胞色素c(Cytc)氧化酶的亞單位(CO I，II和III)、7個NADH還原酶復(fù)合體的亞單位 (ND21，22，23，24，24L，25 和 26) (Lee and Kocher, Genetics. , 1995,139 873-887 ；Gares, Genetics.，1998，118 :649_663)。線粒體DNA的研究是近20年來分子生物學(xué)研究的重要課 題之一，它引起人們的極大興趣在于1、線粒體基因組不僅是研究DNA結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的良好模型，也是研究真核 細胞核酸與蛋白質(zhì)合成的一般問題的非常合適的模型系統(tǒng)(廖順堯等，生物化學(xué)與生物物 理進展，2000，27 508-512)。2、線粒體基因組與核基因組在遺傳信息表達上的相互關(guān)系是一個很重要的問題。 線粒體基因組具有獨立復(fù)制的能力，但是實現(xiàn)線粒體基因組復(fù)制與表達所需的許多酶(如 DNA聚合酶、RNA聚合酶)卻是由核基因組編碼的(Anderson, et al.，Nature.，1981，290 457-465)。事實上，編碼線粒體基因組的核基因數(shù)量大大超過了存在于mtDNA本身的基因 數(shù)量，而mtDNA的遺傳信息容量并不大，它的編碼可能性只是核DNA編碼容量的幾萬到幾 十萬分之一，建立這種獨立的線粒體遺傳系統(tǒng)的機制本身使線粒體遺傳顯得極有意義。此 外，線粒體基因向核基因的轉(zhuǎn)座插入和復(fù)制，已作為分析轉(zhuǎn)座機理、病毒轉(zhuǎn)染的一個模型。 線粒體基因組和核基因組的同源基因結(jié)構(gòu)對比也被廣泛地應(yīng)用于核基因和核外基因進化 研究中(Delarbre, et al.，Genetics.，1998，150 :331_344)。3、由于動物線粒體DNA (mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、嚴格的母系遺傳、幾乎不發(fā)生重 組、進化速度快且不同區(qū)域進化速度存在差異等特點，使其在種類鑒別和分類地位的研究 方面及不同等級階元系統(tǒng)發(fā)育的研究方面應(yīng)用十分廣泛。目前，線粒體基因組全序列測定的研究方法主要有三種。1、基于物理分離策略的方法在PCR技術(shù)引入線粒體DNA(簡稱mtDNA)分離以前，對于線粒體基因組全序列 的測定，主要包括(1)高純度mtDNA的獲得；(2)mtDNA片段化成適于克隆測序的短DNA片 段2部分內(nèi)容。高純度mtDNA的獲得，主要有氯化銫密度梯度離心法(Lansman，et al.，J Mol Evol.，1981，17 214-226)和差速離心法(閆華超等，生物技術(shù)通訊，2007，18 :95_97 ；
3Tamura and Aotsuka, Biochem Genet.，1988，26 :815_819)。此夕卜，還有在此基石出上進對亍 局部優(yōu)化的方法，如DNase法、堿變性法和改良的堿變性法等(閆華超等，生物技術(shù)通訊， 2007，18 95-97 ；夏玉玲等，蠶學(xué)通訊，2002，22 :24_29) ；mtDNA片段化通常用限制性內(nèi)切酶 消化或超聲波隨機打斷2種方法將mtDNA片段化為適合克隆測序的短DNA片段。但是，需 要昂貴的設(shè)備，實驗時間較長，尤其是對實驗材料消耗較大。2、基于LA-PCR技術(shù)的方法LA-PCR通常擴增5kb以上的DNA片段，對模板、引物和聚合酶都有相對較為嚴格 的要求(葉維萍等，動物學(xué)雜志，2003,38:105-109)。將線粒體基因組擴增為2個或幾個 相互重疊的DNA大片段為廣大研究人員所采用，成為一種理想的線粒體基因組分離策略。 LA-PCR的擴增產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，既可以作為常規(guī)PCR 二次擴增的模板，利用通用引物進 行擴增成短DNA片段后進行測序(Zhou, et al.，Genome.，2007，50 :855_866)，也可以作為 引物步移法測序的模板進行測序，甚至可以進一步進行限制性內(nèi)切酶切割后，進行克隆測 序(吳孝兵等，科學(xué)通報，2003，48 =1954-1958) 但是，LA-PCR技術(shù)對標本保存要求較高， 而且不同物種間擴增條件差異顯著。3、基于常規(guī)PCR技術(shù)的方法參考公布的線粒體基因組研究通用引物(Simon，et al.，Ann Entomol Soc Am.， 1994,87:651-701)，或通過近源物種的線粒體基因組全序列，設(shè)計出能覆蓋全基因組的引 物，采用常規(guī)PCR技術(shù)直接由總DNA中對線粒體基因組進行擴增，形成一系列長度短于5kb 的DNA片段，并將其克隆進質(zhì)粒載體進行測序。多數(shù)常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物長度可直接克隆至 質(zhì)粒載體進行測序，亦可通過相同的引物進行PCR法直接測序。但是這種方法容易受到線 粒體假基因的干擾

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上提供一種改進的線粒體基因組全序列測定及 引物設(shè)計方法。本發(fā)明內(nèi)容包括模板的篩選、引物設(shè)計、PCR擴增、序列測定結(jié)果的拼接4個部分1、模板的篩選登錄NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)，搜索和待測物種屬 于同一個科甚至同一個目的物種線粒體基因組全序列，同源性在75%以上即可，如果有多 個序列可供利用，通過blast軟件比較，優(yōu)先選擇和待測物種親緣關(guān)系最近的物種的序列為宜。2、引物的設(shè)計思路以通過篩選得到的序列為模板，用PCR引物設(shè)計軟件Primer Premier5. 0設(shè)計用于PCR擴增的引物，見附圖I。具體思路如下1)考慮到目前DNA序列測定技術(shù)水平，一個反應(yīng)能夠測定800-1000bp左右，但測 序結(jié)果的前40-60bp測不到或不可信，必須排除在外，相鄰2段擴增片段之間要有一段重 疊，以便于拼接以及研究成本方面的考慮，每對引物之間的PCR產(chǎn)物長度以1300-1500bp為
且；2)由于PCR引物設(shè)計模板是待測物種的近緣種，以模板線粒體序列的長度 /1300-1500bp，得到大致所需要設(shè)計的引物的對數(shù)。3)引物設(shè)計分2批進行，第一批引物對數(shù)為總引物對數(shù)的一半，相鄰兩對引物擴增片段之間的間隔距離為1000-1200bp，見附圖1.4)將第一批引物的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與引物設(shè)計所用模板經(jīng)blast軟件比較后取 代模板序列中相應(yīng)部位的原有序列，即將新得到的序列片段鑲嵌到模板序列中，這樣得到 的序列大約一半是新的即待測線粒體的序列。5)以4)中得到的鑲嵌有新序列的序列為模板進行第二批引物設(shè)計，而且，第二批 引物中，每一對引物都必須落在新序列中，而且保證第二批引物的每段PCR產(chǎn)物與模板中
的新序列都一段重疊。6)如果有某對或幾對引物的擴增效果不好，可以在這對引物外側(cè)設(shè)計一對鑲嵌 PCR引物進行鑲嵌PCR擴增(見附圖2)，先進行外側(cè)PCR擴增，再以外側(cè)PCR產(chǎn)物為模板進 行內(nèi)測PCR擴增以確保PCR擴增成功。必須保證能與相鄰的PCR產(chǎn)物片段有重疊，以保證 最終的序列拼接。3、總DNA的提取和PCR擴增1)總DNA的提取各種不同的物種總DNA的提取方法不一樣，可根據(jù)不同的情況 選取相應(yīng)的總DNA提取方法。2)PCR擴增以總DNA為模板，反應(yīng)體系總體積為25 yl，其中，雙蒸水16. 2iU， lOXExTaqbuffer 2. 5u 1, dNTP 2. 5 u 1，正向引物 1. 3u 1，反向引物 1. 3u 1，總 DNA 模板 lU 1, ExTaq DNA聚合酶0. 2 yl。PCR反應(yīng)程序根據(jù)引物的實際確定。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，送生物技術(shù)公 司完成測序。4、序列測定結(jié)果的拼接1)利用Primer Premier 5. 0軟件和NCBI網(wǎng)站的blast在線軟件將得到20-30個 PCR片段測序結(jié)果進行拼接成一個完整的mtDNA。2)利用DNAStar軟件包對序列進行開放閱讀框的查找，序列互補鏈的獲得；利用 NCBI網(wǎng)站的ORFfinder軟件完成蛋白編碼序列的翻譯和氨基酸編碼情況的調(diào)查；用blast 在線軟件與模板序列進行比對確定各個線粒體基因及其它非編碼序列在序列中的具體位置。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在(1)與基于物理分離策略的方法比較，PCR擴增模板只需要總DNA，而不需要純的 線粒體基因組DNA，降低了實驗的成本和技術(shù)難度。(2)與常規(guī)PCR技術(shù)比較，本發(fā)明確定了一些相關(guān)的技術(shù)參數(shù)而形成了一種系統(tǒng) 而完整的新的擴增線粒體DNA全序列的新方法，如用作引物設(shè)計模板的近緣物種可以是 分類學(xué)上同一科內(nèi)任何物種的線粒體DNA全序列，而且與待測線粒體的DNA序列同源性在 75%以上即可；每一對PCR引物擴增產(chǎn)物的大致長度1300-1500bp ；相鄰2對PCR引物擴 增產(chǎn)物必須重疊50-200bp ；整個PCR擴增所需要用的引物對數(shù)為模板線粒體序列的長度 /1300-1500bpo(3)與現(xiàn)有的線粒體全序列測定技術(shù)相比，本發(fā)明的最主要的特點在于PCR引物 設(shè)計，考慮到某些引物所在部位的保守性不強，本發(fā)明在這些引物內(nèi)側(cè)引入了鑲嵌PCR引 物并進行鑲嵌PCR擴增來確保PCR擴增成功。(4)本發(fā)明的一個創(chuàng)新點就是將整個序列擴增所用引物分2批進行設(shè)計，第一批引物的設(shè)計以近緣物種的線粒體DNA序列為模板，而第二批PCR引物則完全以自身線粒體 DNA序列為模板進行設(shè)計。由于線粒體DNA的信息結(jié)構(gòu)、地位、作用及其與核基因的相互關(guān)系；細胞進化中獨 立自主遺傳的必要性等是當(dāng)前線粒體分子生物學(xué)研究熱點；線粒體的起源和分化，以及部 分基因序列在分子系統(tǒng)發(fā)生和分子進化研究中的重要作用。本發(fā)明提供了一種成本低，實 驗技術(shù)簡單而且快速的線粒體基因組全序列測定新方法。


圖1為第一批PCR擴增引物設(shè)計2為第二批PCR擴增引物設(shè)計圖，其中斜線陰影部分為第一批PCR產(chǎn)物測序后 將序列鑲嵌到模板序列后的結(jié)果。圖3為鑲嵌PCR引物設(shè)計圖，其中粗箭頭為PCR擴增效果不好的引物外側(cè)的鑲嵌 PCR引物。圖4為波紋唇魚線粒體基因組全序列第一批PCR引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 5為波紋唇魚線粒體基因組全序列第二批PCR引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 6為第一批PCR引物擴增效果不好，但添加第二對鑲嵌引物并經(jīng)PCR擴增后的 瓊脂糖凝膠電泳7為波紋唇魚線粒體基因組全序列，序列全長為17173個堿基
具體實施例方式實施例1 波紋唇魚線粒體基因組全序列的測定1、從NCBI網(wǎng)站查詢篩選，得到隆頭魚科海豬魚的線粒體基因組全序列，以該序列 為模板，進行波紋唇魚線粒體基因組全序列測定的PCR引物設(shè)計2、利用軟件Primer Premier 5. 0進行PCR引物設(shè)計，結(jié)果如下表1和2所示表1波紋唇魚線粒體基因組全序列測定的第一批PCR引物及因擴增效果不好而添
加的第二對鑲嵌引物
6 表2波紋唇魚線粒體基因組全序列測定的第二批PCR引物 所設(shè)計引物全部由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。3、總DNA的提取及PCR擴增1)總DNA提取按《分子克隆實驗指南》(第三版，2002)的方法略做改動。取無水 乙醇保存的尾鰭或肌肉(或新鮮血液)，TE液浸泡1-2天，中間更換2次，開始之前倒TE。 若為鮮活材料則用生理鹽水洗凈。剪碎，加入DNA提取裂解液，震勻加SDS和蛋白酶K，55°C 消化完全。然后用飽和酚、酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)、氯仿/異戊醇(24 1)抽 提，離心取上清，加少量NaCl和大于2倍體積的無水乙醇沉淀，然后用70%乙醇漂洗，倒去 乙醇，自然干燥后加適量TE溶解，4°C保存，長期保存則分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。取部分DNA 模板于核酸蛋白定量儀上測定A260和A280計算濃度和純度。2)PCR擴增以總DNA為模板，反應(yīng)體系總體積為25 yl，其中，雙蒸水16. 2iU， lOXExTaqbuffer 2. 5u 1, dNTP 2. 5 u 1，正向引物 1. 3u 1，反向引物 1. 3u 1，總 DNA 模板 lU l,ExTaq DNA聚合酶0. 2yl。PCR反應(yīng)程序根據(jù)引物的實際確定。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳檢測后用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海生工)純化，送上海生工完 成測序。3)對經(jīng)檢測PCR擴增產(chǎn)物不理想的引物(第3、7、9對引物)，分別在其外側(cè)再設(shè) 計一對引物，按上述相同的方法進行PCR擴增并測序。4)用Primer Premier 5. 0軟件和NCBI網(wǎng)站的blast在線軟件對第一批PCR產(chǎn)物 測序結(jié)果進行分析比對，并將其鑲嵌在原模板中和該序列片對應(yīng)的同源片段部位，這樣得 到一個長的混合序列，其中一部分為波紋唇魚的線粒體序列，另一部分為海豬魚的線粒體 序列。以此混合序列為模板再進行第二批PCR引物設(shè)計，但第二批PCR引物位置必須落在 波紋唇魚的線粒體序列內(nèi)部；然后按照上述2)和3)的方法進行擴增和測序。第一批和第 二批PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4和圖5所示。4、所得序列結(jié)果的拼接
用Primer Premier 5. 0軟件和NCBI網(wǎng)站的blast在線軟件將得到21個PCR片 段測序結(jié)果進行拼接成一個完整的mtDNA ；再利用DNAStar軟件包對序列進行開放閱讀框 的查找，序列互補鏈的獲得；并利用NCBI網(wǎng)站的ORFfinder軟件完成蛋白編碼序列的翻譯 和氨基酸編碼情況的調(diào)查；用blast在線軟件與模板序列進行比對確定各個 線粒體基因及 其它非編碼序列在序列中的具體位置。得到波紋唇魚的線粒體全序列如圖7所示。
權(quán)利要求
建立在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的一種改進的線粒體基因組全序列測定方法，包括如下步驟1)模板的篩選；2)引物的設(shè)計；3)總DNA提取、PCR擴增及測序；4)測序結(jié)果的序列拼接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于篩選分類學(xué)上屬于同一個科的物種線粒 體基因組全序列作為模板，其與待測序列同源性75%以上即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于利用PrimerPremier 5. 0軟件進行 引物設(shè)計，軟件 Primer Premier 5. http //www, premierbiosoft. com/T"lfe,弓I 物設(shè)計分2批進行，第一批引物數(shù)目為總引物數(shù)目的一半，相鄰兩對引物擴增片段之間的 間隔距離為1000-1200bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于第一批引物的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與 引物設(shè)計所用模板經(jīng)blast軟件比較后取代模板序列中相應(yīng)部位的原有序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于以得到的鑲嵌有新序列的序列為模板進 行第二批引物設(shè)計，而且，第二批引物中，每一對引物都必須落在新序列中，而且保證第二 批引物的每段PCR產(chǎn)物與模板中的新序列都有一段50-100bp重疊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的方法，其特征在于對于PCR擴增效果不好引物，在其外 側(cè)再引入一對PCR引物，進行鑲嵌PCR擴增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上改進了的線粒體基因組全序列測定方法，目的是提供一種成本低，實驗技術(shù)簡單而且快速的線粒體基因組全序列測定新方法。本發(fā)明的特征在于模板的篩選和PCR引物的設(shè)計，確定了能作為模板的近緣物種線粒體全序列的最低同源性；將引物的設(shè)計分2批進行，并將鑲嵌PCR方法引入序列擴增過程中；給出了PCR引物設(shè)計的一般規(guī)則。本發(fā)明主要用于線粒體基因組全序列測定，為遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等基礎(chǔ)科學(xué)研究服務(wù)。
文檔編號C12Q1/68GK101875966SQ20091013817
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者尹紹武, 張本, 陳國華, 霍蕊, 駱劍, 齊興柱 申請人:海南大學(xué)