專利名稱：：治療包括炎癥狀況的疾病的寡核苷酸組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于基于反義寡核苷酸治療的方法、試刑和組合物.具體地，本發(fā)明涉及基于反義寡核苷酸治療在治療與患者中cAMP降低相關(guān)疾病中的應(yīng)用，這些疾病包括，例如，PDE相關(guān)的疾病如炎癥狀況.本發(fā)明還涉及基因治療方法和鑒定環(huán)狀A(yù)MP褲酸二酯酶參與的新的基于反義的策略的方法.
背景技術(shù)：
：肺泡和氣道上皮被認(rèn)為是動態(tài)屏陣，在調(diào)節(jié)對氣化應(yīng)激的炎性和代謝應(yīng)答、膿毒癥、內(nèi)毒素血癥和其它肺部關(guān)鍵疾病中起重要作用.呼吸上皮尤其是在上皮-血液界面的炎性/感染性狀況的主要靶，并且其自身能通過募集炎性細(xì)胞并產(chǎn)生炎性介質(zhì)而放大炎癥信號.慢性阻塞性肺病(COPD)是炎性氣道和肺泡疾病的一個實例，其中炎癥持續(xù)上調(diào)被認(rèn)為起重要作用.COPD的炎癥特征是嗜中性粒細(xì)胞、CD8陽性淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在氣道中的浸潤增加.嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在COPD的氣道炎癥病變中起重要作用，因為它們能釋放多種介質(zhì)，包括彈性蛋白蘇、金屬蛋白酶、和氧自由基，它們能促進組織炎癥和損傷.已經(jīng)提出COPD患者氣道中的炎癥細(xì)胞積累是因為促炎細(xì)胞因子釋放增加和吸引炎癥細(xì)胞到氣道中并活化和維持其存在的趨化因子的釋放增加.這些存在的細(xì)胞還釋放醉(如金屬蛋白酶)和氧自由基，它們對組織有負(fù)作用并使疾病持續(xù).已經(jīng)顯示，在COPD患者的肺中大重促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子增加.其中腫瘤壞死因子a(TNF-a)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素8(1L-8)有重要作用，它們在COPD患者的氣道中增加.炎癥似乎起重要作用的呼吸系統(tǒng)疾病的其它實例包括哮喘、嗜4酸性粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、急性和慢性肺異體移植排斥、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎和鼻竇炎.哞喘的特征為氣道炎癥、可逆性阻塞和氣道高反應(yīng)性.在這種疾病中，參與的炎癥細(xì)胞主要是嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞，盡管嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也很重要.已經(jīng)表明，大量細(xì)胞因子和趨化因子在氣道中增加并通過促進炎癥、阻塞和高反應(yīng)性在該病的病理生理中起重要作用.嗜酸性粒細(xì)胞性咳嗽特征是慢性咳嗽和在患者氣道中存在炎癥細(xì)胞，其中多為嗜酸性粒細(xì)胞，而缺少氣道阻塞或高反應(yīng)性.該疾病中，幾種細(xì)胞因子和趨化因子也增加，盡管它們多是針對嗜酸性粒細(xì)胞.嗜酸性粒細(xì)胞被募集到氣道中并被活化，并可能釋放醉和氧自由基，它們在維持炎癥和咳嗽中起作用.急性支氣管炎是在下氣道感染或刺激性亊件期間發(fā)生的急性疾病，這些事件例如由于污染、塵、氣體或化學(xué)物而引起.慢性支氣管炎特征是在兩年中至少3個月的多數(shù)天里存在咳嗽和產(chǎn)生痰.在急性或慢性支氣管炎期間，還可以在氣道中發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞多數(shù)是嗜中性粒細(xì)胞，以及廣泛的趨化因子和細(xì)胞因子.這些介質(zhì)被認(rèn)為在疾病期間出現(xiàn)的炎癥、癥狀和粘液產(chǎn)生中起作用.肺移植在具有晚期肺病的患者中進行.當(dāng)身體的炎癥細(xì)胞，淋巴細(xì)胞不識別供體器官為"自己"時發(fā)生急性和更重要的慢性異體移植排斥.炎癥細(xì)胞被趨化因子和細(xì)胞因子募集并釋放大重導(dǎo)致組織破壞的酶，在慢性排斥時疾病被稱為閉塞性細(xì)支氣管炎.結(jié)節(jié)病是組織內(nèi)發(fā)生慢性非干酪性肉芽腫的未知原因疾病.肺是最經(jīng)常受影響的器官.支氣管肺泡灌洗顯示主要是淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增加，有時嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞也增加.這些細(xì)胞也被細(xì)胞因子和趨化因子募集并活化，并被認(rèn)為參與疾病發(fā)生.肺纖維化是以進行性和慢性纖維化(形成疤痕)為特征的肺組織疾病，這種纖維化將導(dǎo)致慢性呼吸功能不全.肺纖維化存在不同的類型和原因，但其特征都具有炎癥細(xì)胞流入和持續(xù)、成纖維細(xì)胞活化和增殖將膠原沉積在肺組織中.這些事件似乎與肺組織內(nèi)釋放細(xì)胞因子和趨化因子有關(guān).急性鼻炎是在鼻或上氣道感染或刺激性事件期間發(fā)生的急性疾病，這些亊件例如由于污染、塵、氣體或化學(xué)物而引起.仗性鼻炎特征是持續(xù)存在慢性流鼻涕、鼻充血、噴嚏和瘙癢.在急性或慢性券炎期間，還可以在上氣道中發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞以及廣泛的趨化因子和細(xì)胞因子.這些介質(zhì)被認(rèn)為在疾病期間出現(xiàn)的炎癥、癥狀和枯液產(chǎn)生中起作用.急性鼻竇炎是急性、通常是感染性鼻竇疾病，其特征是鼻充血、流鼻沐、膿痰、頭痛或鼻竇痛，有或無發(fā)燒.慢性鼻竇炎特征是急性鼻竇炎癥狀持續(xù)超過6個月.在急性或慢性鼻竇炎期間，還可以在上氣道和鼻竇中發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞以及廣泛的趨化因子和細(xì)胞因子.這些介質(zhì)被認(rèn)為在疾病期間出現(xiàn)的炎癥、癥狀和粘液產(chǎn)生中起作用.如上所述，這些炎性呼吸系統(tǒng)疾病都具有這些特征存在募集和活化不同炎癥細(xì)胞的介質(zhì)，這些細(xì)胞幹放引起癥狀的睞或氣自由基，持續(xù)炎癥，和當(dāng)慢性疾病時破壞或損壞正常組織.合理的治療方法是下調(diào)細(xì)胞罔子和趁化罔子生成和炎癥細(xì)胞應(yīng)答.這已經(jīng)通過局部或全身性施用皮質(zhì)類固醇在所有上述疾病中獲得不同程度的成功.皮質(zhì)類固醇是免疫抑制性的，不僅對炎癥細(xì)胞有作用而且對身體的其它細(xì)胞也有作用，當(dāng)長期施用時導(dǎo)致毒性.盡管COPD、嗜喘和其它炎性呼吸系統(tǒng)疾病藥物的可用性，這些疾病的流行和發(fā)病率保持穗定或增加.顯而易見，對于炎性呼吸系統(tǒng)疾病治療有未被滿足的醫(yī)療需求，并且急迫需要創(chuàng)新性治療刑.基于反義寡核苷酸的治療提供新的替代性方法，它選擇性降低特定基因的表達而沒有傳統(tǒng)治療策略的不期望的毒性作用.反義治療正被研究用于治療幾種疾病.之前如WO9966037所述已經(jīng)表明，針對炎性介質(zhì)受體的反義寡核苷酸能被給予到肺并下調(diào)其靶.對于炎性呼吸系統(tǒng)疾病或任意其它系統(tǒng)性炎性疾病，使大量細(xì)胞釋放促炎癥細(xì)胞罔子和趨化因子下調(diào)并對抗炎性介質(zhì)或醉釋放有更低作用的治療方法可能具有超過當(dāng)前治療的優(yōu)點.環(huán)狀核香酸cAMP和cGMP是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和機制的遍在性笫二信使.哺乳動物細(xì)胞已經(jīng)進化出復(fù)雜和高度保守性的醉系統(tǒng)，通過多種和復(fù)雜的前饋和反饋機制，這些醉調(diào)節(jié)環(huán)狀核苷酸的生成和滅活.cAMP和cGMP都是從各自的三砩酸形式(ATP和GTP)分別由腺普跌(腺苷酸)或烏苷酰(烏苷酸)環(huán)化蘇的催化活性形成，這些酶描述于EssayanD.M.Cyclicnucleotidephosphodiesterase(PDE)6inhibitorsandimmunomodulation.Biochem.Pharmacol.,1999，57,965-973.cAMP/cGMP滅活是通過由環(huán)狀核苷酸依賴性褲酸二酯酶(PDE)催化水解切割3，-褲酸二醋鍵、導(dǎo)致形成相應(yīng)的無活性5，-單褲酸而實現(xiàn)的，如下所述Essayan,1999andPerryM丄andHiggsG.A.Chemotherapeuticpotentialofphosphodiesteraseinhibitors.1998，CurrOponChemBiol.4:472-81.已經(jīng)表明，炎癥應(yīng)答及其進展對于環(huán)狀核苷酸穗態(tài)水平的調(diào)節(jié)極其敏感，這些作用的靶細(xì)胞超過免疫細(xì)胞的范圍還包括另外的細(xì)胞如氣道平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，如PerryandHiggs，1998;Essayan，1999所述.在此方面，細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸調(diào)節(jié)在炎癥調(diào)節(jié)中起主要作用的概念顯現(xiàn)出來，并在最近演變?yōu)榘邢蚝吞岣哐装Y/自身免疫應(yīng)答.因此提示體外和體內(nèi)環(huán)狀核苷酸PDE抑制刑具有作為抗抑郁刑、抗增殖刑、免疫調(diào)節(jié)刑、宮縮抑制刑(tocolytics)、變力性刑/變時性刑(inotropes/chronotropes)、和細(xì)胞保護刑的潛在治療用途.細(xì)胞內(nèi)cAMP似乎不僅在,平滑肌松弛、活化和增殖中，而且在調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞釋放介質(zhì)中具有基礎(chǔ)作用.降低的cAMP水平能導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞中炎癥介質(zhì)如TNF-a、GM-CSF和IL-8生成增加.細(xì)胞因子在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及炎癥/自身免疫/感染性疾病中的調(diào)節(jié)作用的分子機制研究已經(jīng)開始提供設(shè)計藥理介入的治療策略的新方法.一種這樣的方法是PDE醉阻斷的化學(xué)治療潛能，這顯示對于廣泛疾病狀態(tài)的有前景治療刑的現(xiàn)象多樣性和復(fù)雜性.PDE抑制的一種機理性理解集中于環(huán)狀核苷酸(cAMP/cGMP)的免疫調(diào)節(jié)特性，從而為由此能清楚證明抗炎性、治療性應(yīng)用作準(zhǔn)備.炎癥應(yīng)答及其進程對于環(huán)核苷酸穩(wěn)態(tài)水平的調(diào)節(jié)極其敏感，這些作用的把細(xì)胞超過免疫細(xì)胞的范圍還包括結(jié)構(gòu)細(xì)胞如上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞(PerryandHiggs,1998;Essayan，1999).細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸調(diào)節(jié)在炎癥調(diào)節(jié)中起主要作用.環(huán)狀核苷酸PDE是大的、生長中的多基因家族，包括至少11個PDE同工醉家族.PDE的區(qū)別在于其組織和細(xì)胞分布、以及其分子和理化性質(zhì)包括核苷酸和蛋白質(zhì)序列、底物特異性、抑制刑敏感性和輔因子要求.在不同家族內(nèi)，通過mRNA剪接和使用不同啟動子從同相同基因產(chǎn)生組織特異性同工型.cAMP特異性PDE4醉家族是最集中研究的PDE之一.該家族內(nèi)的酶大多在促炎癥和免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，它們在調(diào)節(jié)cAMP代謝中起關(guān)鍵作用.PDE4醉表達于巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、和氣道平滑肌細(xì)胞.而且，PDE4抑制刑在呼吸系統(tǒng)疾病動物模型中調(diào)節(jié)炎癥，提示在用小分子抑制刑的基于治療刑的介入策略中PDE4可以代表合適的靶.抗PDE4藥物抑制細(xì)胞內(nèi)cAMP水解，從而提供支氣管擴張并抑制炎癥反應(yīng).選擇性PDE4抑制刑如cilomilast和roflumilast在嗜中性粒細(xì)胞炎癥的動物模型中有活性(BundschuchDSetal.J.Pharmacol.Exp.Ther.2001,297:280-2卯)盡管正在對PDE4抑制刑用于治療氣道炎癥的應(yīng)用進行大量臨床研究，幾種抑制刑已經(jīng)被排除，這是由于毒性、限制刑量的副作用，其中惡心和嘔吐是最常見的生理表現(xiàn).因此，提高PDE4抑制刑的治療比是主要挑戰(zhàn)，這仍是重要的研究領(lǐng)域.考慮到酶在靶組織中的分布，在氣道平滑肌和炎癥細(xì)胞中具有高活性的PDE3和PDE4,這些酶的選擇性抑制刑可以加到慢性氣流阻塞的治療中，一般來說，小分子抑制刑已經(jīng)集中于一種或幾種PDE而沒有評價抑制PDE所有同工醉的潛在不利作用.例如，已經(jīng)建議，由于PDE4拮抗刑的毒性多數(shù)將通過抑制PDE4同種型D而出現(xiàn)，此外，如本文所述，抑制某些PDE4同工醉不降低所有促炎癥介質(zhì)，然而，當(dāng)使用正確組合的反義寡核苷酸時，同種型特異性寡核苷酸的組合可導(dǎo)致寬得多的作用.PDE3家族含有兩種不同基因，PDE3A和PDE3B,它們是cGMP抑制的并顯示對cAMP的高親合性.每種PDE3基因編碼至少兩種剪接異構(gòu)體.PDE3A已經(jīng)在平滑肌、血小板、和心肌組織中筌定.PDE3B在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中最豐富.然而，選擇性PDE3抑制刑或組合PDE4抑制刑的臨床試驗的初步數(shù)據(jù)有些令人失望，并且對其期望已經(jīng)改變很多，這是由于這些藥物的療效有限并且由于副作用而使其臨床應(yīng)用受限.PDE7首先在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘸中分離.PDE7A編碼cAMP特異性PDE,它對cGMP和PDE3和PDE4抑制劑不敏感，其氨基酸序列與其它cAMPPDE明顯不同.人類有兩種基因(PDE7A和PDE7B)已經(jīng)被表征.PDE7A基因編碼三種同工睞(PDE7A1、PDE7A2和PDE7A3),它們通過mRNA可變剪接來自同一基因.在人中，PDE7A2mRNA在骨骼肌、心和腎中表達豐富，而奪丸、肺和免疫系統(tǒng)(胸腺、脾、淋巴結(jié)、血液白細(xì)胞)是PDE7A1的豐富來源.此外，活化的、而非幼稚的人T淋巴細(xì)胞表達PDE7A3剪接變體.相比較而言，PDE7B在人中作為單個同工醉存在，它與PDE7A有約70%序列相似性，但動力學(xué)特性不同.PDE7B主要^腦和多種其它組織，包括肝、心、甲狀腺和骨輅肌中表達.已經(jīng)顯示，用抗CD3和抗CD28抗體刺激人幼稚T細(xì)胞促進IL-2生成和克隆擴增.這些作用被歸因于PDE7A,這種酶的下調(diào)阻止淋巴細(xì)胞增殖(LiLetal.，Science,1999,283,848-851),PDE4家族含有4種不同基因(PDE4A-D).由于這些基因的可變剪接，已報道多種剪接變體并被分成兩大類，長形式和短形式.PDE4A、B和D基因產(chǎn)物在大多數(shù)免疫和炎癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn).它們或以組成型或在活化后存在，見下述BurnoufC.andPnmiauxM.P，CurrentPharmaceuticalDesign2002;8:1255-1296.抑制所有或某些同種型的PDE4與幾種炎癥介質(zhì)的下調(diào)相關(guān)；然而某些促炎癥細(xì)胞因子(如IL-6)的增加已經(jīng)被描述(GiembyczM.A.ExpertOpinInvestDrugs2001,10:1361-1379).因此希望抑制所有三種PDE酶，然而這種方法可能受困于使用每種這些醉的抑制刑時已經(jīng)描述的毒性.局部應(yīng)用反義寡核苷酸可能克服酶抑制的全身毒性，但這些PDE的太多同工醉使得這種方法不現(xiàn)實.抑制一種或幾種PDE酶的同種型可能不如全部抑制PDE有效，因為其它同種型的存在具有促炎癥作用.因此，對于炎性呼吸系統(tǒng)疾病的治療，希望尋求下調(diào)促炎癥介質(zhì)和炎癥細(xì)胞而更少影響抗炎癥介質(zhì)或抑制酶的方法.因此，本發(fā)明提出針對選定的PDE酶同種型的反義寡核苷酸的組合作為治療炎性呼吸系統(tǒng)疾病或cAMP增加起作用的任何疾病的治療應(yīng)用.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供有效下調(diào)所針對的PDE同種型基因的反義寡核苷酸化合物，以及不僅有效下調(diào)所針對的PDE同種型基因而且下調(diào)其它相關(guān)基因的選定的反義寡核苷酸，所述其它相關(guān)基因包括其它PDE同種型基因和炎癥基因.本發(fā)明還提供包含至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合的組合物，所述至少兩種反義寡核普酸化合物均針對不同的PDE靶基因、均可有效下調(diào)或抑制PDE靶基因，組合中每種寡核苷酸化合物的濃度使之表現(xiàn)對其靶基因的小于20%的抑制，而寡核苷酸化合物的組合表現(xiàn)超過20%抑制并且至少加倍抑制至少一種把基因.本發(fā)明還提供含有制葯接受栽體和上述至少兩種反義寡核苷酸的組合的藥物組合物.本發(fā)明的組合顯示通過已被稱為多基因敲除的方法行使抑制性作用.多基因敲除包括這些情況，其中1)反義寡核苷酸不僅下調(diào)所針對的基因，而且下調(diào)其它相關(guān)基因；和2)至少2種反義寡核苷酸的組合，各自的濃度使得反義寡核普酸自身實際上不能有效下調(diào)所針對的基因，而其組合導(dǎo)致顯著下調(diào)兩種反義寡核苷酸所針對的基因以及任選的其它相關(guān)基因.本發(fā)明使用以上策略提供治療和/或預(yù)防患者中與cAMP降低相關(guān)的疾病的方法、組合物和試刑盒，所述疾病包括PDE相關(guān)的疾病和炎癥疾病包括呼吸系統(tǒng)疾病和更具體的COPD和哮喘.本發(fā)明提供包含至少2種反義寡核苷酸化合物的組合物，每種反義寡核苷酸化合物能下調(diào)不同的基因，每種反義寡核苷酸化合物的濃度使得反義寡核苷酸自身實際上不能有效下調(diào)所針對的基因，而所述至少2種反義寡核苷酸的組合導(dǎo)致顯著下調(diào)所述反義寡核苷酸各自所針對的基因以及任選的其它相關(guān)基因.本發(fā)明還提供所迷組合物在治療和/或預(yù)防炎性呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用.本發(fā)明提供包含至少兩種反義寡核苷酸的組合物，所述兩種寡核苷酸能下調(diào)不同的PDE同工酶基閎，每種反義寡核苷酸化合物的濃度使得反義寡核苷酸自身實際上不能有效下調(diào)所針對的基因，而所述至少2種反義寡核苷酸的組合導(dǎo)致顯著下調(diào)所述兩種反義寡核苷酸所針對的基因以及任選的其它相關(guān)基因.本發(fā)明還提供所迷組合物在治療和/或預(yù)防炎性呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用.本發(fā)明還提供降低細(xì)胞環(huán)狀A(yù)MP褲酸二醋醉表達及相應(yīng)活性并從而維持細(xì)胞內(nèi)cAMP和細(xì)胞因子/趨化因子生成的適當(dāng)平衡的方法、試刑和組合物.10本發(fā)明還提供體外、體內(nèi)和離體鑒定/篩選能干擾PDE表達并能提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的新的反義寡核苷酸化合物的組合、藥物和疫苗的方法和工具.本發(fā)明還提供基于基因的治療和轉(zhuǎn)染方法，其中一種或多種反義寡核苷酸化合物被用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染或遞送給人和動物以干擾PDE同種型基因表達.本發(fā)明還提供有效抗PDE3同種型如PDE3A和PDE3，PDE4同種型如PDE4A、PDE4B和PDE4D和PDE7同種型如PDE7A的反義寡核苷酸.本發(fā)明還提供有效用于本發(fā)明的組合物和方法的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸具有選自下組的序列Seq.IDNo.1;Seq.IDNo.2;Seq.IDNo.3;Seq.IDNo.4;Seq.IDNo.5;Seq.IDNo.6;Seq.IDNo.7;Seq.IDNo.8;Seq.IDNo.9;Seq.IDNo.10;Seq.IDNo.11;Seq.IDNo,12;JSeq,IDNo.13;Seq,IDNo.14;Seq.IDNo.15;Seq.IDNo.16;Seq.IDNo.17;Seq.IDNo.18;Seq.IDNo.19;Seq.IDNo.20;Seq.IDNo.21;Seq.IDNo.22;Seq.IDNo.23;Seq.IDNo.24;Seq.IDNo.25;Seq.IDNo.26;Seq.IDNo.27;Seq.IDNo.28;Seq.IDNo.29;Seq.IDNo.30;Seq.IDNo,31;Seq.IDNo.32;Seq.IDNo,33;Seq.IDNo.34;Seq.IDNo.35;Seq.IDNo.36(表la-f)參考附圖通過閱讀幾個優(yōu)選實施方案的以下非限制性描述，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將是顯而易見的.參考以下描述和附困將可以更好理解本發(fā)明，其中困1是6塊凝膠的半定重PCR,表示結(jié)構(gòu)細(xì)胞(A549、支氣管平滑肌細(xì)胞(BSMC)、NCI-H292)、免疫細(xì)胞(外周血單個核細(xì)胞，PBMC)和組織(肺、腦)中的不同磷酸二醋酶(PDE)的表達譜.3A-PDE3A;3B-PDE3B;7A-PDE7A;7B-PDE7B;4A=PDE4A;4B-PDE4B;4C-PDE4C;4D-PDE4D;P-PBGD(膽色素原脫氨酶)；G-GAPDH(3-碑酸甘油搭脫氣酶)；(-)=無逆轉(zhuǎn)錄的RNA擴增；MW-100bpDNA序列梯；困2是7塊凝膠的半定量PCR，表示PDE7A同種型在結(jié)構(gòu)細(xì)胞ii(A549、NHBE、BSMC)和非結(jié)構(gòu)細(xì)胞(Eol-l、Hut-78、Jurkat和U937)中的表達謙，這些細(xì)胞相關(guān)于肺炎癥反應(yīng)中潛在重要的細(xì)胞.7A1-PDE7A1;7A2-PDE7A2;7A3-PDE7A3;G(-)-GAPDH，(-)-無逆轉(zhuǎn)錄的RNA擴增；MW-100bpDNA序列梯；困3是8塊凝膠的半定量PCR，表示1700種反義系列中的一些在降低Eol-l和U937細(xì)胞中PDE7AmRNA表達的效果.C-無反義物；Top-1701、Top-1702、Top-1703、Top-1706、Top-1707和Top-1726=針對PDE7A的反義物；lOObp-DNA序列梯；(0)、(10)和(20)-以jxM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖4是6塊凝膠的半定量PCR,表示1700種反義系列中的一些在降低Jurkat和Hut-78細(xì)胞中PDE7AmRNA表達的效果.C-無反義物；Top-1702、Top-1703、Top-1706、Top-1707和Top-1726-針對PDE7A的反義物；100bp-DNA序列梯；(0)、(10)和(20)-以nM(微摩爾)表示的反義物濃度；閨5是6塊凝膠的半定量PCR，表示1700種反義系列中的一些在降低BSMC和A549細(xì)胞中PDE7AmRNA表達的效果.CI和C2-無反義物；Top-1702、Top-1703和Top-1706-針對PDE7A的反義物；MW-100bpDNA序列梯；(0)和(20)-以pM(微摩爾)表示的反義物濃度；困6是6塊凝膠的半定量PCR，表示1300種反義系列中的一些在降低A549和U937細(xì)胞中PDE3AmRNA表達的效果.C-無反義物；Top-1301、Top-1302、Top-1303、Top-1307、Top-1308、Top-1309和Top-1311-針對PDE3A的反義物；lOObp-DNA序列梯；(0)、(10)和(20)-以nM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖7是6塊凝膠的半定量PCR，表示1300種反義系列在降低BSMC細(xì)胞中PDE3AmRNA表達的效果.CI和C2-無反義物；Top-1301、Top-1302、Top-1303、Top-1307、Top-1308、Top-1309和Top-1311=針對PDE3A的反義物；100bp-DNA序列梯；(0)和(20)-以nM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖8中的半定量PCR表示所述1300和1700種反義系列的反義寡核苷酸在降低BSMC細(xì)胞中MMP-1、MMP曙2、MMP-3、MMP-12、TIMP-l、COX-l、IL-6、IL-7、IL>8、IL>15、TNF-a的相對效果.C=無反義物；Top-1301、Top-1303、Top-1308和Top-1311-針對PDE3A的反義物；Top-1702、Top-1703和T叩-1706-針對PDE7A的反義物；MW-100bpDNA序列梯；困9中半定量PCR的凝膠表示由所述1700和1300種系列的組合在降低U937細(xì)胞中多基因敲除PDE3A和PDE7AmRNA表達的效果和概念.C-無反義物；l-Top-1301;2-Top-1303;3=Top-1307;4=Top-1311;5=Top-1702;6=Top-1703;7=Top-1706;8-Top-1702和1301;9=Top-1703和Top-1301;10-Top-1706和Top-1301;ll=Top-1702和Top-1303;12=Top-1703和Top-1303;13-1706和1303;14=Top-1702和Top-1307;15=Top-1703和Top-1307;16=Top-1706和Top-1307;17=Top-1703和Top-1311;18=Top-1706和Top-1311;MW=100bpDNA序列梯.組合9和13可有效進行多基因敲除；困10中半定量PCR表示所述1300和1700種反義系列的多基因敲除在調(diào)節(jié)U937細(xì)胞中PDE4B、IL曙10、IL-15、MMP-l、MMP-2、MMP-8、TlMP-l表達水平的效果和概念.C-無反義物；Top-1301、Top-1303、Top-1307和Top-1311-針對的反義物；Top-1703和Top-1706=針對PDE7A的反義物；MW=100bpDNA序列梯.l-Top-1301;2=Top-1303;3=Top-1703;4=Top-1706;5=Top-1301和Top-1703;6=Top-1303和Top-1706;7=Top-1311和Top-1703;8-Top-1307和1703;困11表示人PDE反義(AS)功能測試的結(jié)杲及其在TNF-a蛋白水平上的多基因敲除的相對效果.測試評價了針對不同同種型PDE的反義寡核苦酸對PHA刺激的人PBMC生成TNF-a的影響.PBMC用一種AS轉(zhuǎn)染，PDE3BAS:Top-1360(Seq.IDNo.19)=3B;PDE4BASTop-1437(Seq.IDNo.28)=4B;PDE4DASTop-1498(seq.IDNo.36)=4D;PDE4AASTop-1413(Seq.IDNo.23)=4A.PBMC還用兩種AS的組合轉(zhuǎn)染，3B/4B=Top-1360(Seq.IDNo.19)+Top-1437(Seq.IDNo.28);3B/4D=Top-1360(Seq.IDNo.19)+Top-1498(seq.IDNo.36);4A/4D-Top-1413(Seq.IDNo.23)+Top-1498(seq.IDNo.36);4B/4D=Top-1437(Seq.IDNo.28)+Top-1498(seq.IDNo.36).錯配AS(3Bmi、4Ami、4Bmi和4Dmi)也包括在該研究中.PHA攻擊但未轉(zhuǎn)染的PBMC被當(dāng)作對照.困12表示靶向PDE4B和PDE7A的組合反義處理的多靶抑制和旌^效應(yīng).小鼠(每組8只)經(jīng)鼻滴注50mgTop-2437(把向PDE4B)、50mgTop-2713(把向PDE7A)或兩種反義物(每種50mg)的組合.對照小鼠接受相同量的對照反義寡核苷酸.滴注后16小時，實時PCR分析(A)PDE4B、(B)PDE7A和(C)PDE4A表達，用HPRT(參考基因)校正.數(shù)據(jù)代表每只小鼠PDE4B表達、PDE7A表達和PDE4A表達的抑制％.條代表平均抑制％;困13表示把向PDE4BmRNA的寡核普酸對LPS誘導(dǎo)的肺炎癥和PDEmRNA表達的特異性抑制作用.A)抑制PDE4B對PDE的其它mRNA表達的影響.暴露于LPS后6小時，用實時PCR評價TOP2430處理小鼠中不同PDEmRNA的表達水平.通過比較所得表達水平與接受對照反義寡核苷酸的小鼠中測量的表達水平，確定抑制％.所示值代表平均值+ASD(n-8-9).B)用TOP2430預(yù)處理的暴露于LPS的小鼠的肺中細(xì)胞流入的抑制.暴露于LPS后6小時進行BAL細(xì)胞的差異細(xì)胞計數(shù).所示值代表平均值+Z-SD(n-8-9).C)TNF-a釋放在BAL中的作用.用ELISA測量TOP2430處理的小鼠中TNF-a釋放，并通過比較TOP2430后所得TNF-a值與用對照反義寡核苷酸處理小鼠中所得值確定抑制°/。.圖14表示把向小鼠PDE4BmRNA的反義寡核苷酸的特異性抑制對香煙誘導(dǎo)的肺炎癥的影響.A)香煙暴露后24小時和48小時的支氣管肺泡灌洗細(xì)胞計數(shù).值是平均值+Z-SD.PMN-嗜中性粒細(xì)胞；AM=巨噬細(xì)胞.B)暴露于香煙的小鼠的肺組織中TNF-amRNA表達.通過從暴露于香煙后48小時的全肺分離的RNA制備的cDNA進行實時PCR來評價TNF-amRNA表達水平(3只小鼠).對照小鼠偽吸煙(5只小鼠).值是相對于HPRT的TNF-a表達的平均值+Z-SD.C)用TOP2430(4只小鼠)或?qū)φ辗戳x(5只小鼠)預(yù)處理并暴露于香煙3小時后的小鼠中的TNF-a和PDE4BmRNA表達.通過從暴露于香煙后48小時的全肺分離的RNA制備的cDNA進行實時PCR來評價TNF-a和PDE4BmRNA表達水平.值是相對于HPRT的TNF-a或PDE4B表達的平均值+Z-SD.附表說明表la鑒定根據(jù)本發(fā)明的人PDE7A寡核苷酸反義物；14表lb鑒定根據(jù)本發(fā)明的人PDE3A寡核苷酸反義物；表lc鑒定根據(jù)本發(fā)明的人PDE3B寡核苷酸反義物；表Id鑒定根據(jù)本發(fā)明的人PDE4A寡核苷酸反義物；表le鑒定根據(jù)本發(fā)明的人PDE4B寡核苷酸反義物；表lf鑒定根據(jù)本發(fā)明的人PDE4D寡核苷酸反義物；表2a和2b表示用于標(biāo)準(zhǔn)PCR的人寡核苷酸引物；表2c表示用于實時PCR的人寡核苷酸引物；表2d表示用于實時PCR的小鼠寡核苷酸引物；表3a和3b表示在細(xì)胞系、原代細(xì)胞和組織中的人PDE表達模式；表4a表示在A549細(xì)胞系和人PBMC中初步篩選人PDE寡核苷酸反義物的總結(jié)；表4b表示具有多基因敲除作用的人PDE單種反義物；和表5表示體內(nèi)初步篩選小鼠PDE寡核苷酸反義物.具體實施例方式本發(fā)明涉及用于治療與細(xì)胞cAMP降低相關(guān)的疾病和/或與至少一種PDE水平升高相關(guān)的疾病的基于反義寡核苷酸的化合物、治療組合物和方法.本發(fā)明目的是增加細(xì)胞中的cAMP水平，同時降低促炎癥介質(zhì)的水平以及由炎癥細(xì)胞釋放的醉的水平.為獲得這些作用，在其中一個方面，本發(fā)明利用本文中被稱為"多基因敲除(knockdown)"的技術(shù).多基因敲除是指通過根據(jù)本發(fā)明的不僅下調(diào)其所抗的同工醉基因而且下調(diào)相關(guān)基因的單種反義寡核苷酸化合物，或通過分別下調(diào)不同同工酶基因的至少兩種反義寡核苷酸化合物，而抑制或下調(diào)多個基因.與細(xì)胞cAMP水平降低相關(guān)的疾病包括至少一種cAMP特異性PDE的水平增加的疾病(即PDE相關(guān)疾病).術(shù)語"下調(diào)"在本文中用于表示至少部分抑制基罔的表達.根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸化合物下調(diào)或抑制其所針對的基因，即反義寡核苷酸化合物表現(xiàn)出足以引起抑制的序列互補性的基因.術(shù)語"相關(guān)基因"表示也可在與細(xì)胞cAMP降低和/或至少一種PDE水平增加的相關(guān)疾病的病理生理中起作用、但不與所述寡核苷酸反義化合物全部或部分互補的其它基閎.這些基閎包括但不限于編碼PDE15酶或同種型、介質(zhì)例如細(xì)胞因子和趨化因子的基因和編碼醉的基因.介質(zhì)的實例包括1L"6、IL-7、IL-8、IL-15和TNFa.合適的酶的實例包括但不限于基質(zhì)金屬蛋白醃(MMP)、如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12,根據(jù)本發(fā)明，本文中反義寡核苷酸化合物定義為天然存在或修飾的寡核苷酸，優(yōu)選抗核酸酶，它們表現(xiàn)出與編碼特定把蛋白的DNA或mRNA互補性，使得它們能干擾所述mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯和/或誘導(dǎo)RNA醃或RNA醉樣活性并因此具有降低所述靶蛋白表達的功能.當(dāng)寡核苷酸化合物與靶DNA或mRNA雜交從而干擾/防止其轉(zhuǎn)錄/翻譯時，所述靶蛋白的表達被降低.因此，此處的寡核苷酸化合物必須與所針對的核酸足夠互補以便與之雜交.因此，盡管在最優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸化合物與所針對的核酸100%互補，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，100°/?；パa對于在寡核苷酸化合物與所針對核酸之間發(fā)生雜交是不必要的.本發(fā)明還涉及對反義寡核苷酸的修飾，該修飾不顯著不利影響其降低或抑制靶蛋白的表達的活性，但修飾還可能增強這種活性.術(shù)語"核酸"和"核酸分子"可以互換使用，表示含核苷酸即核糖核苷酸、脫氣核糖核苷酸或兩者都含的分子.該術(shù)語包括核糖核苷酸和脫氣核糖核苷酸的單體和多聚物，其中在多聚物中核糖核苷酸和/或脫氣核糖核苷酸經(jīng)5，-3，連接而互相連接在一起.然而連接可以包括核酸合成領(lǐng)域已知的任何連接，包括例如含5，-2，連接的核酸.用于核酸分子的核苷酸可以是天然存在的、或者可以是能與天然存在堿基對形成堿基配對關(guān)系的合成產(chǎn)生的類似物.能形成堿基配對關(guān)系的非天然存在堿基的實例包括但不限于氮雜和脫氮嘧啶類似物、氮雜和脫氣嘌呤類似物、和其它雜環(huán)堿基類似物，其中嘌呤和嘧啶環(huán)的碳原子和氮原子的一個或多個已經(jīng)被雜原子如氣、硤、硒、磷等取代.本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還可以通過插入或去除1或多個堿基進行修飾而不對其活性有顯著不利的影響.特別地，一般能在表現(xiàn)出與所針對的基因100%互補性的寡核苷酸的末端添加或去除堿基而不顯著喪失抑制活性.可以進行這樣的修飾以增加活性或提供寡核苷酸增強的穩(wěn)定性.此外，也可以替換本發(fā)明反義寡核普酸化合物中的1或多個堿基而不對其活性有不利影響，例如，用一種嘌呤替換另一種嚷呤(腺嚷呤、烏^呤)和用嘧啶替換嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶).根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括siRNA(小干擾RNA)和由于RNAi(RNA干擾)方法含有它們的RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物).RNA干擾(RNAi)方法最近已經(jīng)描迷，被認(rèn)為是抑制靶基因表達的新工具.多年前已知，RNAi基于低等真核生物中的古老的抗病毒防御機制.它被雙鏈RNA謙導(dǎo)，雙鏈RNA被加工成21-23nt的小干擾RNA(siRNA),在RISC復(fù)合物幫助下與單鏈形式把mRNA雜交以后將引起同源的內(nèi)源mRNA降解.RNAi的工作方式仍未完全闡明，但在廣泛的真核生物如線蟲、掩、植物、真菌和哺乳動物中，它已經(jīng)被用作產(chǎn)生功能喪失表型的首選方法.根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括核酶和單鏈或雙鏈的、RNA或DNA的短核苷酸序列，其中可以摻入上述化學(xué)修飾，并能體外和/或體內(nèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯.在一個方面，不結(jié)合具體作用模式，本發(fā)明的組合物和方法似乎通過已被稱為"多基因敲除"的機制起作用.多基因敲除在本發(fā)明中表示1)不僅下調(diào)所針對的基因而且下調(diào)其它相關(guān)基因的反義寡核苷酸化合物；和2)至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合，其中每種能下調(diào)基因，每一種的濃度使得所述反義寡褲苷酸化合物單獨使用時實際上對下調(diào)其針對的基因無效，所述組合導(dǎo)致反義寡核苷酸所針對的兩種基因都顯著下調(diào)并還可以下調(diào)其它相關(guān)基因.在一個方面，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防與細(xì)胞cAMP降低和/或至少一種PDE水平增加相關(guān)疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥物接受的栽體和至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種寡核苷酸化合物針對編碼PDE的靶基因的至少一部分的不同，每種寡核苷酸化合物能下調(diào)所抗把基因，每種寡核苷酸化合物的存在濃度使得它表現(xiàn)出對靶PDE基因的小于20%的抑制，而所述組合表現(xiàn)出大于20%的押制并且對至少一種把基因和任選對其它相關(guān)基因的抑制至少加倍.本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道，很低濃度的根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸化合物的組合，例如表現(xiàn)出對靶PDE基因的小于1%抑制的濃度，不能組合表現(xiàn)出至少20%的抑制.能被用于形成根據(jù)本發(fā)明的組合的每種寡核苷酸化合物的最低濃度將變化，并且這種濃度可以是實現(xiàn)0.5%抑制的濃度或者實現(xiàn)1%-5%抑制的濃度.本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防與細(xì)胞cAMP降低和/或至少一種PDE水平增加相關(guān)疾病的葯物組合物，所迷組合物包含葯物接受的栽體和至少兩種反義寡核苷酸化合物，其中每種寡核苷酸化合物能下調(diào)不同靶基因，所述寡核苷酸的至少一種的濃度使得其自身實際上無效，例如表現(xiàn)出對靶基因的小于20%抑制，而所述寡核苷酸的組合表現(xiàn)出大于20%的抑制并且對至少一種靶基因和任選對其它相關(guān)基因的抑制至少加倍.本發(fā)明還提供至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合用于治療和/或預(yù)防與細(xì)胞cAMP降低相關(guān)的疾病如呼吸道炎癥疾病的用途，其中每種寡核苷酸化合物針對編碼不同PDE同種型的基因，每種寡核苷酸化合物能下調(diào)所針對的基因，所述寡核苷酸化合物的濃度使得每種寡核苷酸單獨使用實際上不能有效下調(diào)所針對基因，而至少兩種寡核苷酸化合物的組合能有效下調(diào)寡核苷酸化合物所針對基因的至少一個和任選下調(diào)其它相關(guān)基因.本發(fā)明還提供治療和/或預(yù)防與細(xì)胞cAMP降低相關(guān)的疾病如呼吸道炎癥疾病的方法，所述方法包含向?qū)ο笫┯弥辽賰煞N反義寡核苷酸化合物，每種能下調(diào)不同的靶PDE基因，所述寡核苷酸化合物的施用濃度使得每種寡核苷酸化合物單獨使用時實際上不能有效下調(diào)其靶基因，例如表現(xiàn)出小于20%抑制靶基因的濃度，而所迷寡核苷酸化合物的組合能有效下調(diào)寡核苷酸化合物所針對基因的至少一個和任選下調(diào)其它相關(guān)基因.本發(fā)明還提供上述藥物組合物用于制造藥物的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防與細(xì)胞cAMP降低或cAMP特異性PDE水平增加相關(guān)的疾病(PDE相關(guān)疾病)，如炎性疾病.本發(fā)明方法和組合物所針對的炎性疾病一般定義為存在炎癥細(xì)胞和/或介質(zhì)的疾病.炎性疾病的實例包括但不限于多發(fā)性硬化，接觸皮炎、變應(yīng)性和非變應(yīng)性眼病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、骨質(zhì)疏松癥和認(rèn)知陣礙.本發(fā)明方法和組合物所針對的炎性呼吸系統(tǒng)疾病一般定義為存在炎癥細(xì)胞和介質(zhì)的呼吸道和肺的疾病.炎性呼吸系統(tǒng)疾病的實例包括但不限于COPD、譯喘、嗜酸性粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、急性和慢性肺異體移植排斥、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎和券竇炎.本發(fā)明還提供上述藥物組合物用于制造藥物的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防生理病理中涉及環(huán)AMP降低的疾病.本發(fā)明還提供修飾反義寡核苷酸的方法，使得它可以達到靶核苷酸和/或可以更有效抗靶基因而用于治療和/或預(yù)防炎性呼吸系統(tǒng)疾病.本發(fā)明還提供制刑，其中包括上述組合物，所述制刑是全身性和/或局部制刑.本發(fā)明還提供將藥物組合物遞送至靶多核苷酸的體內(nèi)方法，包括向?qū)ο笫┯蒙鲜鼋M合物和允許組合物達到靶基因的表面活性劑的組合.優(yōu)選地，可用本發(fā)明反義寡核普酸化合物治療的對象或患者包括但不限于無脊推動物、脊推動物、鳥、哺乳動物如豬、山羊、綿羊、牛、狗、貓、和尤其是人.根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸化合物設(shè)計成適用于待治療的具體動物.特別地，反義寡核苷酸化合物的序列將隨待治療對象根據(jù)物種基因組間差異而變化.本發(fā)明還提供有效抗PDE家族的蘇例如能抑制其表達的反義寡核苷酸，所述PDE家族的醉包括但不限于PDE3、PDE4和PDE7.本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道，每種PDE亞型還可以包括同種型.例如PDE3亞型包括PDE3A和PDE3B同種型；PDE4亞型包括同種型PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D;PDE7亞型包括同種型PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3和PDE7B.本文中術(shù)語"反義寡核苷酸化合物實際上無效的濃度"涉及每種寡核苦酸化合物的使用，當(dāng)單獨使用時在這種濃度下實際上未觀察到寡核苷酸所針對基因的下調(diào)(在表現(xiàn)出把基因小于20%抑制的濃度).這是與根據(jù)本發(fā)明的至少兩種寡核苷酸化合物的組合的作用進行對比，對于組合，每種以它們單獨存在不能有效下調(diào)它們所針對的基因的濃度存在時(在表現(xiàn)出低于20%抑制的濃度)，這種組合表現(xiàn)出大于20%抑制，并且對寡核苷酸化合物所針對的基因的至少一種的抑制效果至少加倍.單種寡核苷酸有效性的比較舉例說明于但不限于圖13和14和表4b和5.例如在困13A中，針對小鼠PDE4B的TOP2430(SeqIDNo.135)體內(nèi)抑制PDE4A、4B、4D和7A,但對PDE3B沒有影響.至少兩種寡核苷酸化合物的組合的有效性的比較舉例說明于但不限于困9、10、11和12.例如與單獨使用時每種寡核苦酸對PDE3A或PDE7A表達的影響進行比較，困9中Top-1703(SeqIDNo.2)和Top-1301(SeqIDNo.lO)或Top-1706(SeqIDNo.3)和Top-1303(SeqIDNo.12)的組合對同時降低PDE3A和PDE7A表達方面表現(xiàn)出有更大影響.與單獨使用時每種寡核苷酸對TNFa表達的影響進行比較，困11中Top-1360(SeqIDNo.19)和Top-1437(SeqIDNo.28)或Top-1360(SeqIDNo.19)和Top-1498(SeqIDNo.36)或Top-1413(SeqIDNo.23)和Top-1498(SeqIDNo.36)或Top-1437(SeqIDNo.28)和Top-1498(SeqIDNo.36)的組合對降低人PBMC中TNFa表達和釋放表現(xiàn)出有更大影響.與低濃度下單獨使用時每種寡核苷酸對PDE4B或PDE7A表達的影響進行比較，困12中，小鼠體內(nèi)經(jīng)鼻滴注Top-2437(PDE4B)(SeqIDNo.141)和Top2713(PDE7A)(SeqIDNo.149)的組合表現(xiàn)出對同時降低小鼠PDE4B和PDE7A表達有更大影響.反義寡核苷酸化合物的很多組合可根據(jù)本發(fā)明使用，所述組合導(dǎo)致上述的多基因敲除.反義寡核苷酸組合的實例包括但不限于針對PDE3的至少一種寡核苷酸化合物與針對PDE7的至少一種寡核苷酸化合物.組合的替代性實例可以包括針對PDE4的至少一種寡核苷酸和針對PDE7的至少一種寡核普酸.組合的替代性實例可以包括針對PDE3的至少一種寡核苷酸、針對PDE4的至少一種寡核苷酸和針對PDE7的至少一種寡核苷酸.這樣的反義寡核苷酸化合物可以選自但不限于表la-f提供的寡核苷酸.本文中術(shù)語"寡核苷酸"表示含約1到約100個核苷酸的核酸分子，更優(yōu)選1到80個核苷酸，甚至更優(yōu)選約4到約35個核苷酸.術(shù)語"寡核苷酸"還包括修飾的寡核苷酸和上迷寡核苷酸化合物.本文所用術(shù)語"修飾的寡核苷酸"和"修飾的核酸分子"表示核酸，包括寡核苷酸，其中在所有或任意的核酸械基、糖部分、核苷間磷酸鍵的天然分子結(jié)構(gòu)的分子水平上具有一或多個化學(xué)修飾，以及還具有附加取代基的分子，所述附加取代基如二胺、膽甾基或其它親脂性基團，或在這些位點的修飾的組合.核苷間膦酸醋鍵可以是褲酸二酯、蜂酸三癍、氨基碑酸醋、硅氣坑、碳酸酯、羧甲酯、acetamidate、20氨基甲酸酯、硤醚、橋聯(lián)phosphoranidate、橋聯(lián)亞甲基麟酸酯、疏代砩酸酯(pbosphorothioate)、甲基膊酸醋、二硫代褲酸酯、橋聯(lián)疏代磷酸醋和/或砜核苷間鍵，或3，-3，、2，-5，或5，-5，鍵，和這些相似鍵的組合(產(chǎn)生混合主鏈修飾的寡核苷酸).修飾可以在內(nèi)部(單個或重復(fù))或在寡核苷酸分子的末端，并且可以包括加到核普間碑酸醋鍵的分子上，如膽甾基、在氨基之間具有不同數(shù)目破殘基的二胺化合物和末端核糖、脫氣核糖和褲酸醋修飾，所述修飾切割或交聯(lián)到相對鏈或締合的酶或其它蛋白.親電基團如核糖二醛可以與這種蛋白的賴氨酰殘基的E-氨基共價連接.親核基團如連接到寡聚物上的n-乙基馬來耽亞胺可以共價結(jié)合到mRNA的5，端或另一個親電位點.術(shù)語修飾的寡核苷酸還包括在糖部分上含有修飾如2，-取代的核糖核苷酸的寡核苷酸或脫氣核糖核苷酸單體，其中任何一個通過5，-3，鍵而連接在一起.修飾的寡核苷酸還可以包括PNA或嗎啉代修飾的主鏈，其中序列的靶特異性被維持.任選地，此處描述的寡核苷酸可以與多種生理栽體分子一起配制.此處描述的寡核普酸還可以與增強其進入靶細(xì)胞能力的分子復(fù)合.這種分子的實例包括但不限于破水化合物、多胺、氨基酸、肽、脂、和細(xì)胞生長的關(guān)鍵分子.例如寡核苷酸可以與脂組合，所得寡核苷酸/脂乳液或脂質(zhì)體懸液可以有效增加寡核苷酸的體內(nèi)半衰期.作為替代，針對PDE靶的寡核苷酸還可以被質(zhì)子化/酸化，起磷酸二醋醉抑制刑和抗菌刑的雙重作用.因此，本發(fā)明的另一個實施方案是使用調(diào)節(jié)PDE的治療性寡核苷酸，該寡核苷酸還可以被質(zhì)子化/酸化以增加細(xì)胞吸收，在脂質(zhì)體中改善包泉，使得它還可以用作抗生素.另外，寡核苷酸可以與多種公知化合物和結(jié)構(gòu)復(fù)合，例如進一步增強寡核苷酸的體內(nèi)穩(wěn)定性，或者增強其藥理性質(zhì)(如增加體內(nèi)半衰期、降低毒性等).本文所用術(shù)語"核酸主鏈"表示連接分子中核苷酸的化學(xué)部分.這可以包括由任囊和所有方式的化學(xué)連接核苷酸形成的結(jié)構(gòu).本文所用修飾的主鏈包括核苷酸間化學(xué)鍵的修飾，以及可用于增強穗定性和親合性的其它修飾，如糖結(jié)構(gòu)的修飾.例如可以使用脫氧核糖的a卜異頭物，其中堿基相對于天然W-異頭物是反向的.在一個優(yōu)選實施方案中，糖基的2，-OH可以改變成2，-0-烷基或2，-0-烷基-n(O-坑基)，21它們提供對降解的抗性而不影響親合性.術(shù)語"酸化"和"質(zhì)子化/酸化"在本文可以互換使用，表示質(zhì)子(或正氫離子)加到核酸上質(zhì)子接受位點的過程.質(zhì)子接受位點包括核酸堿基結(jié)構(gòu)上的氨基和磷酸二酯鍵的褲酸癍.當(dāng)pH降低時，這些接受位點被質(zhì)子化的數(shù)目增加，導(dǎo)致更高質(zhì)子化/酸化的核酸.術(shù)語"質(zhì)子化/酸化的核酸"表示一種核酸，當(dāng)它以約16A260/ml的濃度溶解于水中時具有低于生理pH的pH,即低于約pH7.修飾的核酸、核酸醉抗性核酸、和反義核酸都可以被這個定義包括.通常，通過將質(zhì)子加到核酸的活性位點上而使核酸被質(zhì)子化/酸化，盡管降低核酸pH的其它修飾也可以使用并且也被該術(shù)語包括.本文所用術(shù)語"封端的"表示在分子水平具有化學(xué)修飾的核酸，這種修飾防止選定核苷酸例如通過核酸醉作用而降解.這種化學(xué)修飾的定位使得它保護核酸的整體部分，例如反義寡核苷酸的編碼區(qū).封端可以是3，封端或5，封端.例如，3，封端可以在分子的最3，的位置，或者如果它是核酸整體序列的3，則可以在3，端的內(nèi)部.術(shù)語"基本抗核酸醉的"表示與天然存在或未修飾核酸比較，抗核酸酶降解的核酸.本發(fā)明的修飾核酸至少有超過對應(yīng)未修飾核酸1.25倍的核酸酶降解抗性，更優(yōu)選超過對應(yīng)未修飾核酸至少2倍的抗性，甚至更優(yōu)選超過至少5倍的抗性，最優(yōu)選超過至少IO倍的抗性.這種基本抗核酸醉的核酸包括但不限于具有修飾主鏈的核酸，所述修飾主鏈如硤代磷酸酯、甲基聘酸酯、乙基磷酸三醋、2，-0-甲基硤代磷酸酴、2，-0-甲基-p-乙氣基核糖核苷酸、2，-0-烷基、2，-0-烷基-n(O-烷基)、3，-0-烷基、3，-0-烷基-n(O-烷基)、2，-象、2，-脫氣-赤辟戊呋喃糖基、2，-0-甲基核糖核苷、氨基甲酸甲B&、破酸甲醋、反向堿基(如反向T)、或這些主鏈的嵌合形式.本文所用術(shù)語"基本抗酸的"表示與未修飾核酸比較，抗酸降解的核酸.典型地通過比較抗性核酸的降解百分率與對應(yīng)未修飾核酸(即具有"正常"主鏈、械基和礴酸二醋鍵的相對應(yīng)核酸)的降解百分率來測量核酸的相對抗酸性.抗酸性核酸優(yōu)選至少有超過對應(yīng)未修飾核酸1.5倍的酸降解抗性，超過至少2倍的抗性，甚至更優(yōu)選超過至少5倍的抗性，最優(yōu)選超過至少IO倍的抗性.本文所用術(shù)語"PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B寡核苷酸"各自表示分別靶向影響PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B表達或活性的序列的寡核苷酸.這些包括但不限于PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA編碼序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA啟動子序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA增強子序列、編碼PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B的邁RNA等.如上討論，本發(fā)明的一個實施方案提供靶向影響PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7A表達或活性的序列的反義寡核苷酸.在一個實施方案中，反義寡核苷酸可以有^a^iL所示序列之一.在另一個實施方案中，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，反義寡核苷酸可以包含這些序列的片段或變體，它們可以改變寡核苷酸組成和/或長度，但維持或增加寡核苷酸下調(diào)基因表達的活性.在另一個實施方案中，本發(fā)明提供具有4i^L所示序列的至少兩種反義寡核苷酸的組合.本文所用術(shù)語"處理"、"治療"等一般表示獲得期望藥理和/或生理作用.這種作用可以是預(yù)陣性的，即完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病和/或減輕疾病引起的不利作用.本文所用"處理"涵蓋對已經(jīng)定義的對象中疾病的任何處理，所述對象尤其是人，并包括(a)預(yù)防對象發(fā)生疾病，所述對象容易發(fā)生該疾病但仍未診斷為具有疾??；(b)抑制疾病，即停止其發(fā)展；或(c)緩解疾病，即引起疾病消退.術(shù)語"藥學(xué)可接受的"在本文中用于栽體、表面活性劑和組合物時表示可接受用于治療患者對象的物質(zhì)，所述物質(zhì)無毒或?qū)τ诒疚乃鋈魏瓮緩浇o藥不是不可接受的.本發(fā)明一般針對通過施用根據(jù)本發(fā)明的治療有效量的反義寡核苷酸化合物而治療對象，所述化合物包括siRNA、核醉、單或雙鏈的短核苷酸序列，包括可以與靶核酸互補的RNA和/或DNA，或者可以任選地經(jīng)上述修飾，具有所述RNA寡核普酸的至少一部分的RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸能與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體，23或嵌合寡核苷酸，它們將下調(diào)或抑制內(nèi)源性基因的體內(nèi)表達."治療有效量"意思是指無毒性但足以提供期望治療效果的反義寡核苷酸化合物的重.在此情況下，反義寡核苷酸的這種劑量有效緩解、改善、或預(yù)防待治療狀況或疾病的癥狀，如與細(xì)胞cAMP降低相關(guān)的疾病，PDE相關(guān)疾病、炎性疾病如炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病.本文提供的藥物組合物包含上述反義寡核苷酸和一種或多種葯學(xué)可接受的表面活性刑.增強本發(fā)明反義寡核苷酸吸收的合適的表面活性刑或表面活性刑成分之前e;經(jīng)在美國申請公開2003/0087845中描述，該申請公開的關(guān)于表面活性刑的內(nèi)容并入本文.該申請?zhí)岢龊线m的表面活性刑"…包括合成和天然、以及全長和截短形式的表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、表面活性蛋白E、二飽和磷脂耽膽堿(除了二棕櫚耽以外)、二棕櫚酰碑脂酰膽堿、褲脂酰膽堿、褲脂跣甘油、褲脂耽肌酵、磷脂酰乙醇胺、砩脂耽絲氨酸、褲脂酸、泛醒、溶血褲脂觥乙醇胺、溶血鱗脂跌膽堿、棕櫚酰溶血褲脂酰膽堿、脫氣表雄酮、多碎醇、sulfatidicacid、甘油-3-磷酸、磷酸二鞋基丙嗣、甘油、甘油-3-磷酸膽堿、二幾基丙新、棕櫚酸、胞嘧咬二褲酸(CDP)二?；视?、CDP膽械、膽堿、褲酸膽械，以及天然和人工片狀體，它們是以下表面活性刑成分的天然栽體介質(zhì)(D-3脂肪酸、天然栽體、多烯酸(polyenicacid)、多烯酸(polyenoicacid)、卵砩脂、棕櫚酸、環(huán)氣乙烷或環(huán)氣丙烷的非離子性嵌段共聚物、單體和多聚體形式的聚丙埤、單體和多聚體形式的聚環(huán)氣乙坑、具有右旋糖苷和/或烷?；鶄?cè)鏈的聚(乙烯胺)、Brij35、TritonX-100和合成表面活性刑ALEC、Exosurf、Survan和Atovaquone等.這些表面活性劑可以單獨或作為制刑中多組分表面活性刑的一部分使用，或共價鍵合到反義寡核苷酸(oligo)的5，和/或3，端.本發(fā)明組合物的反義組分包括至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合，可以在脂顆?；蛸x形刑如脂質(zhì)體或微晶中包含于藥物制刑中.美國專利6，025，339中描述，脂顆?？梢允侨魏魏线m的結(jié)構(gòu)，如單層或多層，只要所述反義寡核苷酸包含于其中.帶正電的脂質(zhì)如N-ll-(2，3-二油耽氧)丙基卜N，N，N-三甲基-氨基甲磺酸酯，或"DOTAP"，對于這樣的顆粒和賦形刑是特別優(yōu)選的.這種脂顆粒的制刑是公知的.如見Janoff等人的U.S.Pat.No，4，880，635;Kurono等人的4,906,477;Wallach的4,911,928;Wallach的4,917,951;Allen等人的4,920,016;Wheatley等人的4，921，757;等.本發(fā)明的組合物可以用運輸反義寡核苷酸化合物到期望部位如肺的任何方式施用.本文公開的反義化合物可以用任何合適的方式施用到患者的肺，但優(yōu)選氣溶膠吸入方式施用，其中包含可呼吸顆粒，所述可呼吸顆粒包含反義化合物.本發(fā)明的組合物可以作為包括可呼吸大小的顆粒的制刑施用于呼吸系統(tǒng)，例如顆粒大小小到足以經(jīng)吸入通過鼻、口和咽喉并穿過支氣管和肺泡.一般來說，可呼吸類粒大小范圍在約0.5到IO微米之間.氣溶膠中不可呼吸大小的顆粒傾向于沉積在咽喉并被呑咽，因此氣溶膠中不可呼吸顆粒的量優(yōu)選最少化.對于經(jīng)鼻施用，優(yōu)選10-500徵米范圍的顆粒大小以確保保留在鼻腔中.可以通過將反義化合物與合適的栽體如無菌無熱源水或褲酸鹽緩沖液制備用于產(chǎn)生氣溶膠的活性化合物(反義寡核苷酸化合物)的液體藥物組合物.含反義化合物的固體顆粒組合物任選地可以含有用于輔助形成氣溶膠的分散刑以及其它治療性化合物.合適的分散刑是乳糖，它可以與反義化合物以任意合適的比例混合，如l:l的重重比.反義組合物可以施用抗支氣管收縮、抗變態(tài)反應(yīng)和/或抗炎有效的量，施用量依賴于待治療疾病的程度、患者對象的狀況、具體制刑、給藥途徑、向?qū)ο蠼o藥的時間安排等.一般來說，寡核普酸的細(xì)胞內(nèi)濃度期望是0.05-50^M,或更具體的0.2-5對于向哺乳動物患者如人施用，典型使用約0.001、0,01、0.1、或1mg/kg直至約50、或100mg/kg或更多的刑量.然而其它刑量也包括在內(nèi)，根據(jù)活性化合物在任何具體制刑中的溶解性，每日刑量可以分成一個或幾個單位劑量施用.含反義化合物的液體顆粒的氣溶膠可以通過任意合適的手段產(chǎn)生，如用噴霧器.噴霧器是經(jīng)壓縮氣體通常是空氣或氣氣加速、通過狹窄的文丘里噴嘴或者經(jīng)超聲激發(fā)的方式，將活性成分的溶液或懸液轉(zhuǎn)化成治療性氣溶膠霧的商品裝置.用于噴霧器的合適制刑包含在液體栽體中的活性反義寡核苷酸成分，其重最高可達制刑的40%w/w優(yōu)選少于20。/。w/w.栽體典型是水或稀的水性醇溶液，優(yōu)選通過加入例如氦化鈉而與體液等滲.任選的添加刑包括，如果制刑不是無菌制備時的防腐刑，例如羥基苯甲酸甲酯，抗氧化刑、抗細(xì)菌刑、調(diào)味劑、揮發(fā)性油、緩沖刑和乳化刑和其它制刑表面活性刑.包含活性寡核苷酸化合物和制藥接受表面活性刑的固體顆粒的氣溶膠還可以用任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生.用于向?qū)ο笫┯霉腆w顆粒藥物的氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生可呼吸的顆粒(解釋如上)，并以適于人給藥的速羋產(chǎn)生一定體積的氣溶膠，其中含預(yù)定計量的藥物刑量.活性寡核苷酸成分典型地占制劑的0.1-100w/w.笫二種類型的示例性氣溶膠發(fā)生器包括計重刑重吸入器.計量刑量吸入器是加壓氣溶膠分散器，典型地在液化推進刑中含有活性成分的懸液或溶液制刑.使用時這些裝置通過適用于遞送計重體積的閥門釋放制刑，典型地10-150nl，以產(chǎn)生含活性成分的細(xì)顆粒噴霧.合適的推進刑包括某些氯象碳化合物，例如二氟二象甲坑、三氣氣甲烷、二氣四象乙烷或氫象烷及其混合物.制刑還可以含有一種或多種助溶刑如乙醇，乳化刑和其它制刑表面活性刑如油酸或失水山梨醇三油酸醋，抗氧化刑和合適的調(diào)味刑.無論是從固體還是液體顆粒形成，可以約1-150升/分鐘的速率經(jīng)氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生氣溶膠.本發(fā)明的制刑可以是口服、頰內(nèi)、肺內(nèi)、直腸、子宮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、顱內(nèi)、經(jīng)鼻、肌內(nèi)、皮下、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、可吸入、透皮、皮內(nèi)、腔內(nèi)、可植入、離子電滲、經(jīng)眼、陰道、關(guān)節(jié)內(nèi)、經(jīng)耳、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腺體內(nèi)、器官內(nèi)、淋巴內(nèi)、可植入、緩釋、和腸溶包衣制刑.用于制劑的栽體可以是例如固體和/或液體栽體.對于適于與本發(fā)明的寡核苷酸化合物一起組合以提供適于施用于治療呼吸系統(tǒng)疾病的組合物/制刑的其它栽體，可以參考"Remington，sPharmaceuticalSciences"，17thEd.MackPublishingCompany,Easton，Pa.，1985.在本發(fā)明的另一方面，提供制品，它包括包裝材料，包裝材料內(nèi)含有藥學(xué)可接受的反義寡核苷酸組合物，可有效治療與細(xì)胞cAMP降低或PDE水平增加相關(guān)的狀況，包括炎癥疾病.在一個實施方案中，組合物包含可有效抑制PDE基因的反義寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物與該基因至少50%互補.在另一方面，組合物包含至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核普酸化合物能下調(diào)不同的PDE基閎，每種反義寡核苷酸化合物的存在濃度使得反義寡核苷酸化合物單獨使用時實際上不能有效下調(diào)所針對基因，而反義寡核苷酸化合物的組合可以有效下調(diào)反義寡核苷酸所針對基因的至少一種.在一個實施方案中，制品的包裝材料包含標(biāo)簽，它指示組合物能用于治療炎癥疾病并還可以包括適應(yīng)癥，該疾病是多發(fā)性硬化、接觸性皮炎、變應(yīng)性和非變應(yīng)性眼病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、骨質(zhì)疏松癥和認(rèn)知陣礙中的一種.在另一個實施方案中，制品的包裝材料包含標(biāo)簽，它指示組合物能用于治療炎性呼吸系統(tǒng)疾病，并還可以包括適應(yīng)癥，該疾病是COPD、哞喘、嗜酸性粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、急性和慢性肺異體移植排斥、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、鼻炎或鼻竇炎中的一種.對于本發(fā)明的目的，包裝材料可以是包裝根據(jù)本發(fā)明的含核苷酸的組合物的任何合適的材料，包括瓶或其它容器(塑料或玻璃)、紙盒、管、或其它保護性包裝材料.將會知道，包裝可以根據(jù)寡核苷酸組合物的性質(zhì)變化，例如液體制刑可以有不同于氣溶膠制刑的包裝.本發(fā)明用以下非限制性實施例進一步詳細(xì)說明.RPMI1640(Wisent，cat#10040CV);FBS(胎牛血清，Wisent,cat#80150);音審素，鏈審素(GIBCO，cat#15140-122);HEPES(Wisent，cat#26060Ci)和L"谷氨耽胺(Gibco,cat#25030-081);DMEM/F12(Wisent，cat#10090CV);丙稱酸鈉(Wisent，cat#25000-Ci);無菌PBS(GIBCO,cat#25030-081);狹蛋白醉0.25%和EDTA0.01%(Wisent，cat#25-052-Ci);Hanks平衡鹽溶液(HBSS)cellgro，cat#20021-cv;PHA(植物凝集素,Sigma,lo悄:073K8925)hEGF(人重組表皮生長因子，cat-4230;BPE:cloneticscat#4009;氬化可的松cloneticscat#4031;腎上腺素cloneticscat#4221;轉(zhuǎn)鐵蛋白cloneticscat#4205;狹為素cloneticsca悄4021;視黃酸cloneticscat糾085;三碘甲狀腺原氨酸cloneticscat#4211;慶大審素/兩性審素B:cloneticsca悄4081;人表皮生長因子(hEGF):cloneticscat#4230;狹島素，cat#cc-4021;hFGF(人成纖維細(xì)胞生長因子)cat#cc-4068;SmBmBullet試刑盒(Cat#CC3182，Clonetics),BEBMBullet試刑盒(Cat#CC4175，Clonetics);Trizol:Invitrogen,cat#15596-018DNA醃I:Fermentas,cat#EN0521;RT-PCR試刑盒的上標(biāo)第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen,cat#l1904-018);dNTPs:Invitrogen,cat#10297-018;27寡(dT)12.";Invitrogen,cat#l1904-018;QiagenRNAeasyMini試刑盒(Qiagen,Cat#74106);P-玟基乙醉(Sigma,Cat#M-6250);99%乙酵(CommercialalcoholsInc.，Brampton,Ontario,Canada);QiaVac24Manifold(Qiagen,Cat#19403);—次性真空連接器(Qiagen，Catl9407);DNA醉I試刑龕(Fermentas,Cat.#EN0521);RiboGreen定量試劑(Invitrogen-Molecularprobes,Cat#R-11490);TaqPCR核心試刑盒(Qiagen,Cat#201223),Light-CyclerInstrument1.5版(Roche,Cat#3531414);20ml反應(yīng)用LC毛細(xì)管(Roche,cat#1909339);LCFastStartDNAMasterSYBRGreen1PLUS(100ml)(Roche,Cat#03752186001);K3EDTA管(GreinerBio-one,cat#:455036B110306);Ficoll(AmershamBiosciences;cat#:17-1440-03);人TNF-otELISA試刑盒(BioSourceCat#CHC-1754，lo悄041703);小鼠TNF-otELISA試刑盒(BioSource，cat#cmc3013);ELISA讀板儀(濾光器450nm,參考濾光器650nm，Biorad,680型)；EscortII轉(zhuǎn)染試刑，(Sigma，cat#L6037),脂多糖(SIGMA-Aldrich;cat.#L-4391，lot#083K4048，E.Coli:011:B4);甲苯噻漆(Anased)，(Novopharm;catJ02239093;lotno.KA09802D);克他命(Vetalar)(Bioniche;catJ01989529;1otJK033A);Hema畫3染料組(FisherscientificCo.Cat#122-911，lot#999901);PoltronPT1200(BrinkmannInstruments);AlamarBlue,(Biosource，cat#DAL1100)，人肺總RNA,(BDBioscience,cat#64092-l，lot#4030253);人平滑肌總RNA，(BDBioscience,cat#cr2628，lot#3110321);人腦總RNA，(BDBioscience,cat#64098-l，lot#4010842),人支氣管平滑肌細(xì)胞(BSyC)(cat#CC2576);正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)(cat#CC2540)購自Clonetics.EOL-1(人急性骨絨"嗜酸性粒細(xì)胞性"白血病細(xì)胞系，ATCC)U937(人組織細(xì)胞細(xì)胞系；ATCC)，HL-60(人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系；ATCC);A549(人肺癌細(xì)胞系；ATCC);Jurkat(人急性T細(xì)胞白血病；ATCC)和Hut-78(人皮膚T淋巴細(xì)胞淋巴瘸細(xì)胞系；ATCC).NCI-H292(人粘膜表皮樣肺癌細(xì)胞系，ATCC);PBMC,(人外周血單核細(xì)胞).細(xì)胞培養(yǎng)EOL-l、U937、HL60、Jurkat和NCI-H292培養(yǎng)于RPMI1640中，其中含2mML-谷氨跣胺、1.5g/L碳酸氣鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHepes、lmM丙嗣酸鈉、10°/。FBS、青審素100U/mL、鏈審素100mcg/mLoHut78培養(yǎng)于Iscove，s改進的培養(yǎng)基中，其中含有4mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氬鈉、10%FBS、青審素100U/mL、鏈審素100mcg/mL.A549培養(yǎng)于Ham'sF12K中，其中含有2mML-谷氨耽胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10%FBS、青審素100、鏈審素100ng/邁L.支氣管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于含SmBm培養(yǎng)基的25cn^瓶中,所述培養(yǎng)基含有0.5jig/mLhEGF、25mg/ml慶大莓素、25叫/mL兩性審素B、2.5mg/mL狹為素、hEGF10ng/mL和FBS5%.細(xì)胞培養(yǎng)10天以獲得足夠每次試驗的細(xì)胞.正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)培養(yǎng)于含BEBM培養(yǎng)基的25cm2瓶中，所述培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基(500mL)和以下生長補充劑BPE:2mL、氛化可的*》0.5mL、hEGF:0.5mL、腎上腺素0.5mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5mL、胰烏素0.5mL、視黃酸0.5mL、三棟甲狀腺原氨酸0.5mL、GA-1000:0.5mL.細(xì)胞培養(yǎng)10天以獲得足夠每次試驗的細(xì)胞.細(xì)胞活力用AlamarBlue測試按制造商建議系統(tǒng)性測試細(xì)胞活力.人外周血單核細(xì)胞(PBMC)經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心來自正常供體的EDTAK3血而離PBMC.PBMC以2xl06細(xì)胞/mL/孔鋪板到含RPMI1640培養(yǎng)基的12孔板中，所述培養(yǎng)中還添加10%熱滅活FBS、青審素100U/mL、鏈審素100ng/mL.反義處理U937、EOL-l、Jurkat、Hut-78細(xì)胞系離心(5分鐘，1500RPM，室溫)收獲細(xì)胞，用lxHBSS洗滌并以lxl(^細(xì)胞/mL重懸于無血清RPMI培養(yǎng)基中.1"06細(xì)胞與精確濃度(0-2(HiM之間)的反義物在無菌微管中培養(yǎng)5分鐘.然后將每個反應(yīng)轉(zhuǎn)移到12孔板中并在371C培養(yǎng)5小時.RPMI/FBS20y。加到終濃度10%FBS,細(xì)胞在37t!過夜培養(yǎng).離心(5分鐘，1500RPM,室溫)收獲細(xì)胞并用lxHans平衡鹽溶液(HBSS)洗滌.A549細(xì)胞系(直接轉(zhuǎn)染)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白醉處理，重懸于DMEM-F12(106細(xì)胞/孔)中并在無血清條件下37t:培養(yǎng)過夜.笫二天貼壁細(xì)胞與不同濃度(0、5、10、15或20^M)的反義物直接在孔中一起37C培養(yǎng)5小時.DMEM-F12/FBS20。/。加到終濃度10。/。FBS，細(xì)胞在37t:過夜培養(yǎng).離心(5分鐘，1500RPM,室溫)收獲細(xì)胞并用lxHBSS洗滌.EscortII試劑介導(dǎo)的A549細(xì)胞系轉(zhuǎn)染A549以3x10s細(xì)胞/mL種植于12孔板中37C、5%C02下過夜.笫二天，用lxHBSS洗滌細(xì)胞兩次并用500pL無血清和抗生素的DMEM-F12復(fù)蓋.轉(zhuǎn)染復(fù)合物由1叫反義和2.5pLEscortII試刑組成.根據(jù)制造商推薦制備DNA-EseortII復(fù)合物并加入細(xì)胞中.BSMC和NHBE原代細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)胰蛋白醉(胰蛋白醉0.025%,EDTA0.01%)在37tJ處理3-5分鐘，用培養(yǎng)基終止反應(yīng)，細(xì)胞計數(shù)，以5xlOS細(xì)胞/mL重懸于12孔板中并在37t:培養(yǎng)(過夜).笫二天，洗滌細(xì)胞，改變培養(yǎng)基并用無血清培養(yǎng)基替換.反義物以不同濃度(0-20^M之間)直接加入孔中.混合物在371C培養(yǎng)5小時.加入血清至終濃度5。/。，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，用HBSS洗滌細(xì)胞3次，收獲，并挺取RNA.PBMC與濃度范圍0-5nM的反義物在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中按2xl06細(xì)胞/mL/孔一起培養(yǎng)16-20小時，培養(yǎng)基中還補充了5。/o熱滅活FBS、青審素100U/mL、鏈審素100jig/mL和10pg/mLPHA.回收細(xì)胞以后在制備RNA之前洗滌.RNA提取根據(jù)RNAeasymini試劑盒方法用Qiagen的QiaVac24多支管(manifold)從細(xì)胞沉淀中提取RNA并根據(jù)Fermentas程序用DNA睞I處理.根據(jù)制造商方案(Invitrogen-Molecularprobes)用RiboGreen試刑定重RNA.逆轉(zhuǎn)錄(RT)用RT-PCR試刑盒的上標(biāo)第一鏈合成系統(tǒng)，在總反應(yīng)體積20中，進行第一鏈cDNA制備.1嗎RNA首先在6STC變性5分鐘，與0.5mM各種dNTP、0.5ng寡(dT)12.18—起在冰上冷卻至少1分鐘.混合物在42C培養(yǎng)2分鐘，加入笫二份預(yù)混物，其中含有1X笫一鏈緩沖液、10mMDTT、40單位RNA醉OUT和40單位SuperscriptIIRT.反應(yīng)體系在42"C孵育IO分鐘，在50"C孵育1小時并在701C加熱15分鐘滅活.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用優(yōu)化量的cDNA(根據(jù)靶基因10-200ng)在lxPCR援沖液(10x:Tris-HCl,KCI，(NH4)中在總反應(yīng)體積50pL中進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中含有0.2mM各種dNTP、8.5pmol各種PCR引物和2.5單位TaqDNA聚合醃.混合物在941C下加熱5分鐘，隨后是30至35個循環(huán)(根據(jù)靶)，各循環(huán)由在94t:孵育l分鐘、60t:孵育45秒和72C孵育45秒組成.在72TC補充延伸IO分鐘.用1.5%瓊脂糖凝膠電泳在溴化乙錠存在下分析PCR產(chǎn)物.用于各基因的PCR引物序列和PCR擴增產(chǎn)物的預(yù)期大小描述于表2a-b.用TotalLab軟件(用RollingBall;UltraLumInc.,ModelUC4800扣除背景)定量PCR產(chǎn)物.實時PCR在存在0.5mM各種PCR引物和4pLLCFastStartDNAMasterSYBRGreen1PLUS下用3iLcDNA反應(yīng)物在總體積20pL中制備PCR反應(yīng)混合物.步驟l(變性)95"，IO分鐘(斜率20TC/秒)步驟2(40個循環(huán))95TC,(斜率20t7秒)；57tJ,5秒(斜率20"C/秒)(除了PDE4D，Tm-59X:);72X:，10秒(斜率20t7秒)步驟3(解鏈曲線)95t:，(斜率20TC/秒)；70TC,30秒(斜率20TC/秒)；95t:，0秒(斜率20C/秒).步稞4(冷卻)40TC,30秒(斜羋20t:/秒)用于各個基因的PCR引物序列描述于表2c-d.用RelQuant程序(Roche)定重PCR產(chǎn)物.人TNF-aELISA在沒有PHA刺激16-18小時下如前述用反義物(0.05nM每種)轉(zhuǎn)染PBMC.之后用PHA(10叫/mL)刺激細(xì)胞6小時.收集上清，2000rpm離心5分鐘，保存于-80X:直至用于如制造商所述進行ELISA.動物所有動物操作經(jīng)MisproBiotechServiceInc.AnimalCareCommittee(動物保護委員會)批準(zhǔn)，并遲守CanadianCouncilofAnimalCare動物試驗指南.C57BL/6和AKR/J小鼠(20-25g)(CharlesRiverCanada，LasalleQC，Canada)飼養(yǎng)于MisproBiotechServiceInc.動物設(shè)施(MontrealQC,Canada).經(jīng)ip注射氣胺嗣/甲苯噻喚輕度麻醉體內(nèi)反義靶驗證和多基因交叉敲除的C57BL/6.對于接受反義寡核苷酸的組，收獲肺之前16-20小時經(jīng)鼻滴注反義寡核苷酸溶液(50mg/小鼠/反義物)預(yù)處理小鼠.對照小鼠接受無菌PBS中的相同量的對照反義寡核苷酸.脂多糖(LPS)-誘導(dǎo)的肺炎癥模型經(jīng)ip注射氣胺稱/甲苯噻喚輕度麻醉C57BL/6小鼠，并經(jīng)鼻滴注10mg大腸桿菌血清型0111:B4的LPS(Sigma-Aldrich,OakvilleON,Canada)以誘導(dǎo)急性肺炎癥.對照小鼠接受相似體積的無菌PBS.對于接受反義寡核苷酸的組，在LPS暴露之前12小時經(jīng)鼻滴注反義寡核苷酸溶液(200mg/小鼠)預(yù)處理小鼠.對照小鼠接受無菌PBS中的相同量對照反義寡核苷酸.滴注LPS后6小時進行支氣管肺泡灌洗并收獲肺.香煙誘導(dǎo)的肺炎癥模型用吸煙儀器(SCIREQScientificRespiratoryEquipmentInc.，MontrealCanada)將AKR/J小鼠暴露于8支1R3F研究香煙(UniversityofKentucky)的全部煙中.對照小鼠假吸煙.對于接受反義寡核苷酸的組，將小鼠輕度麻醉并在暴露于香煙之前3小時和之后24小時經(jīng)#滴注反義寡核苷酸溶液(200mg/小鼠)預(yù)處理小鼠.對照小鼠接受無菌PBS中的相同量對照反義寡核苷酸.暴露于香煙之后48小時進行支氣管肺泡灌洗并收獲肺.支氣管肺泡灌洗(BAL)和差異細(xì)胞計數(shù)ip注射氣胺嗣/甲苯嚷嗪麻醉小鼠.行氣管切開術(shù)并用0.5ml水冷PBS洗肺四次.計總細(xì)胞數(shù)，然后在細(xì)胞離心涂片(cytospinslide)上離心.用Wright-Giemsa染色細(xì)胞離心涂片之后評價差異細(xì)胞計數(shù).在浸油顯微鏡下至少計數(shù)200個細(xì)胞.BAL液保存于-80iC供隨后測量TNF-a.小鼠TNF-aELISABAL液中的TNF-a水平用小鼠TNF-aELISA試刑盒根據(jù)制造商推薦進行測量.逆轉(zhuǎn)錄(RT)和實時PCR用polytronPT1200(BrinkmanInstruments)勻漿小鼠肺，用QiagenRNAeasymini試刑盒(Qiagen,MississaugaON,Canada)提取總RNA，隨后經(jīng)DNA醉I消化.用Ribogreen熒光測定法(InvitrogenCorporation,BurlingtonON,Canada)定量總RNA,用SuperScriptTMIIRT試劑盒(InvitrogenCorporation,BurlingtonON,Canada),采用笫1鏈cDNA合成法，從l叫RNA制備cDNA.用LCFastStartDNAMasterSYBRGreen1PLUS(RocheDiagnostics,LavalQC,Canada),用50ngcDNA準(zhǔn)備實時PCR反應(yīng)并在LightCycleKRocheDiagnostics,LavalQC,Canada)中運行.用TibMolbiol(Adephia，NJ)設(shè)計引物組并經(jīng)GSP純化(見表2d).PBGD或HPRT用作參考基因.每次實時PCR運行包括校準(zhǔn)cDNA(由小鼠肺組織的合并RNA制備)，并用校準(zhǔn)的Cp值校正基因/PBGD或基因/HPRT比例.此外，對于PBGD和對于HPRT,用校準(zhǔn)cDNA制作每個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線并創(chuàng)建系數(shù)文件，其中包括校正靶基因和參考基因之間的擴增效率差異.實施例實施例1本實施例涉及PDE同種型'的細(xì)胞和組織分布.炎性呼吸系統(tǒng)疾病特征在于炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)和組織細(xì)胞(大多是上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)之間的相互作用.評價PDE3(PDE3A和B)、PDE7(PDE7A和B)和PDE4(PDE4A、B、C和D)同種型在不同細(xì)胞和組織中的mRNA表達.用于每種PDE同種型的引物的總結(jié)可見表2a.選用的細(xì)胞是A549(來自肺腺癌的上皮細(xì)胞)、和NCI-H292(粘液上皮肺癌).在BSMC(人支管平滑肌細(xì)胞)和PBMC(外周血單核細(xì)胞)中評估原代人細(xì)胞中的表達.也用正常人肺表征PDE的表達.最后，包括正常人腦作為對照，因為多數(shù)PDE在該組織中表達.困1中可見，除了PDE7A和PDE4B在上述條件下在評價的每種細(xì)胞和組織中都表達以外，不同細(xì)胞和組織表達不同同種型的PDE.PDE4CmRNA被發(fā)現(xiàn)在這些試驗所用細(xì)胞和組織33中的豐度較低.PDE4A被發(fā)現(xiàn)在肺和腦中，而PDE4D被確認(rèn)在肺和氣道細(xì)胞中(A549和NCI-H292).因為PDE7A存在于所有測試細(xì)胞中，最近已經(jīng)建議它對淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病很重要，我們也評價了PDE7A的亞同種型.如困2所示，PDE7A1似乎是在所有測試細(xì)胞中最多表達的同種型.重復(fù)幾次PCR，PDE醉同種型在每種細(xì)胞系、原代細(xì)胞或組織中的表達的存在或缺乏表示于表3a和b.應(yīng)該注意PDE3A沒有在PBMC和除了A549以外的幾個細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn).而且相應(yīng)于PDE7B和PDE4C的信使在此處所用細(xì)胞和組織中很少檢測到.實施例2本實施例涉及有效抗PDE7A的反義寡核苷酸.設(shè)計了幾種抗PDE7AmRNA的反義寡核苷酸并評價了它們在表達PDE7A的細(xì)胞中的效果.表la包括所用序列的列表.用濃度逐步增加的寡核苷酸進行所有試驗，并通過比較處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞中的PDE7AmRNA密度與GAPDH密度的比率評價效果.困3中發(fā)現(xiàn)在Eol-l細(xì)胞中Top-1702(Seq.IDNo.1)、Top-1706(Seq.IDNo.3)、Top-1703(Seq.IDNo.2)、Top-1701、和Top-1707可以有效抑制PDE7AmRNA表達.此外，Top-1702(Seq.IDNo.l)、Top-1703(Seq.IDNo.2)、Top-1706(Seq.IDNo.3)、和Top-1707抑制U937細(xì)胞中的PDE7A.圖4中，幾種PDE7A反義寡核苷酸(Top-1702(Seq.IDNo.1)，Top-1703(Seq.IDNo.2),和Top-1706(Seq.IDNo.3))在10-20濃度，在Jurkat細(xì)胞中顯示對PDE7AmRNA的超過60%抑制.寡核苷酸Top-1707和Top-1726在所研究條件下實際上無效.在Hut-8細(xì)胞中寡核苷酸Top-1703(Seq.IDNo.2)在10保持其效果，而Top-1706(Seq.IDNo.3)效力較低，Top-1702(Seq.IDNo.1)無效.在BSMC和A549細(xì)胞中，Top-1702(Seq.IDNo.1),Top-1703(Seq.IDNo.2)和Top-1706(僅BSMC顯示，Seq.IDNo.3)都能如困5所示有效下調(diào)PDE7A的mRNA表達.而且，也在人PBMC中評價這些PDE7A反義物.結(jié)果顯示在這些反義物中，Top-1706(Seq.IDNo.3)有效抑制其特異性信使的40%，表4a.此處報告的結(jié)果是靶和反義寡核苷酸一級序列特異性的，并且不是由于間接或非特異性作用.總體結(jié)果提示本發(fā)明的針對PDE7A的反義策略可以成功提供對靶mRNA的顯著抑制.在設(shè)計的寡核苷酸中，Top-1703(Seq.IDNo.2),Top-1706(Seq,IDNo.3)和Top曙1702(Seq.IDNo.1)似乎可襲有效地在研究的所有細(xì)胞系和原代細(xì)胞中抑制PDE7A的mRNA表達.這些結(jié)果提示這些反義寡核苷酸能用于本發(fā)明的基于治療刑的策略.實施例3本實施例涉及有效抗PDE3A和PDE3B的反義寡核苷酸.設(shè)計一組反義寡核苷酸并測試它們在幾種細(xì)胞類型中降低mRNA水平的能力.表lb-c包括所用序列的列表.發(fā)現(xiàn)幾種反義寡核苷酸能有效降低A549細(xì)胞和/或U937細(xì)胞中的PDE3AmRNA水平，包括Top-1301(Seq.IDNo.10),Top-1302(Seq.IDNo.11)，Top-1303(Seq.IDNo.12)，Top-1307(Seq.IDNo.13),Top-1308(Seq.IDNo.14)，TOP1309(Seq.IDNo.15)，Top-1311(Seq.IDNo.16)和Top-1312(盡管如困6、表4a(上)和4b(下)所示有效性較低).如困7所示，在原代支氣管平滑肌細(xì)胞中，相同的反義寡核苷酸也可有效降低PDE3AmRNA表達.用PDE3B對PBMC進行的試驗顯示，幾種反義物可有效的特異性阻斷PDE3BmRNA，如表4a所示，在這些反義物中Top-l357(Seq.IDNo.18)表現(xiàn)出75°/0抑制，Top-1351表現(xiàn)出4%抑制.總的來說，這些結(jié)果提示本發(fā)明的針對PDE3A和/或PDE3B抑制的反義策略是有效的.幾種其它的反義寡核苷酸，Top-1304，Top-1305,Top-1313，Top-1351,不提供顯著的mRNA抑制，這提示此處報告的反義阻斷效率是靶和反義寡核苷酸一級序列特異性的，而不是由于間接反義作用.實施例4本實施例涉及抗PDE4有效的反義寡核苷酸.設(shè)計了幾種抗PDE4mRNA的反義寡核苷酸并在表達PDE4的細(xì)胞中評價它們的效果.表ld-f包括所用序列的列表.所有試驗用增加濃度的寡核苷酸進行并且經(jīng)實時PCR比較處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞中PDE4A、-B、-D、mRNA密度比HPRT(次黃嚷呤褲酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，作為內(nèi)部對照)密度的比例進行評價(表2c和d).發(fā)現(xiàn)幾種反義寡核苷酸可有效降低PBMC中的PDE4mRNA水平，包括Top-1411(PDE4A，Seq.IDNo.21)，Top-1437(PDE4B,Seq.IDNo.28)和Top-1498(PDE4D，Seq.IDNo.36),分別是43、53和56%,表4a.總的來說，這些結(jié)果提示本發(fā)明的針對PDE4抑制的反義策略是有效的.幾種其它反義寡核苷酸，Top-1406(PDE4A)、Top-1430(PDE4B)、Top-1495(PDE4D),不提供顯著的mRNA抑制，這提示此處報告的反義阻斷效率是靶和反義寡核苷酸一級序列特異性的，而不是由于間接反義作用.實施例5本實施例涉及PDE的單一同種型對不同PDE的mRNA生成的抑制作用.本試驗在A549細(xì)胞和PBMC中進行.如表4b所示，發(fā)現(xiàn)幾種反義物不僅抑制其特異性靶而且能下調(diào)對應(yīng)其它PDE的mRNA.PDE3A反義Top-1308(Seq.IDNo.14)在A549細(xì)胞系中不僅提供對其特異性mRNA的抑制(60°/。)，而且下調(diào)PDE3B(53%)、PDE4A(63%)、PDE4D(26%)和PDE7A(44%)的表達.在PBMC中進行相同試驗，結(jié)果表明PDE3B反義Top-1357(Seq.IDNo.18)能特異性抑制其靶(62%),并且還能分別對應(yīng)PDE4A、-4B、-4D和7A的信使下調(diào)76、43、65和38%，表4b.這種多基因敲除過程也在PBMC中用抗PDE4A的Top-1413(Seq.IDNo,23)、抗PDE4B的Top-1437(Seq.IDNo.28)、抗PDE4D的Top-14卯(Seq.IDNo.34)、抗PDE7A的Top-H06(Seq.IDNo.3)發(fā)現(xiàn)，表4b.因為以下原因所觀察到的抑制是特異性的在本研究中使用的所有Top反義寡核苷酸與研究的其它PDE寡核普酸序列不具有任何同源性.此外，此處所用的有效的反義物不影響研究的所有PDE，例如抗PDE3B、-4A和7A作用強的Top-1308(Seq.IDNo.14)以較低程度的有效性抗-4D,而對PDE4B無效.而且，本研究所用幾種其它反義物既沒有發(fā)現(xiàn)抗其特異性靶的活性也沒有發(fā)現(xiàn)抗其它PDE的活性，(Top-l312,Top-1404),表4b.這些結(jié)果表明反義寡核苷酸對PDE同種型mRNA的抑制影響其它PDE的生成，并且解釋了本文所述的單一的寡核苷酸誘導(dǎo)的多基因敲除過程.實施例6本實施例涉及單一同種型的PDE對細(xì)胞因子和醉mRNA生成的抑制作用.細(xì)胞因子和趨化因子是在細(xì)胞活化和募集中重要的介質(zhì).在36這些介質(zhì)中間，已經(jīng)顯示在炎性呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理中增加和/或起作用的是白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-7、IL-8、IL-15和TNF-a.幾種酶直接或間接參與組織破壞和/或修復(fù).這些醉中包括基質(zhì)金屬蛋白醉，MMP(MMP-1、-2、-3、-12),即一種組織特異性MMP1(TIMP-1)抑制刑和環(huán)加氧醉cox-l.已經(jīng)在一些炎性呼吸系統(tǒng)疾病中證明了MMP與其抑制劑或TIMP的比例增加.在人原代平滑肌支氣管細(xì)胞中評價了PDE3A或PDE7AmRNA的抑制對介質(zhì)和醉mRNA生成的作用.如圖8所示，有效降低PDE3A(Top-1301(Seq.IDNo.10)，Top-1303(Seq.IDNo.12)，Top-1308(Seq.IDNo.14)，Top國1311(Seq.IDNo.16))或PDE7A(Top-1702(Seq.IDNo.1),Top-1703(Seq.IDNo.2)，Top-H06(Seq.IDNo.3))mRNA生成的反義寡核苷酸也降低IL-6、IL-7、IL-IS、TNF-a的mRNA和較低程度降低IL-8的mRNA.所述反義寡核苷酸也對MMP12的mRNA有抑制作用，但在此濃度對MMP畫1、MMP曙2、MMP-3、TIMP-1和cox-1mRNA沒有作用.單一PDE特異性的反義對其它PDE的作用見表4b.幾種特異性PDE反義物((Top-1308(Seq.IDNo,14);Top-1357(SEQIDNo.18);Top-1413(Seq.IDNo.23);Top-1437(Seq.IDNo.28);Top-14卯(Seq.IDNo.34);Top-1706(Seq.IDNo.3))不僅可有效下調(diào)其特異性靶，而且對其它磷酸二醋酶有抑制作用.而且，因為本研究中使用的所有Top反義寡核苷酸與所研究細(xì)胞因子或酶的核苷酸序列沒有任何相似性，所觀察到的抑制是特異性的.此外，Top反義物降低mRNA生成的水平是序列和細(xì)胞罔子特異性的.這些結(jié)果表明，反義寡核苷酸對PDE同種型mRNA的抑制影響介質(zhì)和蘇生成.實施例7本實施例涉及同種型特異性反義寡核苷酸的組合對PDE3A和PDDE7A基因表達的作用.在表達這兩種PDE同種型的U937細(xì)胞中評價組合寡核普酸對PDE3A和PDE7AmRNA表達的作用.對此，在研究條件下在這種細(xì)胞系中分別以實際無效的濃度使用每種寡核苷酸UOpM，如困9所示).PDE3A和PDE7A反義寡核苷酸的某些組合比單獨的任一種反義寡核苷酸在有故降低PDE3A和PDE7AmRNA表達上要顯著得多.Top曙1703(Seq.IDNo.2)和(Seq.IDNo.10)或Top-1706(Seq.IDNo.3)和Top-1303(Seq.IDNo.12)的組合表現(xiàn)出對PDE3A和PDE7AmRNA的強烈協(xié)同抑制.此外，此處報告的作用是靶和反義一級序列特異性的，因為幾種其它TOP-1700和TOP-1300寡核苷酸組合不具有顯著的mRNA抑制作用.用于本發(fā)明組合的有效的PDE寡核苷酸反義化合物在此描述為能抑制靶PDE基因表達的那些，其中當(dāng)與另一種寡核苷酸化合物(都以低于20%抑制其靶基因的濃度提供)組合時，引起至少一種靶基因被抑制超過20V。并且是單獨一種寡核苷酸化合物表現(xiàn)的抑制量的至少兩倍.所述組合可以表現(xiàn)對兩種PDE核酸靶的抑制，以及對編碼其它PDE和炎癥介質(zhì)的核酸的抑制.這些結(jié)果顯示了組合兩種不同把基因如PDE7A和PDE3A的核苷酸序列來源的兩種反義寡核苷酸的特異性、多基因敲除作用.盡管所述寡核苷酸的使用濃度當(dāng)單獨使用時對其靶基因沒有作用，所述組合誘導(dǎo)對其靶基因的顯著抑制.實施例8本實施例涉及PDE3A和PDE7A反義寡核苷酸的組合對介質(zhì)和酶mRNA表達的作用.多基因敲除對細(xì)胞因子、趨化因子和醉基因mRNA表達的作用見困10.結(jié)果從U937單核細(xì)胞系獲得.需要注意在研究濃度下每種反義寡核苷酸單獨使用時對IL-10和MMP-8mRNA表達具有小的抑制作用.當(dāng)單獨使用時所述反義寡核苷酸對PDE4B、MMP-1、MMP-2和TIMP-1mRNA表達沒有抑制作用.2種反義寡核苷酸的組合(Top醫(yī)1311(Seq.IDNo.16)+Top-1703(Seq.IDNo.2)或Top-1307(Seq.IDNo.13)+Top-1703(Seq.IDNo.2))具有與單獨使用每種反義寡核苷酸相同的作用(對IblO和MMP-8mRNA輕度抑制，對PDE4B、MMP-1、MMP-2、和TIMP-1mRNA表達沒有作用).然而，2種反義寡核苷酸的組合(Top-1301(Seq.IDNo.10)+Top-1703(Seq.IDNo.2)或Top-1303(Seq.IDNo.12)+Top-1706(Seq.IDNo.3))具有協(xié)同抑制作用，表現(xiàn)為不僅ILIO和MMP-8mRNA表達的顯著降低而且還顯著降低PDE4B、MMP-1和MMP-2mRNA表達，而不影響TIMP-1mRNA表達.使用反義寡核苷酸的后2種組合所發(fā)現(xiàn)的多基因敲除是選擇性的，因為抑制幾種MMP的酶活性的基因TIMP-1不受影響，而且是特異性的，因為管家基因GAPDH不受所述組合影響.這些結(jié)果與實施例5中的結(jié)果相一致，表明多基因敲除具有更寬抗炎作用的潛力.實施例9本實施例使用功能性測試(即抑制TNF-a生成)來舉例說明組合2種選定的抗PDE同種型寡核普酸在人PBMC中的多基因敲除作用.細(xì)胞因子在所有疾病包括哮喘和COPD的慢性炎癥調(diào)控中起關(guān)鍵作用.TNF-a是在幾種炎癥疾病中表達的最重要的促炎癥細(xì)胞因子之一.在COPD患者的誘導(dǎo)的痰中TNF-a水平顯著增加(KeatingsetAm.J.Respir.Crit.CareMed.1996;153;530-534.).而且有證據(jù)表明體重降低的COPD患者顯示從循環(huán)細(xì)胞中釋放的TNF-oc增加并且TNF-a可以誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致一些具有嚴(yán)重COPD的患者中可見的特征性肌消瘐和惡病質(zhì)(DeGodoyetAm.J.Respir.Crit.CareMed.1996，153,633-637.).PDE4抑制刑通過增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀A(yù)MP引起炎癥細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和趨化因子降低(Torphy，Am.J.Respir.Crit.CareMed.1998,157，351-370).與皮質(zhì)類固醇比較，PDE4抑制刑對中性粒細(xì)胞具有強抑制作用(Auetal.，Br.J.Pharmacol.1998，123,1260-1266.)，表明它們可用于COPD的抗炎治療.初步證據(jù)表明PDE4抑制刑Cilomilast改善COPD患者的肺功能和癥狀，這可能是由于細(xì)胞因子抑制(Comptonetal.，Lancet.2001,358，265-270).此處表明幾種選定的反義寡核苷酸組合不僅抑制其特異性PDE靶而且引起多基因敲除，包括促炎癥細(xì)胞因子TNF-a生成的降低.困11表明當(dāng)反義寡核苷酸(Top曙1360(PDE3B,Seq.IDNo.19);Top-1413(PDE4A,Seq.IDNo.23);Top-1437(PDE4B，Seq.IDNo,28);Top-1498(PDE4D,Seq.IDNo.36))單獨使用時在測試濃度下對從PHA活化的PBMC釋放的TNF-ot具有小的、最低作用.然而當(dāng)評價組合時，它們對PBMC釋放TNF-a提供超過加和的作用.觀察到的對TNF-彿放的作用是特異性的，因為單獨或與其它反義組合使用錯配反義物時，對受刺激的PBMC釋放TNF-a沒有作用.因為TNF-a被認(rèn)為是炎癥和慢性呼吸系統(tǒng)疾病中的共同特征，本發(fā)明提供治療幾種炎癥疾病的寬治療應(yīng)用.本實施例表明通過體內(nèi)施用抗PDE同種型的反義寡核苷酸，有可能降低PDE4A、PDE4B和PDE7A的mRNA的表達.在該試驗中，經(jīng)鼻滴注(50mg)施用每種反義寡核苷酸(表5)并在16小時后收集肺.通過實時PCR分析由全肺制備的cDNA,評價靶mRNA的表達.表5列舉了對每種小鼠靶mRNA特異性的幾種反義寡核苷酸，所測重的抑制活性大于25%.各試驗中包括的對照反義寡核苷酸不顯示不同mRNA靶的抑制活性，這提示所觀察到的反義活性是把和反義寡核苷酸序列特異性的.因此，通過簡單的經(jīng)鼻滴注活性反義寡核苷酸可以實現(xiàn)抑制小鼠肺中幾種PDEmRNA的表達.實施例11本實施例證明可使用2種反義寡核苷酸的組合體內(nèi)誘導(dǎo)多基因敲除，困12A表明在測責(zé)TOP2437(SEQIDNo.141)時間點，抗PDE4B的小鼠反義寡核苷酸在低濃度(50mg/小鼠)下單獨使用時對PDE4BmRNA表達沒有顯著抑制作用.然而組合Top2437(SEQIDNo.141)(抗PD4B的反義寡核苷酸)和Top2713(SEQIDNo.149)(抗PDE7A的反義寡核苷酸)導(dǎo)致小鼠肺中PDE4B被抑制超過40。/。.困12B表明盡管TOP2437(SEQIDNo.141)和TOP2713(SEQIDNo.149)當(dāng)?shù)蜐舛葐为毷褂脮r對PDE7AmRNA表達有很小抑制作用，兩種反義寡核普酸的組合抑制83%的PDE7AmRNA表達.結(jié)果表明與單獨使用的反義處理比較，把向兩種不同PDE同工醉的兩種反義物的組合導(dǎo)致每種靶基因更高水平的抑制，例如超過加和水平的抑制.困12C表明抗PDE4B和PDE7A的反義寡核苷酸的組合也將降低小鼠肺中PDE4AmRNA表達.結(jié)果表明即使每種反義寡核苷酸自己沒有作用，經(jīng)組合處理后可以實現(xiàn)PDE4AmRNA表達的高水平協(xié)同抑制.這些結(jié)果證明，不僅通過組合抗這些同種型的兩種反義寡核苷酸能獲得靶PDE同種型的超過加和的抑制，而且通過用不抗給定同種型的兩種反義的組合處理也可以實現(xiàn)另外抑制其它PDE同種型.實施例12本實施例表明抗特異性PDE同種型的反義寡核苷酸能部分抑制LPS誘導(dǎo)小鼠中的急性肺炎癥.在該實施例中PDE4B是靶，因為之前40已經(jīng)表明它在LPS誘導(dǎo)的炎癥中是重要的(Maetal.,Mol,Pharmacol.,1999,55，50-57.;Wangetal.，Molec.Pharmacol,,1999，56，170-174，)此外，我們以前的結(jié)果證實LPS處理小鼠，導(dǎo)致PDE4B表達上調(diào)(數(shù)據(jù)未示出).為證明靶mRNA表達能在LPS暴露小鼠中被抑制，在暴露于LPS之前12小時經(jīng)鼻滴注200mgTOP2430(SEQIDNo，135)(對PDE4B特異的)或?qū)φ辗戳x寡核苷酸而預(yù)處理小鼠.困13A表明，TOP2430(SEQIDNo.135)預(yù)處理后PDE4B表達被降低86%.困13A也表明施用抗PDE4B的反義寡核苷酸也部分抑制肺PDE4A、4D和7AmRNA表達.作為比較，抑制PDE4B后PDE3B表達被刺激117。/。.這個實施例以另一種方式證明體內(nèi)多基因敲除的概念.困13B表明抑制PDE4B對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎癥的作用.結(jié)果表明與對照小鼠相比，在暴露于LPS的小鼠肺中TOP2430(SEQIDNo.135)對PDE4B的抑制顯著減少細(xì)胞內(nèi)流(減少40%,p<0.013).在處理小鼠中，總細(xì)胞減少與肺灌洗液中存在的嗜中性粒細(xì)胞(減少40o/。，p<0.016)和巨噬細(xì)胞(減少50%,p<0.002)顯著降低有關(guān).而且TOP2430(SEQIDNo.135)預(yù)處理引起肺灌洗液中LPS誘導(dǎo)的TNF-ot濃度顯著降低(26%)(困13C).結(jié)果表明通過向小鼠局部遞送反義寡核苷酸可實現(xiàn)特異性抑制靶PDEmRNA.而且抑制暴露于LPS的小鼠中PDE4B表達對炎癥應(yīng)答具有顯著作用，使得細(xì)胞內(nèi)流降低、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向肺遷移和TNF-a釋放減少.這種作用的機制可能與多基因敲除相關(guān)，同時抗PDE4B的反義寡核苷酸還導(dǎo)致幾種其它PDE下調(diào).實施例13該實施例涉及靶向特異性PDE4BmRNA的反義寡核苷酸對香煙暴露誘導(dǎo)的急性肺炎癥的抑制效果(困14).困14顯示使AKR/J小鼠呼吸香煙煙的作用.持續(xù)暴露至少48小時，再24小時之后吸煙致使支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)顯著增加(田14A).結(jié)合炎癥細(xì)胞的內(nèi)流，暴露于香煙誘導(dǎo)肺組織中TNF-a增加表達(增加3-5倍，困14B).已經(jīng)表明巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和TNF-a在吸煙誘導(dǎo)的肺炎癥和進展到隨后的肺氣腫中有重要作用(Churgetal.，Am.J.Respir.CritCareMed.,2002,166,849-854;Am.J.Respir.CellMol.Biol.,2002,27,368-374).圖14C表明PDE4B抑制對吸煙誘導(dǎo)的TNF-amRNA表達增加的作用.結(jié)果表明與用對照反義寡核苷酸預(yù)處理的小鼠比較，用TOP2430(SEQIDNo.135)抑制PDE4B20%使肺組織中TNF-a表達降低21%.總的來說，這些結(jié)杲表明可以在暴露于香煙的小鼠中實現(xiàn)特異性抑制PDE4BmRNA表達，并且對全肺組織中TNF-amRNA表達具有相似的作用.序列表<110>TOPIGENPHARMACEUTIQUEINC.Renzi,PauloZemzo咖i,KhalidD'Anjou,Helene<120>治療包括炎癥狀況的疾病的寡核苷酸組合物和方法<130〉13424-7PCT<140〉PCT/CA2004/001765<141>2004-09-29<150〉US60/507,016<151>2003-09-29<160>150<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉1gaacctcttctttctgattc20<210>2<211>20<212>■<213>人工序列<220〉<223〉引物<400〉2ggtgagaacctcttctttct20<210>3<211>17<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物<400>3ttcccacgtccgacatg<210>4<211>18<212>■<213>人工序列<220><223〉引物<400>4gcttaggttcctttaagt<210〉5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400〉5tcatgagtggcagctgc<210〉6<211>19<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>6ccatttgttgcctgctttc<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物171817gtctccatttgttgcctgc<210>8<211>19<212〉■<213>人工序列<220〉<223>引物<400>8tttcactccactgcttgct<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9ctgtggtaatcttcttgaa<210>10<211>18<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<400>10gactcgtgcagcgtcgcc<210>11<21>17<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400>11gttcctgactcgtgcag說明書第42/81頁1919191845<210>12<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉12ggcttgttcctgactcgtgc20<210〉13<211>19<212〉隨<213>人工序列<220〉<223>引物<400>13gctccggagcggctgcagc19<210>14<211>21<212>隨<213>人工序列<220><223〉引物<400>14ggccagcagcgcgacagccag<210>15<2U>16<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400〉15gcggaccagcctcacc<210>16<211>20<212〉廳<213>人工序列<220>〈223>引物<400>16cggccaagcagctgagcacc<210>17<211〉18<212>瞧<213>人工序列<220><223>引物<400>17ggcggctgcagggaccgc<210>18<211>9<212〉■<213>人工序列<220><223>引物<400>18ccgcagctccacgttgcag<210〉19<211〉20<212〉DM<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉19tcagcagcgtccgcagccag<210>20<211>20<212>■<213〉人工序列<220><223>引物說明書第44/81頁201819<400>20cggaggctggccagcacctg20<210><211><212〉<213>2117■人工序列<220><223>引物<400〉21tcttgcgtaggctctgc17<210><211><212><213>2219■人工序列<220><223>引物<400>22cactttcttggtctccacc19<210>23<211>17<212>DM<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉23gccacgctcgcgctctc<210〉24<211>17<212>■<213〉人工序列<220><223〉引物<400>24gtccactggcggtacag<210>2548<211>17<212〉■<213>人工序列<220><223>引物<400>25gtcatagtcgctgtctg17<210〉26<211>19<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉26ccatgatgcggtctgtcca19<210〉27<211>20<212〉■<213>人工序列<220><223>引物<400〉27gaccggtaggtctgtatggt20<210〉28<211〉17<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400>28ggaggtctctttcctgg17<210>29<211>17<212>■<213>人工序列<220><223〉引物<400>29cggtgctactgaaggtg<210〉30<211>17<212〉■<213>人工序列<220〉<223>引物<400>30ctgattccggtgctact<210>31<211>18<212>瞧<213>人工序列<220〉<223〉引物〈柳〉31ctgattccggtgctactg<210>32<211>19<212>■<213〉人工序列<220><223〉引物<400>32ctgattccggtgctactga<210>33<211〉18<212〉眺<213>人工序列<220〉<223>引物<400>3350ccggtccgtccactggcg18<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>34cgttccctctctcggtctcc20<210〉<211〉<212〉<213>3519■人工序列<220><223〉引物<400>35ctgcctcctcttcaacctg19<210〉36<211>19<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>36cttcaggctggctttcctc19<210>37<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>37cctattccaggcctctcaac20<210>38<211>20<212>■〈213〉人工序列<220><223〉引物<400>38gccaaccgttgctcctcttc20<210><211〉<212><213〉3919DNA人工序列<220〉<223>引物<400>39ggaaggattctcagtcagg19<210>40<211〉19<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400〉40cagtgaggtggtgcattag19<210>41<211>19<212>■<213>人工序列〈220><223〉引物<■>41ccttaccataacgcagtcc19<210〉42<211>19<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉42gagcacctatctgtgtctc<210>43<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉43ccagcctctgctgcctctggc<210〉44<211>19<212>■<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉44gcttacctaccaaccttcc<210〉45<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400〉45ctggtgtctggccttggttc<210〉46<211>19<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉46gcatacacttggcttgtcc說明書第50/81頁1921192053<210>47<211>20<212>■<213〉人工序列<220〉<223〉引物<400>47cgaagaccagcttctgccac20<210〉48<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>48ggcctcgtgcttctggtgtgg21<210>49<211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>49ccacctcgcacacaacaagg20<210>50<211>20<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400〉50gcagcgaatgctgaggtgac20<210>51<211>20<212>■<223>引物<400>51caacgatgagtcggtgctcg<210>52<211>22<212〉隨<213>人工序列<220><223>引物<400〉52cactgcctccagctcggcctcc<210〉53<211>20<212>腿<213>人工序列<220〉〈223>引物<400>53ctgcacgctgctgatgtagc<210〉54<211>20<212〉■<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉54cctgagcatcaggctgtacc<210>55〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>引物說明書第52/81頁20222055<400>55gacgcctcggtgctggagaac21<210><211><212〉<213〉5619■人工序列<220><223>引物<400〉56gatcttgctctggtaccac19<210〉57<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>57gacatcgtacttgcaacag19<210>58<211>19<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>58gtaccattcacgattgtcc19<210>59<211〉24<212〉麗<213>人工序列<220><223>引物<400〉59cttttggagtttgaggtataccta2456<210>60<211>25<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>60gctgcgcagaatgagatgagttgtc25<210>61<211>20<212>隨<213〉人工序列<220><223>引物<400〉61ttttattccgtgctgctcgc20<210>62<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉62gccctaatccgttttgacca20<210〉63<211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>63acatactccaaacctttccac21<210〉64<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>引物<400〉64tcttcaaaaacttctccacaac22<210><211〉<212〉<213>6521■人工序列<220><223〉引物<400>65aaaagaaggcatgcacagctc21<210>66<211>24<212〉靈<213>人工序列<220〉<223〉引物<400〉66caataaggtttctcaaggggctgg24<210>67<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉67tgtcttcattttgggctgtttea23<210>68<211〉24<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>68tcctccagttcctcacattctttg24<210>69<211>21<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400>69aacggaggctgaacaataggc21<210><211〉<212><213〉7022DNA人工序列<220><223>引物<400>70agcaacctttatttctcgccac22<210>71<211>25<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>71cgactctagaaacacaagagcaaga25<210>72<211>25<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400〉72aaggttagcttactgtcacacgctt25<210〉73<211>25<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400>73gtgctgaaggacacactaaagaaga25<210>74<211>25<212〉■<213〉人工序列<220><223〉引物<400>74ttgccatccttctcaaagttgtagg25<210〉75<211>25<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>75agatgctgttgattctgctgttgag25<210〉76<211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>76acagcatcaaaggacaaagcaggat25<210〉77<211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<400>77gctgcttatgaagattttgacagag25<210>78<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>78acagccacatttgattttgcttcag25<210>79<211〉21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>79ccttgccatctggcattgaag21<210〉80<211>24<212>眺<213〉人工序列<220><223>引物<400〉80ggtgatacgttggagtaggaagtc24<210>81<211〉17<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>8161ggccttaggggatgccg17<210><211><212><213〉8218DNA人工序列<220〉<223>引物<400>82cggctatctgggaccgca18<210〉<211><212〉<213>8324■人工序列<220><223>引物<400>83tgcccagctcctggcccgccgctt24<210>84<211>24<212〉■<213>人工序列<220><223〉引物<400>84gtgcatcaacacaggcgcctcttc24<210>85<21D19<212〉DNA〈213>人工序列<220><223>引物<400〉85tgcaacggcggaagaaaac19<210>86<211〉1862<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物<400>86ggctccgatggtgaagcc18<210>87<211>20<212>隨<213>人工序列<220><223>引物<400〉87ggtaaagtggatattgttgc20<210>88<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400>88cagtcttctgggtggcagtg20<210〉89<211>22<212>隨<213>人工序列<220><223〉引物<400>89caacagtgacagcagtgacatt22<210>90<211>22<212>陽<213>人工序列<220〉63<223>引物<400>90ttgagtccaggttatccatgac<210>91<211>20<212>■<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉91gattctttgggattgggact<210>92<211〉20<212>■<213>人工序列<220><223〉引物<400>92atctttggcctacaggaacc<210〉93<211>20<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400>93atcaacaccaattcggagct<210>94<211>19<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400〉94ccagcaccatgtcgatgac說明書第61/81頁22202020<210>95<211>20<212〉隨<213>人工序列<220〉<223〉引物<400>95tggcagacctgaagacaatg20<210><211><212><213>恥19DNA人工序列<220><223>引物<400>96aaattcctccatgatgcgg19<210〉97<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>97cagaatatggtgcactgtgc<210>98<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>98agtctatgaagcccacctgtg<210>99<211〉20<212〉隨65<213>人工序列<220><223>引物<柳〉99tcaggccatgcactgttact20<210>100<211〉21<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400〉100cctgattctctcaataagccc21<210〉101<211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物<400〉101aacggaggctgaacaataggc21<210>102<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>102agcaacctttatttctcgccac22〈210>103<211〉25<212>隨<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>103cttttggagtttgaggtatacctag25<210〉104<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉104cgcagaatgagatgagttgtc21<210><211><212><213〉10523■人工序列<220〉<223〉引物<400>105tgctggaggactttaagggttac23<210〉<211〉<212><213>10622DNA人工序列<220><223〉引物<400〉106gtagatgcctttotcttggagc22<210>107<211〉28<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400>107atcagactgaagagctttgtaatgacca2867<210>108<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400〉108tggcttatatccaacacttcgtg23<210><211><212〉<213>10920隨人工序列<220><223〉引物<柳>109atcctctgggactgggactt20<210〉！10<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<柳>110atctttggcctacaggaacc20<210>111<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物<400>"1gcgtctccaaccagttccta20<210〉112<211>19<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400>112ccagcaccatgtcgatgac19<210>113<211>18<212〉陽<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>113aaggtgacaagctccggt18<210>114<211>19<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400>114tctttgtctccctgctgga19<210>115<211〉20<212>DNA<213〉人工序列.<220><223>引物<400>115cagaatatggtgcactgtgc20<210>116<211>21<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物69<400〉116agtctatgaagcccacctgtg21<210>117<211>20<212>隨<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉117ctcaggccatgcactgttac20<210><211〉<212><213〉11820DNA人工序列<220〉<223〉引物<400>118ggcaagtgtgagaacaaacc20<210><211〉<212〉<213>11925畫人工序列<220><223>引物<■〉119tgctcagagctttcaacaactactc25<210>120<211>20<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400〉120gaggctccagtgaattcgga20<210>121<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>121atggatgctaccaaactggat21<210>122<211>20<212〉■<213>人工序列<220><223〉引物<400>122gccactccttctgtgactcc20<210>123<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉123ttgtaccctggcatacagtttga23<210〉124<211〉18<212>■<213>人工序列<220><223>引物<400>124gttcccacggcacttttc18<210>125<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>125tgtgctaagaggtcctc17<210〉<211〉<212〉<213〉12617DNA人工序列<220〉<223>引物<400>126gaggacctcttagcaoa17<210〉127<211〉18<212>腿<213〉人工序列<220><223>引物<400>127agactcatcgttgtacat18<210〉128<211>18<212〉瞧<213>人工序列<220><223>引物<400>128atgtacaacgatgagtct18<210>129<2U〉20<212〉瞧<213>人工序列<220><223>引物<400〉129accatgtcgatgaccatctt20<210〉130<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>130aagatggtcatcgacatggt20<210><211><212><213〉13119DNA人工序列<220><223>引物<400>131accatagtcttcaggtcag19<210〉132<211>19<212>隨<213>人工序列<220〉<223>引物<400>132ctgacctgaagactatggt19<210〉133<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<400>133ctagttcctccagcgtctcc20<210〉134<211>2073<212〉薩<213>人工序列<220><223>引物<400>134ggagacgctggaggaactag20<210〉135<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<柳〉135catctctgagaggtgtgtc19<210〉136<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>136gacacacctctcagagatg19<210〉137<211>18<212>■<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉137gacagagcggtaggtctg18<210>138<211〉18<212〉DNA<213>人工序列<220>74<223>引物<400〉138cagacctaccgctctgtc18<210>139<211>18<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>139ctgattggagactccagg18<210〉140<211>18<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉140cctggagtctccaatcag18<210>141<211>19<212〉陽<213〉人工序列<220><223〉引物<400>141gatggacaatgtagtcaat19<210><211><212><213>14219DNA人工序列<220〉<223〉引物<400>142attgactacattgtccatc19<210>143〈211>17<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>143tccagatcgtgagtggc17<210>144<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>144gaactgggaattaagcaag19<210>145<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>145cttgcttaattcccagttc19<210><211><212><213>14617DNA人工序列<220><223>引物<400>146gccactcacgatctgga17<210〉147<211>17<212>■<213>人工序列<220〉<223〉引物<400>147gtcagaaccagttcttc17<210>148<211〉17<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>148gaagaactggttctgac17<210〉149<211〉19<212>■<213>人工序列<220><223〉引物<400>149ggagcaatcttacagcttc19<210><211><212><213>15019■人工序列<220〉<223>引物<400>150gaagctgtaagattgctcc19表la反義物;識別號.反義序列(5'.3'):耙基因登記號:S0qID:;iNo.TOP-1702GAACCTCTTCTTTCTGATTCPDE7ANM—0026031TOP-1703GGTGAGAACCTCTTCTTTCTPDE7ANM002抑32TOP-1706TTCCCACGTCCGACATGPDE7ANM0026033TOP-1714GCTTAGGTTCCTTTAAGTPDE7ANM0026034TOP-1716TCATGAGTGGCAGCTGCPDE7ANM0026035TOP-1718CCATTTGTTGCCTGCTTTCPDE7ANM0026036TOP-1719GTCTCCATTTGTTGCCTGCPDE7ANM002603TOP-1720TTTCACTCCACTGCTTGCTPDE7ANM0026038TOP-1722CTGTGGTAATCTTCTTGAAPDE7ANM0026039表lb反義物識別號'反義序列〖5'-3')耙基因登記號TOP-1301(3ACTCGTGCAGCGTCGCCPDE3ANM00092110TOP-1302GTTCCTGACTCGTGCAGPDE3ANM000921"TOP.1303GGCTTGTTCCTGACTCGTGCPDE3ANM00092112TOP-1307GCTCCGGAGCGGCTGCAGCPDE3ANM00092113TOP-1加8GGCCAGCAGCGCGACAGCCAGPDE3ANM00092114TOP-1309GCGGACCAGCCTCACCPDE3ANM00092115TOP-1311CGGCCAAGCAGCTGAGCACCPDE3ANM00092116表lc:反義物;識別號1:反義序列(5'-3T耙基因:登B號S叫IDNo.TOP-1353GGCGGCTGCAGGGACCGCPDE犯NM00092217TOP-1357CCGCAGCTCCACGTTGCAGPDE3BNM000922化TOP-1360TCAGCAGCGTCCGCAGCCAGPDE3BNM0009221978表ld:反義物:識別號反義序列U5'"3')耙基因孝記號.':SefilDNo.TOP-1403CGGAGGCTGGCCAGCACCTGPDE4ANM00620220TOP-1411TCTTGCGTAGGCTCTGCPDE4ANM00620221TOP-1412CACTTTCTTGGTCTCCACCPDE4ANM00620222TOP-1413GCCACGCTCGCGCTCTCPDE4ANM—00620223TOP-1505GTCCACTGGCGGTACAGPDE4ANM00620224TOP-1510GTCATAGTCGCTGTCTGPDE4ANM00620225TOP-1512CCATGATGCGGTCTGTCCAPDE4ANM00620226表le反義物.識別號反義序列(5'-3'〉IE,.登記號SeqlDNo,TOP-1432GACCGGTAGGTCTGTATGGTPDE4BNM002B0027TOP-1437GGAGGTCTCTTTCCTGGPDE4BNM00260028TOP-1534CGGTGCTACTGAAGGTGPDE4B2NM00260029TOP-1537CTGATTCCGGTGCTACTPDE4B2NM00260030TOP-1538CTGATTCCGGTGCTACTGPDE4B2NM00260031TOP-1539CTGATTCCGGTGCTACTGAPDE4B2NM00260032表lf反義物:識別號反義序列(5'，3'V耙基因:登記號TOP-1489CCGGTCCGTCCACTGGCGPDE4DNM00620333TOP-1柳CGTTCCCTCTCTCGGTCTCCPDE4DNM00620334TOP-1497CTGCCTCCTCTTCAACCTGPDE4DNM00620335TOP-1498CTTCAGC3CTGGCTTTCCTCPDE4DNM—006203;3679<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表2c某因'引物名'引物序列(5'-3'):PDE3Ahu/muPDE3AFCAACAGTGACAGCAGTGACATT89hu/muPDE3ARTTGAGTCCAGGTTATCCATGAC90PDE3BhuPDE3BFlGATTCTTTGGGATTGGGACT91hu/muPDE3BRlATCTTTGGCCTACAGGAACC92hu/muPDE4AFlATCAACACCAATTCGGAGCT93hu/muPDE4ARlCCAGCACCATGTCGATGAC94PDE4Bh'jPDE4BFlTGGCAGACCTGAAGACAATG95huPDSMBR2AAATTCCTCCATGATGCGG96PDE4Dhu/muPDE4DFlCAGAATATGGTGCACTGTGC97hu/眼PDE4DRlAGTCTATGAAGCCCACCTGTG98PDE7Ahu/muPDE7TCAGGCCATGCACTGTTACT99huPDE7R2CCTGATTCTCTCAATAAGCCC100TNF.alphaAACGGAGGCTGAACAATAGGC101AGCAACCTTTATTTCTCGCCAC102IL-6huI!j-6FCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAG103CGCAGAATGAGATGAGTTGTC104IL-10hu二1j-10FTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTAC:05huH10RSTAGATGCCTTTCTCTTGGAGC106HPRTHPRT夕卜顯子3.4ATCAGACTGAAGAGCTTTGTAATGACCA107HPRT外顯子7TGGCTTATATCCAACACTTCGTG108表2d某閔,引物名引物序列(5"-3，).-PDE3BmuPDE3BFlATCCTCTGGGACTGGGACTT109hu/muPDE3BRlATCTTTGGCCTACAGGAACC110PDE4AmuPDE4AF2GCGTCTCCAACCAGTTCCTA111hu/muPDE4ARlCCAGCACCATGTCGATGAC112PDE4BmuPDE4BFlAAGGTGACAAGCTCCGGT113hu/muPDE4BRlTCTTTGTCTCCCTGCTGGA114PDE4Dhu/muPDE4DFlCAGAATATGGTGCACTGTGC115hu/muPDE4DRlAGTCTATGAAGCCCACCTGTG116PDE7Ahu/nuiPDE7FlCTCAGGCCATGCACTGTTAC117muPDE7R2GGCAAGTGTGAGAACAAACC118TNF-alphamuTNF-alphaFTGCTCAGAGCTTTCAACAACTACTC119tnuTNF-alphaRGAGGCTCCAGTGAATTCGGA120IL-6muIL-6FATGGATGCTACCAAACTGGAT121muI乙-6RGCCACTCCTTCTGTGACTCC122JPBGDTTGTACCCTGGCATACAGTTTGA123mPBGDRGTTCCCACGGCACTTTTC124nu:人Mil:小鼠HPRT:次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶PBGD:膽色素原脫氨酶81<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表4a人PDE后義物初歩篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表5小鼠PDE反義物體內(nèi)初步篩詵<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>權(quán)利要求1.治療與cAMP水平降低相關(guān)疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥學(xué)可接受的載體和至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種寡核苷酸化合物能夠分別與編碼PDE7A和PDE4B的核酸序列的至少一部分雜交，每種寡核苷酸化合物存在的濃度表現(xiàn)出對其靶PDE的小于20％的抑制，而所述組合表現(xiàn)出超過20％的抑制并且對PDE7A和PDE4B的至少一種的抑制至少加倍。2.權(quán)利要求l定義的組合物，其中所述組合表現(xiàn)出對至少一種其它PDE同種型的抑制.3.權(quán)利要求l定義的組合物，其中所述組合表現(xiàn)出對其它炎癥基因的抑制，所迷其它炎癥基因選自細(xì)胞因子、趁化因子、炎癥介質(zhì)、白細(xì)胞介素、TNF-ot、和基質(zhì)金屬蛋白醉.4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述寡核苷酸化合物針對與PDE7AmRNA100%互補的PDE7A.5.根據(jù)權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述寡核苷酸化合物針對與PDE4BmRNA100°/。互補的PDE4B.6.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，包含針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.IDNos.1-9;而且所述針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.IDNos.27-32.7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項的藥物組合物，其中所述組合物還抑制PDE4D的表達.8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述能夠與PDE4B雜交的寡核苷酸還抑制PDE4D的表達.9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述能夠與PDE4B雜交的寡核苷酸與PDE4D沒有同源性.10.根據(jù)權(quán)利要求l-9的任一項的藥物組合物，其中所述能夠與PDE4B雜交的寡核苷酸與PDE7A沒有同源性，并且，能夠與PDE4B雜交的寡核苷酸與PDE4B沒有同源性.11.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，進一步包含能夠與PDE4D雜交的寡核苷酸.12.權(quán)利要求1-11的任一項的藥物組合物在制備用于治療與cAMP降低相關(guān)疾病的藥物中的用途.13.權(quán)利要求12定義的用途，其中所述疾病是PDE相關(guān)疾病.14，權(quán)利要求1-11的任一項的藥物組合物在制造治療和/或預(yù)防炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病的藥物中的用途.15.制劑，包含權(quán)利要求1-11的任一項的組合物，選自全身性制刑和局部性制刑.16.權(quán)利要求15的制刑，選自口服、類內(nèi)、肺內(nèi)、直腸、子宮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、顱內(nèi)、經(jīng)鼻、肌內(nèi)、皮下、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、可吸入、透皮、皮內(nèi)、腔內(nèi)、可植入、離子電滲、經(jīng)眼、陰道、關(guān)節(jié)內(nèi)、經(jīng)耳、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腺體內(nèi)、器官內(nèi)、淋巴內(nèi)、可植入、緩釋、和腸溶包衣制劑.17.權(quán)利要求16的制刑，它是口服制刑，其中所述栽體選自固體和液體栽體.18.權(quán)利要求1-11的任一項的組合物在制備用于向靶多核普酸遞送藥物組合物的藥物中的用途，所述組合物包含一定量的栽體和寡核香酸化合物，所述量允許組合物達到所迷把PDE核酸.19.權(quán)利要求1-11的任一項的組合物，其中所述寡核苷酸化合物選自反義寡核苷酸、修飾的反義寡核苷酸、siRNA和核酶.20.權(quán)利要求15定義的制刑，用于局部性施用.21.制品，包含包裝材料，所述包裝材料內(nèi)含有權(quán)利要求l-ll的任一項的組合物，所述制品的包裝材料包含標(biāo)簽，標(biāo)簽指示所迷組合物能用于治療所述疾病.22.權(quán)利要求21定義的制品，其中所述標(biāo)簽指示所述組合物用于治療PDE相關(guān)疾病.全文摘要本發(fā)明涉及治療包括炎癥狀況的疾病的寡核苷酸組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及針對編碼磷酸二酯酶(PDE)的基因的治療性反義寡核苷酸以及它們的組合應(yīng)用。這些反義寡核苷酸可以用作分析工具和/或治療患者中與細(xì)胞cAMP降低相關(guān)疾病的治療劑，這些疾病例如呼吸道的炎癥性疾病，包括例如，哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征、支氣管炎、慢性支氣管炎、硅肺病、肺纖維化、肺異體移植排斥、過敏性鼻炎和慢性鼻竇炎以及環(huán)狀A(yù)MP增加或PDE水平降低有益的其它狀況。文檔編號C12Q1/68GK101579529SQ200910139130公開日2009年11月18日申請日期2004年9月29日優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日發(fā)明者H·德安朱,K·澤姆朱米,P·倫齊申請人:托皮根藥品公司