專利名稱：：基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及一種金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：目前對(duì)金黃色葡萄球菌有多種檢測(cè)方法，從以病原微生物分離鑒定、形態(tài)學(xué)鑒定和自動(dòng)生化鑒定為主的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T4789.7_2003)，到特異蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)等分子生物學(xué)檢測(cè)方法[食品安全檢測(cè)與現(xiàn)代生物技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2004年]。其中病原核酸檢測(cè)在快速性、安全性、準(zhǔn)確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等微生物學(xué)檢測(cè)舊模式，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離提純，而直接用樣品或樣品的增菌液對(duì)其基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測(cè)，并且與分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)手段相結(jié)合，向準(zhǔn)確、快速、靈敏和自動(dòng)化的方向發(fā)展。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門(mén)的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過(guò)程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtimePCR)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問(wèn)題，并簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器，因此不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對(duì)滿足病原微生物檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫?cái)U(kuò)增(IsothermalAmplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是病原核酸檢測(cè)技術(shù)上的長(zhǎng)足進(jìn)步，現(xiàn)己建立起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplicationofDNA，簡(jiǎn)稱LAMP)具有很多的優(yōu)越性，且目前也未見(jiàn)有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的基因快速診斷試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種檢測(cè)成本低、使用方便、檢測(cè)速度快、特異性高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的一、本發(fā)明的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒，是由兩対引物、BWDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成，以上六種液體分別置于容器中，其中所述的兩對(duì)引物為外引物F3:TTTTCATAATCRATCACTGGAC，如SEQIDNO:l所示；外引物B3:TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT,如SEQIDNO:2所示；內(nèi)弓i物FIP:ACAATAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC，如SEQIDNO:3所示；內(nèi)引物BIP:CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCATACAGTC,如SEQIDNO:4所示；上述反應(yīng)液含有1.62mmol/LdNTP、2025mmol/LTris-HCl、1012.5mmol/L氯化鉀、1012.5mmol/L硫酸銨、810mmol/L硫酸鎂、0.10.125%TritonX-100、0.8lmol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.62mol/L和外引物F3/B3各0.20.25mol/L。優(yōu)選的比例是反應(yīng)液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、lmol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。(0.10.125%TritonX-100是指TritonX-100占樣品預(yù)處理液的體積百分比為0.10.125%)上述樣品預(yù)處理液含有1020mmol/LpH8.0的Tris-HCl、12mmol/LEDTA禾卩11.2%TritonX-100。優(yōu)選的比例是樣品預(yù)處理液含有20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.20/。TritonX畫(huà)IOO。(11.2%TritonX-100是TritonX-100占樣品預(yù)處理液的體積百分比為11.2%)上述顯色液優(yōu)選為熒光染料SYBRGreenI;上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。上述陽(yáng)性對(duì)照為金黃色葡萄球菌基因組DNA。二、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測(cè)，抽樣質(zhì)檢；2、將反應(yīng)液無(wú)菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢;3、將穩(wěn)定液無(wú)菌分裝，抽樣質(zhì)檢；4、將陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、組裝試劑盒。三、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法1、樣品處理將待測(cè)樣品于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預(yù)處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為待用的樣品模板DNA;2、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過(guò)程在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液3840體積％，BstDNA聚合酶大片段0.91.8體積％，穩(wěn)定液5254.5體積％，樣品模板DNA4.59體積％，6365。C恒溫反應(yīng)4590min。所述體積百分比是指占四個(gè)組分總體積的體積百分比。3、反應(yīng)后處理在上述反應(yīng)管和陽(yáng)性對(duì)照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對(duì)照組相同則為陽(yáng)性，否則為陰性。本發(fā)明的原理是利用萬(wàn)WDNA聚合酶和根據(jù)耙基因序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過(guò)程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg^結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過(guò)肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(6365°C)條件下4590分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒(méi)有溫度循環(huán)使所需儀器簡(jiǎn)單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡(jiǎn)便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡(jiǎn)便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門(mén)的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，而且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。國(guó)內(nèi)目前尚未有這方面的試劑盒出售。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒定需23天，完成鑒定報(bào)告需1015天；采用本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒僅需2小時(shí)。并且，本發(fā)明的反應(yīng)液中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高；4.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需100拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg^結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠。圖1為22株菌及細(xì)菌DNA混合液LAMP結(jié)果圖；圖1中，l為陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，319為非金黃色葡萄球菌，20-23為金黃色葡萄球菌臨床分離株，24為ATCC6538，25為細(xì)菌DNA混合。圖2為金黃色葡萄球菌不同稀釋濃度LAMP檢測(cè)結(jié)果；圖2中，P為陽(yáng)性對(duì)照，N為陰性對(duì)照，0為細(xì)菌原液，110分別為10i10W稀釋倍數(shù)。圖3為金黃色葡萄球菌不同稀釋倍數(shù)LAMP檢測(cè)結(jié)果；圖3中，M為Marker,P為陽(yáng)性對(duì)照，N為陰性對(duì)照，0為細(xì)菌原液，110分別為10'1(T稀釋倍數(shù)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l試劑盒的制備(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物-外引物F3:TTTTCATAATCRATCACTGGAC,如SEQIDN0:1所示；外引物B3:TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT,如SEQIDN0:2所示；內(nèi)引物FIP:ACAATAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC，如SEQIDNO:3所示；內(nèi)引物BIP:CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCATACAGTC，如SEQIDNO:4所示；(2)購(gòu)置DNA聚合酶S^DNApolymerase(LargeFragment)。置于容器。(3)配制反應(yīng)液反應(yīng)液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、lmol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2。/。TritonX-100，置于容器。(5)購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購(gòu)置顯色液SYBRGreenI，置于容器。(7)提取陽(yáng)性對(duì)照金黃色葡萄球菌基因組DNA，置于容器。(8)將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡(jiǎn)述如下1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測(cè)，抽樣質(zhì)檢；2、將反應(yīng)液無(wú)菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢;3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；4、'將陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、組裝試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的制備反應(yīng)液的配方為反應(yīng)液含有1.8mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HC1、10mmol/L氯化鉀、10mmol/L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0.1%TritonX-lOO、0.8mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6mol/L和外引物F3/B3各0.2mol/L;樣品預(yù)處理液的配方為樣品預(yù)處理液含有10mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1mmol/LEDTA禾卩1%TritonX-100。其他同實(shí)施例1。實(shí)施例3金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒的應(yīng)用1材料與方法1.1材料1.1.1菌株本公司用菌株有22株，主要來(lái)源于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心、中國(guó)藥品生物制品檢定所及臨床分離。詳見(jiàn)表l。表1菌株名稱及來(lái)源<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>l丄2主要儀器和試劑'1.2分離菌株的鑒定1.2.1金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株用LB培養(yǎng)基，37°C，培養(yǎng)18-24小時(shí)。于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板25。C培養(yǎng)24小時(shí)分離出單菌落。1.2.2臨床分離株的分離鑒定臨床分離株增菌后，分別于相應(yīng)的篩選平板上分離出單菌落，挑可疑單菌落作生化鑒定。1.3樣品處理(1)取lml增菌液10000rpm離心2分鐘，去盡上清，獲取菌體沉淀；若為平板菌落，則可以直接挑取單菌落，在核酸提取液中涮洗一下；(2)在上述菌體沉淀中加入80pL核酸提取液混合均勻，沸水中煮20分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘，10000rpm離心2分鐘，上清即為樣品模板DNA。1.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)過(guò)程(1)在200|iL反應(yīng)管配制反應(yīng)體系反應(yīng)液22pL，DNA聚合酶0.5pL(4U)，穩(wěn)定液30pL，模板DNA2.5^L。(2)將配制好的反應(yīng)管于65。C恒溫反應(yīng)1小時(shí)。1.5反應(yīng)后處理向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入2pLSYBRGreenI，混勻，若反應(yīng)管與陽(yáng)性對(duì)照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，若反應(yīng)管顯現(xiàn)橙色則為陰性。1.6電泳配制0.1%瓊脂糖凝膠，直接加入顯色后的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。1.7特異性試驗(yàn)1.7.1純菌株LAMP檢測(cè)用LAMP方法對(duì)22株細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)顯色反應(yīng)觀察結(jié)果，綠色為陽(yáng)性，橙色陰性，驗(yàn)證該方法的特異性。1.7.2幾種菌株混合DNA檢測(cè)用LAMP對(duì)金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌等幾種菌DNA等體積混合液取2.5jaL作LAMP檢測(cè)。1.8靈敏度試驗(yàn)將ATCC6538菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁時(shí)測(cè)其吸光度，當(dāng)吸光度值在0.35-0.45之間時(shí)，用0.85%的生理鹽水梯度稀釋。每次稀釋十倍，制成10"-10"g—系列稀釋菌液。采用10'6、10—7、10_8、稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度分別作3個(gè)平板，37。C培養(yǎng)24h,取菌落數(shù)在30300之間的平板作平板計(jì)數(shù)，該濃度級(jí)的3個(gè)平板的菌落數(shù)的均數(shù)^^算細(xì)菌濃度，為菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù)xlO;同時(shí)，各濃度級(jí)取lmL，提取DNA，作LAMP1.9重復(fù)性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn)分別重復(fù)2次。2結(jié)果2.1金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)方法的建立2.2特異性試驗(yàn)ATCC6538檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，4株臨床分離金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，17株非金黃色葡萄球菌均陰性，金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、豬霍亂沙門(mén)、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌等幾種細(xì)菌DNA混合液為陽(yáng)性，如圖1。說(shuō)明特異性強(qiáng)。2.3靈敏度試驗(yàn)經(jīng)菌落平板計(jì)數(shù)，選擇第6、7、8個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行讀數(shù)，推算得LAMP方法最低可檢測(cè)3.7xl0Vfii/mL。如圖2、3。2.4重復(fù)性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果一致。靈敏度試驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果一致?；诃h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法序列表SEQUENCELISTING<110>廣州華峰生物科技有限公司<120>基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法〈130〉<160>4<170〉PatentInversion3.2<210>1<211>22<212>腿<213>人工序列<卿>1外引物F3:TTTTCATAATCRATCACTGGAC<210>2<211〉22<212>DNA<213>人工序列<400>2外引物B3:TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT〈210〉3<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>3內(nèi)引物FIP:ACAATAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC<210>4〈211〉50<212>DNA<213>人工序列<400>4內(nèi)引物BIP:CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCATACAGTC權(quán)利要求1、一種金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對(duì)引物、BstDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成，以上七種液體分別置于容器中，上述兩對(duì)引物為外引物F3TTTTCATAATCRATCACTGGAC；外引物B3TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT；內(nèi)引物FIPACAATAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC；內(nèi)引物BIPCCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCATACAGTC；上述反應(yīng)液含有1.6～2mmol/LdNTP、20～25mmol/LTris-HCl、10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；上述樣品預(yù)處理液含有10～20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2％TritonX-100。上述陽(yáng)性對(duì)照為金黃色葡萄球菌基因組DNA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述的顯色液為SYBR3、根據(jù)權(quán)利要求l所述試劑盒，其特征在于所述樣品預(yù)處理液含有20mmol/LpH8.0的Tris-HC1、2mmol/LEDTA和1.20/。TritonX國(guó)IOO。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、lmol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0，25mol/L。5、一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其特征是使用權(quán)利要求l所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行(1)將待測(cè)樣品于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預(yù)處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為待用的樣品模板DNA;(2)在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液3840體積％，BstDNA聚合酶大片段0.91.8體積％，穩(wěn)定液5254.5體積％，樣品模板DNA4.59體積％，恒溫反應(yīng)；(3)在上述反應(yīng)管和陽(yáng)性對(duì)照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對(duì)照組相同則為陽(yáng)性，否則為陰性。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度6365°C，反應(yīng)時(shí)間4590min。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法，其特征在于所述穩(wěn)定液為石蠟油。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒由兩對(duì)引物、DNA聚合酶、反應(yīng)液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成，以上六種液體分別置于容器中。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，更加明顯可靠。文檔編號(hào)C12R1/445GK101565753SQ20091013832公開(kāi)日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年4月28日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者曹以誠(chéng),李心暉,李志勇,杜正平,柯昌文,王志強(qiáng),譚慧媚,鄧小玲,洵陳,高東微申請(qǐng)人:廣州華峰生物科技有限公司