專利名稱：一種制備苯丙氨酸羥化酶的技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備過L-苯丙氨酸脫氫酶的方法，具體而言，本發(fā)明提供了一種 采用基因工程技術(shù)克隆L-苯丙氨酸脫氫酶基因，構(gòu)建其表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得高產(chǎn)量 L-苯丙氨酸脫氫酶的方法。
背景技術(shù)：
苯丙氨酸脫氫酶是Hummel等人于1984年在微生物中首次發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)過二十多 年，許多學(xué)者已經(jīng)從一些細(xì)菌和放線菌中分離得到苯丙氨酸脫氫酶，且產(chǎn)苯丙氨酸脫氫 酶的微生物多屬于好氧的革蘭氏陽性菌，如短桿菌(Brevibacterium sp.)、高溫放線菌 (Thermoactinomyce)，紅線菌(Rhodocaccus sp·)、芽抱桿菌(Bacillus sp.)等。雖然苯丙酮酸是一種理想的底物，但是，PheDH與苯丙酮酸鹽類似物限制了其底物 活性。苯丙酮酸的酶促還原胺化反應(yīng)對于產(chǎn)生光學(xué)純L-高苯丙氨酸非常有用。L-高苯丙氨 酸是一種用于治療高血壓和心力衰竭的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑的組成成分。苯丙 氨酸脫氫酶也用來開發(fā)新生兒篩查苯丙酮尿癥篩查試劑，工業(yè)上還用來生產(chǎn)光學(xué)純L-苯 丙氨酸，L-苯丙氨酸是一種甜味劑阿斯巴甜的組成成分。然而，由于野生菌株產(chǎn)量低，從而引發(fā)研究人員尋求重組DNA技術(shù)以便獲得足夠 數(shù)量的PheDH。大腸桿菌天生缺乏PheDH，通常用作生產(chǎn)外源蛋白的寄主，包括PheDH。苯丙 氨酸脫氫酶通常也通過多級柱狀層析進(jìn)行純化，但是這些純化方法對于實驗?zāi)康亩杂悬c 繁瑣費時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備過L-苯丙氨酸脫氫酶的方法。本發(fā)明利用基因工程手段制備重組L-苯丙氨酸羧化酶，本發(fā)明所制備的L-苯丙 氨酸羧化酶產(chǎn)量高，高活性，生產(chǎn)方法簡便。本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供本方法制得的重組L-苯丙氨酸羧化酶用于生產(chǎn)新生兒 苯丙酮尿癥篩查試劑。本發(fā)明提供的利用基因工程技術(shù)制備L-苯丙氨酸羧化酶的方法，其包含下述步 驟(1)將可編碼的微生物源L-苯丙氨酸羧化酶基因嵌入含合適的表達(dá)載體中構(gòu)建 重組質(zhì)粒；(2)將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；(3)于適合該細(xì)胞表達(dá)L-苯丙氨酸羧化酶的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；(4)純化所表達(dá)的L-苯丙氨酸羧化酶。本發(fā)明提供一種編碼微生物源L-苯丙氨酸羧化酶的分離基因，這些微生物來源 于芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌屬。本發(fā)明也提供包含上述基因的表達(dá)質(zhì)粒。
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本發(fā)明也提供用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物。為了獲得高活性和高純度的苯丙氨酸脫氫酶，本發(fā)明用于基因來源的微生物包括 可以產(chǎn)生L-苯丙氨酸的芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌屬。根據(jù)本發(fā)明，任何上述可以產(chǎn)生L-苯丙氨酸的芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌屬的 微生物都可以用于基因來源。本發(fā)明以公知的方法從上述可以產(chǎn)生L-苯丙氨酸的芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌 屬的微生物提取含有L-苯丙氨酸脫氫酶基因的染色體DNA，并將染色體DNA插入載體構(gòu)建 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并令其表達(dá)而制得。將提取的球形芽孢桿菌源苯丙氨酸脫氫酶基因以公知的方法插入表達(dá)載體中，包 括任何可用于細(xì)菌、酵母、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體。例如pBR、pUC、pET、pPIC等載體，可 根據(jù)需要選用。構(gòu)建完成的表達(dá)載體可轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鞑⑦M(jìn)行表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細(xì)胞包 括大腸桿菌，例如，來源于大腸桿菌K-12的菌株，如JM83、JM102、JM105、JM109、RR1、RB791、 W3110、C600、HB101、DH1 和同類。根據(jù)本發(fā)明，以公知的基因工程方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)來制備L-苯丙氨酸脫氫酶。例 如，用包含L-苯丙氨酸羧化酶基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到預(yù)期水平時，根據(jù)所使用質(zhì)?？刂茀^(qū)域的特性進(jìn)行誘導(dǎo)處理，從而生成 L-苯丙氨酸羧化酶。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞株于適宜該外來質(zhì)粒大量表達(dá)的條件下培養(yǎng)，最后將產(chǎn)物分離純 化。依常法采用硫酸銨沉淀，疏水層析，離子交換層析。為了獲得高活性和高產(chǎn)率的L-苯 丙氨酸羧化酶，本發(fā)明采用了核酸位點親和染料活性藍(lán)4進(jìn)行純化。采用本方法制備的L-苯丙氨酸脫氫酶可用于開發(fā)新生兒苯丙酮尿癥篩查試劑， 也可用來生產(chǎn)L-苯丙氨酸。


圖1和2 質(zhì)粒的構(gòu)建，所有的質(zhì)粒都包含L-苯丙氨酸脫氫酶基因。圖3 質(zhì)粒pETDH的構(gòu)建。
具體實施例方式為使本發(fā)明的內(nèi)容更為明確，以下列非限制實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1制備含有L-苯丙氨酸脫氫酶基因的染色體DNA將球形芽孢桿菌接種下列培養(yǎng)基2g/l L-苯丙氨酸、5g/l K2HP04、10g/l消化蛋 白、lg/lNaCl 和 0. 5g/l MgSO4 · 7Η20，ρΗ7· 0。在 30°C下振蕩培養(yǎng)約 10 小時，直到 0D616 = 1. 1。將菌液離心得到IOg濕菌，并以公知的方法提取染色體DNA，也就是說，將細(xì)菌懸 浮在40ml 緩沖液TEN(IOmM Tris_HCl，pH 7. 6, ImM EDTA和 IOmM NaCl)中，離心、收集細(xì)胞。 然后將收集的細(xì)胞懸浮于20ml緩沖液SET (20%蔗糖，50mM Tris_HCl，pH 7. 6和50mMEDTA) 中，加入IOmg溶菌酶，37°C下溫育30min。顯微鏡確認(rèn)形成菌體后，將IOml緩沖液SET和 0. 25g SDS加入到上述懸浮液中對菌體進(jìn)行裂解。用酚/氯仿提取裂解物，然后用乙醇沉淀法收集DNA。將DNA溶于IOml緩沖液TEN，加入0. 5g RNase，37°C下溫育2小時。加入Img 鏈霉素酶，再在37°C下溫育1小時。 再經(jīng)酚/氯仿提取后，又用乙醇沉淀法收集DNA，真空干燥。將干燥的DNA溶于緩
沖液TEN中，4°C下保存?zhèn)溆谩?實施例2將染色體DNA插入載體中將質(zhì)粒pUC9作為載體，37°C下用Hind III消化10 μ g pUC9。然后，用小牛胸腺磷 酸酶在37°C下處理2小時，再用乙醇處理1小時。將處理后的溶液進(jìn)行瓊脂糖電泳(1% )，利用電洗脫方法從PUC9中分離出2.7kb DNA片段，并用酚/氯仿提取，然后再用乙醇沉淀出載體DNA，并溶于20 μ 1無菌水中。另一方面，如實施例1所述，用50u Hind III在37°C下酶切得到50 μ g染色體 DNA,并用酚/氯仿提取，然后再用乙醇沉淀16小時，將得到的DNA溶入50 μ 1無菌水中。并 將上述0. 5 μ g載體DNA和2 μ g染色體DNA混合，并在ATP和二硫蘇糖醇存在下用T4DNA 連接酶在12. 5°C下處理16小時進(jìn)行連接形成重組質(zhì)粒。根據(jù)公知的方法用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103。實施例3L-苯丙氨酸脫氫酶陽性菌的篩選將上述轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)染到硝酸纖維膜上，待每片硝酸纖維膜達(dá)到500-1000個克 隆的重組子時，將硝酸纖維膜貼在含50 μ g/ml氨芐西林的LB平板上，37°C下培養(yǎng)16小時， 然后用新硝酸纖維膜在37°C下培養(yǎng)3小時進(jìn)行復(fù)染。將硝酸纖維膜浸入裂解液(5mg/ml裂解酶、IOmM Tris-HCl, pH 8. 5，1. 5mM NAD+、 0.8mMINT和0. 32mM吩嗪二甲酯硫酸鹽)中，然后，選擇深紅色的轉(zhuǎn)化子。一個L-苯丙氨酸 脫氫酶陽性菌落大約提供2000個氨芐西林抗性轉(zhuǎn)化子。從L-苯丙氨酸脫氫酶陽性菌落提 取質(zhì)粒，來自于PUC9的重組質(zhì)粒將作為載體，被稱為pBPDHl。實施例4質(zhì)粒pBPDHl的亞克隆得到質(zhì)粒pBPDHlDBL本實施例中，將10 μ g質(zhì)粒pBPDHl用Hind III酶切消化，然后將消化產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳(0.7%)，利用電洗脫方法分離出8kb DNA片段。再將2yg pUC9依次用 Hind III酶切消化，用小牛胸腺磷酸酶處理，再用酚/氯仿提取。然后，將兩種反應(yīng)混合物 混合，用 Elutip-Dcolumn (Schleicher&Schuell 公司)純化，并用乙醇沉淀 DNA。然后，將沉淀溶于T4 連接酶緩沖液(50mM Tris-HCl, pH 7. 4, IOmM MgC12、10mM DTT和ImM ATP)中，并用T4連接酶連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103感受態(tài)細(xì)胞，涂在含50 μ g/ml氨芐西林，0. 3mM IPTG和0. 03% IPTG的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落。從這些菌落中提取質(zhì)粒， 并挑選已將6kb Hind III片段插入到pUC9的Hind III位點上的重組質(zhì)粒。這些重組質(zhì) 粒為 pBPDHl-A。按照上述方法亞克隆，依次由pBPDHl-A得到pBPDHl_BS，由pBPDHl_BS得到 pBPDHl-Dr,由pBPDHl-Dr得到質(zhì)粒pBPDHlDBL和pBPDHlDBR，這兩個質(zhì)粒僅插入DNA片段的 方向不同。然后以公知的方法鑒定出pBPDHlDBL。實施例5表達(dá)質(zhì)粒pETDH的構(gòu)建本實施例中，將10 μ g質(zhì)粒pBPDHlDBL (可以從日本富山縣立大學(xué)生物技術(shù)研 究中心直接購買)用Bam HI酶切消化，然后將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(0.7%)，利用電洗脫方法分離出1.5kb DNA片段。再將2ygpET16b依次用Bam HI酶切消化，用 小牛胸腺磷酸酶處理，再用酚/氯仿提取。然后，將兩種反應(yīng)混合物混合，用Elutip-D column (Schleicher&Schuell 公司)純化，并用乙醇沉淀 DNA。然后，將沉淀溶于T4 連接酶緩沖液(50mM Tris-HCl, pH 7. 4, IOmM MgC12、10mM DTT和ImM ATP)中，并用T4連接酶連接過夜。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (ATCC53323)感受態(tài)細(xì)胞，涂在含50 μ g/ml氨 芐西林，0. 3mM IPTG和0.03% IPTG的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落。從這些 菌落中提取質(zhì)粒，并挑選已將1. 5kb Bam HI片段插入到pET16b的Bam HI位點上的重組質(zhì) 粒。這些重組質(zhì)粒為pETDH。然后用染色終止子測序試劑盒進(jìn)行測序，一旦去確定序列完 整，即可選擇pETDH用來表達(dá)L-苯丙氨酸羧化酶。實施例6pETDH表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和陽性菌株篩選將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到硝酸纖維膜上，待每片硝酸纖維膜達(dá)到200-300個克隆的 重組子時，將硝酸纖維膜浸泡在Iml 10mg/ml裂解液(含IOMm EDTA, Ph6. 0)中，30°C下培 養(yǎng)30min，然后采用煮-凍-煮的方式裂解細(xì)胞。然后，將非變性PAGE的硝酸纖維膜浸泡在 0. IM Tris-HCl 緩沖液(pH 8. 5，含 IOMm L-Phe,0. 4mMNAD+、0. 6mM INT 和 0. 3mM 吩嗪二甲 酯硫酸鹽)。數(shù)分鐘后，發(fā)現(xiàn)非變性PAGE硝酸纖維膜上有明顯的特異性條帶。很顯然，篩選 出陽性菌株，在標(biāo)準(zhǔn)分析條件下可以檢測到無細(xì)胞抽提物中L-苯丙氨酸羧化酶活性。實施例7高表達(dá)活力的陽性重組菌的篩選和L-苯丙氨酸脫氫酶的過量表達(dá)將上述陽性重組菌與原始菌在液體LB培養(yǎng)基(含0. lmg/ml氨芐西林)中37°C下 培養(yǎng)8小時后，將IOml培養(yǎng)液稀釋100倍后得到IL培養(yǎng)液，裝入長頸振蕩培養(yǎng)瓶中，37°C 下振蕩溫育，直到0D600 = 1.0。然后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到冰水浴中，不斷旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。4分鐘 后待培養(yǎng)液冷卻到大約23°C時，加入0. 005mM無菌IPTG誘導(dǎo)T7啟動子，并在23°C下?lián)u菌 培養(yǎng)8小時。將發(fā)酵液在3，500 Xg下離心15min，棄上清，并將細(xì)胞在液態(tài)氮中迅速冷凍， 儲存在_20°C的液氮中備用。實施例8用活性藍(lán)4分離純化表達(dá)產(chǎn)物將約8g濕菌體懸浮于20ml含有l(wèi)mg/ml溶菌酶的緩沖液A(50mM Tris-HCl pH 8. 3,0. ImM EDTA, 5mM 2-硫基乙醇)中，然后室溫放置20分鐘，并用超聲波振蕩降解50分鐘。將懸浮液12，OOOXg 4°C下冷凍離心1小時，收獲上清，并在50°C溫育10分鐘。 用冰冷卻，按照前述方法進(jìn)行再次離心，收獲上清。加入0.3M的(NH4)2SO4，攪拌，置4°C 放置2小時，待沉淀完全后，12，000Xg 4°C下冷凍離心1小時，收獲上清。加入更多的 (NH4)2SO4得到0. 6M的飽和溶液，4°C下緩慢攪動并放置1小時，然后再次離心(12，OOOXg, 1小時，4°C )。將得到的沉淀在4°C下溶解在2ml的緩沖液B (含25mM Tris-HCl, pH 8. 3， 2. 5mM 2-巰基乙醇，0.05mM EDTA)中，然后將得到的溶液用緩沖液B進(jìn)行透析，除去多余的 (NH4)2SO40將30ml預(yù)先用緩沖液B平衡的活性藍(lán)4瓊脂糖漿加入到透析液中，置4°C放置30 分鐘(定期輕微晃動，以讓酶吸附到細(xì)珠上)，用緩沖液B透析三次，并在5000Xg 4°C下離 心20分鐘，再用20ml的緩沖液C (包含IM KCl的緩沖液B)洗脫，并用(NH4) 2S04 (0. 6M飽和 溶液)沉淀，12，OOOXg 4°C下冷凍離心1小時，收獲上清，回收PheDH，并用緩沖液B溶解。
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然后將蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行透析，并上柱于同樣用緩沖液B平衡的活性藍(lán)4瓊脂糖柱 (20 X lcm, 15ml柱床體積)，以緩沖液B洗脫三次(流速15ml/h)，并用15ml緩沖液C將酶 洗脫(流速5ml/h)出來。通過NAD+與L-苯丙氨酸的還原反應(yīng)來確定含有高酶活性的片 段，并結(jié)合SDS-PAGE進(jìn)行分析。實施例9測定L-苯丙氨酸脫氫酶的酶活性本發(fā)明通過NAD+的還原反應(yīng)來檢測表達(dá)的L-苯丙氨酸脫氫酶的酶活性。反應(yīng) 條件為溫度在25°C下，以L-苯丙氨酸作為底物，1.0ml的反應(yīng)混合物包含IOOmM甘氨 酸-KCl-KOH緩沖液(pH 10. 5)，2. 5mM NAD+和IOmML-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸脫氫酶樣 品。為了得到PheDHW Km值和Vmax值，本發(fā)明使用了不同濃度的L-苯丙氨酸和NAD+。還 原氨化反應(yīng)條件為在25°C下，1. Oml反應(yīng)混合液含有IOOmM甘氨酸-KCl-KOH緩沖液(pH 9. 0)，0. ImMNADH, 200mM NH4C1, IOmM苯丙酮酸鈉和L-苯丙氨酸脫氫酶溶液。所有反應(yīng)都在 340nm波長下讀取吸光度。定義催化1 μ mol NADH/min所虛酶量為氧化脫氮反應(yīng)的一個酶 活性單位。利用分光光度法(波長為280nm，吸收系數(shù)/lcm = 6. 3)確定蛋白質(zhì)濃度。同時，本發(fā)明得到的L-苯丙氨酸脫氫酶可以通過上述原理用于新生兒苯丙酮尿 癥篩查。
權(quán)利要求
重組微生物源L 苯丙氨酸脫氫酶的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)將可編碼的微生物源L 苯丙氨酸羧化酶基因嵌入含合適的表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；(2)將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；(3)于適合該細(xì)胞表達(dá)L 苯丙氨酸羧化酶的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；(4)純化所表達(dá)的L 苯丙氨酸羧化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的L-苯丙氨酸羧化酶的來源是微生 物，優(yōu)選的是芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌屬，更優(yōu)選的是球形芽孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌，優(yōu)選的是來源于大 腸桿菌 K-12 的菌株，特別優(yōu)選的是 JM83、JM102、JM105、JM109、RRl、RB791、W3110、C600、 HBlOU DHl 禾口同類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(4)的純化是以硫酸銨沉淀、疏水層析和 離子交換層析，將所表達(dá)的L-苯丙氨酸羧化酶予以純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的疏水層析和離子交換層析中優(yōu)選的親和劑 是核酸位點親和染料，更優(yōu)選的是活性藍(lán)4。
6.一種表達(dá)微生物源L-苯丙氨酸脫氫酶的重組質(zhì)粒，其特征是所述重組質(zhì)粒是采用 基因工程將微生物源L-苯丙氨酸脫氫酶基因嵌入表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其基因來源為是微生物，優(yōu)選的是芽孢桿菌屬和 芽孢八疊球菌屬，更優(yōu)選的是球形芽孢桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其表達(dá)載體選自細(xì)菌、酵母或者昆蟲表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制得的微生物源L-苯丙氨酸羧化酶可用于開發(fā)新生兒 苯丙酮尿癥篩查試劑，也可用來生產(chǎn)L-苯丙氨酸。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及制備重組L-苯丙氨酸羧化酶的方法。具體而言，本發(fā)明將可編碼的微生物源L-苯丙氨酸羧化酶基因嵌入含合適的表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并使用一種簡單有效的親和方法獲得高產(chǎn)量L-苯丙氨酸羧化酶的方法。本發(fā)明所制得的L-苯丙氨酸羧化酶產(chǎn)量高，高活性，生產(chǎn)方法簡便。本發(fā)明亦包括此方法中構(gòu)建的新的重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明制備的L-苯丙氨酸脫氫酶可用于開發(fā)新生兒苯丙酮尿癥篩查試劑，也可用來生產(chǎn)L-苯丙氨酸。
文檔編號C12R1/07GK101899464SQ200910143498
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者王曉華 申請人:北京協(xié)和洛克生物技術(shù)研究開發(fā)中心