專利名稱：一種調節(jié)植物耐低磷脅迫的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域中一個植物耐低磷相關蛋白及其編碼基因與應用和利用該基 因增強植物耐低磷的方法。二、 背景技術盡管土壤中磷元素含量豐富，但是大量的磷是以植物不能直接利用的形式存在， 因此植物經常處于缺磷環(huán)境中。為了提高作物產量，在傳統(tǒng)農業(yè)中往往通過大量施用 磷肥來提高產量和品質，而磷的利用率卻很低， 一般只有10% 25%，將近75 % 卯％積累在土壤中。因此，除傳統(tǒng)的農業(yè)育種外，利用基因工程技術提高作物的耐低磷能 力具有重要的理論與經濟意義，而這項工作的關鍵在于對植物耐低磷分子機理的認識及關鍵 基因的克隆。擬南芥是一種模式植物，廣泛用于植物遺傳學、發(fā)育生物學和分子生物學等研究領域。 擬南芥的大多數(shù)基因在其它植物中都能找到，有關擬南芥的任何發(fā)現(xiàn)都能應用于其它植物研: 究。因此，對擬南芥耐低磷的分子生物學機制的研究對提高作物的耐低磷能力具有重要的 理論與經濟意義。擬南芥基因組已完全測序，根據(jù)擬南芥測序數(shù)據(jù)庫(www.arabidopsis.org) 尋找和發(fā)現(xiàn)新的具有自主知識產權的功能基因是國際植物學研究領域的熱點之一，也是不同 國家之間科技競爭的焦點。擬南芥共有約1.3億個堿基對，2.9萬個基因。目前大部分基因的 功能還不清楚，利用突變技術研究基因功能已成為一種有效的方法。通過對突變體的研究， 發(fā)現(xiàn)了一些耐低磷基因的功能，如AtPTl， AtPAPl， At4， AtPT2， AtACP5等，這些基因在 突變體和野生型中的轉錄水平不一樣。目前，還未找到有效的具有耐低磷功能的基因。面對日益嚴重的農作物缺磷問題，尋找 新的耐低磷功能基因并闡明其功能具有重要的理論及實踐意義。根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫公布的基因組序列，發(fā)現(xiàn)基因MJX《AT4G32810)在植物莖分化中具有調控作用。然而，其在植物耐低磷脅迫中作用未知?；蜣D錄水平分析顯示，在缺磷條件下，其轉錄水平顯著降低。為此， 我們研究了該基因功能，并發(fā)現(xiàn)該基因具有調控植物耐低磷的作用。三、 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種新的植物耐低磷相關蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的植物 耐低磷相關蛋白的編碼基因M4X4，來源于哥倫比亞野生型的擬南芥(Col-O)，其蛋白是具有3下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(1) 序列表中的SEQIDNo: 2;(2) 將序列表中SEQIDNo:2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與植物耐低磷相關的蛋白質。序列表中的序列2由570個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加。M^^的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。 MlW的cDNA基因，選自下述核甘酸序列之一；(1) 序列表中SEQIDNo: 1的DNA序列；(2) 編碼序列表中SEQIDNo: 2蛋白質序列的多核苷酸；(3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo:l限定的DNA序列雜交的核甘酸序列；(4) 與序列表中SEQIDNo: 1限定的DNA序列具有90。/。以上同源性、且編碼相同功能 蛋白質的DNA序列。序列表中的序列1由1960個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'端第82位至1791 位堿基，編碼序列SEQIDNo: 2的蛋白質。含有本發(fā)明M4^/的表達載體，細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增M4X4 中任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用該基因增強植物對低磷耐受性的方法。本發(fā)明所提供的增強植物對低磷耐受性的方法，是抑制植物耐低磷相關蛋白編碼基因 的表達，該表達可通過多種方法實現(xiàn)。本發(fā)明抑制基因表達的方法并不限于上述幾種方法， 只要能抑制M4JW表達即可。利用任何一種植物基因敲除技術，將此基因敲除后，植物表現(xiàn) 為耐低磷性狀；利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的 M4X4轉入植物中，植物就表現(xiàn)出對低磷耐受。本發(fā)明的M4^/基因或其反義核酸在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前 可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及 篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等) 或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉 植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、油菜、玉米、黃瓜、番茄、楊樹或苜宿等。 從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以植物耐低磷癥狀來篩選轉化植株。攜帶有本發(fā)明M4X4基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、 直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織， 并將轉化的植物經組織培育成植株。本發(fā)明的植物耐低磷相關蛋白及其編碼基因為農作物耐低磷育種提供基因與技術支持。下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明。四

圖1為wo^-7、 wo^-S和野生型植株的在正常光照培養(yǎng)條件下生長五周的比較； 圖2為附ox4-7、 max一S和野生型植株的對低磷的耐受性比較(A、 MS對照組和低磷組； B、主根長；C、根冠比)圖3為;maW、 wo^-S和野生型的磷含量比較(A、 MS對照組；B、低磷組) 圖4為m"x4突變體在低磷脅迫下相關基因的表達變化。五具體實施方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。 實施例1、 MAX4及其編碼基因的獲得以野生型哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的幼苗約50-100mg為材料，用Trizol提取其總 RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度。按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Ferrnentas公司)試劑盒說明書，以提取的總RNA為模板，合成cDNA第一條 鏈。以提取出來的第一條鏈cDNA為模板，進行如下PCR反應20pl反應體系，內 含10xPCR緩沖液2 pi, dNTPs (10mM)混合物0.4 pl，引物1和引物2各2 pl， Tag 酶(5U 1) 0.2 pi ， 其余加雙蒸水至20 nl 。 其中，弓l物 1 : 5' -TGCCCTCTTTCCAATACACTG-3'，弓l物2: 5'-AACTGTATCCACCACAATCCG-3'。先 94。C預變性3min，再94。C 30 sec， 54。C30sec， 72 °C 60 sec，共計35個循環(huán)，最后 72'C延伸10min，將獲得的PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳。將PCR得到的cDNA 片段連接于pGEM-T載體，得到含有目的片段的載體pT-MAW，進行測序鑒定，結 果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列SEQ ID No: 1的DNA序列，為 的cDNA基因，由1960個堿基組成，其編碼序列為自5'端第82位堿基到第1791 位堿基，編碼具有序列表中序列SEQIDNo: 2的氨基酸殘基序列的蛋白質。 實施例2、培育對低磷耐受性增強的擬南芥 1、 M4Z4基因被敲除的純合突變體wo^-7、 /wo^-S的獲得從美國擬南芥種質資源中心獲得了兩個T-DNA插入突變體種子(SALK一072708， Awax4-7; SALK—147538， wajc4-S;http:〃www.arabidopsis.org/servlets/TairObject type=germplasm&id=4626493)。為鑒定M4X4 基因被敲除的純合突變體，將SALK—072708和SALK_147538種子種于土培上，提取單 株植株RNA，反轉錄成cDNA后，以cDNA為模板，用下述引物對其進行PCR擴增/wax4-7, 引物lLBbl: 5'誦GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3，引物2: MAX4-7LP5'-AGTACGACGACGTATTGTCCG-3 ，，引物3: MAX4-7RP 5 ，-GGATTGATGCTGCACATATCC -3，；max4-8,引物lLBbl: 5，-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3,引物4: MAX4-8LP 5，-LP AGACAAACCCCATTCATCATG-3',引物5: MAX4-8RP5'-CTCTAGCGTCTCATGGTCGAC-3，。根據(jù)PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，獲得 基因被敲除的純合突變體mo^-7浙附a;^-S。為闡明MJZ4基因功能缺失突變是否會對 發(fā)育產生影響，比較了在正常光照條件下突變體majc一7、 ;wa;^-《和WT生長發(fā)育(圖 1)，發(fā)現(xiàn)在正常土培培養(yǎng)條件下突變體ma;c(7、 max(S與WT的形態(tài)沒有顯著差別， 表明MAW基因功能缺失突變對植株生長發(fā)育沒有產生顯著影響。用該基因的cDNA 序列構建35S強動子的過表達載體并轉化突變體，該轉基因植株形態(tài)上恢復了野生型表型， 在低磷條件下也恢復了野生型植株癥狀，證實了該基因確實控制對低磷耐受性狀。2、 突變體max4-7、 ma^/-S與野生型植株對低磷耐受性比較 將野生型與突變體ma^-7、 wax4-S同時播種于直徑為90mm的平皿中(平皿中分別加有MS和低磷半固體培養(yǎng)基)，4"春化3天后，置于22'C恒溫光照下(光周期為16小時光照， 8小時黑暗)培養(yǎng)。15天后觀察結果。從圖2A可以看出，與野生型相比，突變體max4-7、 表現(xiàn)出了對低磷耐受性的性狀。低磷脅迫條件下突變體ma^-7、 wax4-S的主根長明顯高于 野生型(圖2B)。根冠比測定結果也顯示，在低磷培養(yǎng)條件下，突變體附ax一7、 ma^-S的根 冠比明顯高于野生型(圖2C)。上述結果表明ma^-7、 wax(S耐低磷能力比野生型強。3、 低磷脅迫條件下max4-7、 和野生型植株磷含量比較為進一步確定wax4-7、 /ma:S耐低磷脅迫是否與其體內磷含量有關，測定了在 正常生長和低磷脅迫條件下附ax(7、 max4-S和WT植株根和莖部磷含量。在正常生 長條件下，附w一7、mfl;^-S和WT植株的根部和莖部積累的磷沒有顯著差異(圖3A)。 然而，在低磷脅迫條件下，/m^4-7、 mca(S的根部和莖部積累的磷明顯比WT高(圖 3B)，說明在磷饑餓脅迫時，突變體wax(7、 較WT更好地富集了根周圍的磷，以致突變體植株受到較小的傷害，這與上述表型結果一致。4、附^￥突變體在低磷脅迫下相關基因的表達變化植物對缺磷條件的適應會涉及很多種基因表達調控。為進一步說明突變體 m^4-7、 wax4-S對低磷脅迫耐受的可能分子機理，用RT-PCR的方法檢測了低磷脅迫 條件下磷誘導相關基因的表達(圖4)。 J/S/Zi是植物的一種小SUMOE3連接酶，是 低磷反應的負調控因子，它是一種磷缺乏反應中的關鍵控制因子。從圖4可以看出， 它在低磷誘導下的WT根部中轉錄水平很高，而在突變體中的根部轉錄水平非常低； 在低磷條件下突變體的J"A^/基因表達模式也發(fā)生明顯改變。這些結果進一步說明 突變體wflj^-7、 wm:(S較WT更加對低磷脅迫耐受。序列表1 SEQ ID No:l (Nucleotide S叫uence，Sequence Length (bp) - 1960 )1TGCCCTCTTTCCAATACACTGAAATCCACTTCAAAATATTTATTTAATAA51AAAGAAAAGAAAAGAAAAAAACTCTGCCAGGATGGCTTCTTTGATCACAA101CCAAAGCAATGATGAGTCATCATCATGTTTTGTCGTCAACTAGAATCACT151ACTCTTTATTCCGACAATTCCATCGGCGATCAACAAATAAAAACAAAACC201TCAAGTCCCTCACCGGTTATTTGCTCGGAGGATCTTCGGTGTAACCAGAG251CTGTAATTAATTCAGCGGCACCGTCTCCGTTGCCGGAGAAAGAGAAGGTG301GAAGGTGAGAGACGGTGTCATGTTGCGTGGACAAGTGTACAACAAGAGAA351TTGGGAGGGTGAACTTACTGTCCAAGGAAAGATACCCACTTGGCTGAATG401GTACGTACCTAAGAAACGGTCCTGGTCTATGGAACATTGGAGACCACGAT451TTCCGGCATCTCTTCGACGGCTACTCCACACTCGTCAAGCTTCAATTCGA501TGGCGGTCGTATATTCGCCGCCCACCGTCTCCTTGAATCCGACGCTTACA551AAGCCGCCAAGAAACACAATAGGCTTTGTTACCGTGAATTCTCCGAGACT601CCAAAATCGGTGATCATAAACAAAAACCCTTTCTCCGGGATCGGAGAAAT651CGTCAGGCTTTTCTCCGGAGAGTCTTTAACGGACAACGCCAACACCGGAG701TGATCAAACTCGGTGACGGGCGGGTCATGTGTCTGACGGAGACTCAAAAA751GGATCGATTTTAGTCGACCATGAGACGCTAGAGACGATCGGGAAATTTGA801GTACGACGACGTATTGTCCGATCATATGATCCAATCAGCGCATCCGATAG851TGACGGAGACGGAGATGTGGACGTTGATACCGGATTTGGTTAAACCGGGT901TATCGGGTCGTGAGGATGGAAGCCGGGTCGAATAAAAGAGAGGTTGTGGG951GCGGGTGAGGTGTCGAAGTGGGTCGTGGGGACCCGGTTGGGTCCATTCGT1001TTGCGGTGACGGAGAATTATGTTGTAATACCGGAAATGCCCCTGAGATAT1051TCGGTGAAGAATCTTCTTAGAGCTGAGCCGACGCCACTTTACAAGTTCGA1101GTGGTGTCCCCAAGACGGAGCTTTTMTCATGTCATGTCCAAACTCACCG1151GAGAAGTCGTGGCTAGCGTGGAGGTTCCAGCATACGTAACGTTTCACTTC1201ATAAACGCGTATGAAGAAGATAAAAATGGCGATGGAAAAGCGACGGTCAT1251CATTGCAGATTGTTGTGAACACAACGCCGATACTCGGATACTCGATATGC1301TCCGTCTCGATACCCTACGTTCTTCCCATGGTCACGACGTTTTACCCGAT1351GCTAGGATCGGGAGATTCAGGATACCATTGGACGGGAGCAAATACGGGAA1401ACTAGAGACAGCCGTGGAGGCAGAGAAGCATGGGAGAGCGATGGATATGT1451GCAGCATCAATCCTTTGTATTTGGGTCAAAAATACCGTTACGTTTATGCA1501TGCGGTGCTCAACGACCTTGTAACTTCCCCAATGCTCTCTCCAAGGTTGA1551TATTGTGGAGAAGAAAGTGAAGAACTGGCACGAGCATGGTATGATACCAT1601CTGAACCATTCTTCGTGCCTCGACCCGGTGCAACCCATGAGGATGATGGA1651GTGGTGATATCGATAGTAAGTGAAGAAAATGGAGGAAGCTTTGCAATCTT1701GCTTGATGGGAGCTCCTTTGAAGAAATAGCAAGAGCCAAGTTTCCCTATG1751GCCTTCCTTATGGCTTGCATGGTTGCTGGATCCCCAAAGATTAACTACAA1801AGTCTCAACAAAGATACCTTCATTATACAAAACACAACATATGTATAATT1851AATACCCTCTGTGCAGGTTTTGTAAATTGTTGTCCCTTATM7VTGCTTTT1901TGTCTATATATGTGATGTACAAAACCAAAATAAAAGGAACGGATTGTGGT1951GGATACAGTT8序列表2 SEQIDNo:2MetAlaSerLeulieThrThrLysValLeuSerSerThrArglieThrlieGlyAspGinGin工leLysThrLeuPheAlaArgArgliePheGlySerAlaAlaProSerProLeuProGluArgArgCysHisValAlaTrpTrpGluGlyGluLeuThrValGinAsnGlyThrTyrLeuArgAsnGlyAspHisAspPheArgHisLeuPheLysLeuGinPheAspGlyGlyArgLeuGluSerAspAlaTyrLysAlaCysTyrArgGluPheSerGluThrLysAsnProPheSerGlylieGlyGlyGluSerLeuThrAspAsnAlaGlyAspGlyArgValMetCysLeulieLeuValAspHisGluThrLeuTyrAspAspValLeuSerAspHislieValThrGluThrGluMetTrpLysProGlyTyrArgValValArgArgGluValValGlyArgValArgProGlyTrpValHisSerPheAlalieProGluMetProLeuArgTyrAlaGluProThrProLeuTyrLysGlyAlaPhelieHisValMetSerAlaSerValGluValProAlaTyrAlaTyrGluGluAspLysAsnGlylieAlaAspCysCysGluHisAsnMetLeuArgLeuAspThrLeuArgLeuProAspAlaArglieGlyArgSerLysTyrGlyLysLeuGluThrGlyArgAlaMetAspMetCysSerGinLysTyrArgTyrValTyrAlaAsnPheProAsnAlaLeuSerLysValLysAsnTrpHisGluHisGlyPheValProArgProGlyAlaThrlieSerlieValSerGluGluAsnLeuAspGlySerSerPheGluGluTyrGlyLeuProTyrGlyLeuHisAlaMetMetSerHisHisHis15ThrLeuTyrSerAspAsnSer30LysProGinValProHis Arg45ValThrArgAlaVallieAsn60GluLysGluLysValGlu Gly75ThrSerValGinGinGluAsn90GlyLyslieProThrTrpLeu105ProGlyLeuTrpAsnlieGly120AspGlyTyrSerThrLeuVal135liePheAlaAlaHisArgLeu150AlaLysLysHisAsnArgLeu165ProLysSerVallielieAsn180GlulieValArgLeuPheSer195AsnThrGlyVallieJLysLeu210ThrGluThrGinEysGlySer225GluThrlieGlyLysPheGlu240MetlieGinSerAlaHisPro255ThrLeulieProAspLeuVal270MetGluAlaGlySerAsnLys285CysArgSerGlySerTrpGly300ValThrGluAsnTyrValVal315SerValLysAsnLeuLeuArg330PheGluTrpCysProGinAsp345LysLeuThrGlyGluValVal360ValThrPheHisPhelieAsn375AspGlyLysAlaThrVallie390AlaAspThrArglieLeuAsp405SerSerHisGlyHisAspVal420PheArglieProLeuAspGly435AlaValGluAlaGluEysHis450lieAsnProLeuTyrLeuGly465CysGlyAlaGinArgProCys480ValAsplieValGluLysLys495MetlieProSerGluProPhe510HisGluAspAspGlyValVal525GlyGlySerPheAlalieLeu540lieAlaArgAlaLysPhePro555GlyCysTrplieProLysAsp570
權利要求
1、一種植物耐低磷蛋白，其特征在于氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No2所示。
2、 根據(jù)權利要求l所述的蛋白，其特征在于SEQIDNo: 2的氨基酸殘基序列包括不 超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺少和/或添加。
3、 由權利要求l所述的植物耐低磷蛋白的編碼基因，其特征在于選自下列核苷酸下列 之一(1) 序列表中SEQIDNo: 1的DNA序列；(2) 編碼序列表中SEQIDNo: 2蛋白質序列的多核苷酸。
4、 根據(jù)權利要求3所述的編碼基因，其特征在于在高嚴謹條件下與SEQIDNo: l限定 的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5、 根據(jù)權利要求3所述的編碼基因，其特征在于與SEQIDNo: 1限定的DNA序列具 有90%以上同源性、且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
6、 由權利要求3所述的編碼基因增強植物對低磷耐受性的方法，其特征在于是抑制植 物中耐低磷相關蛋白編碼基因的表達。
7、 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于抑制植物中耐低磷相關蛋白編碼基因表 達的方法包括植物病毒載體介導基因沉默的方法，或者反義核酸技術沉默基因的方法，或者 siRNA介導的基因沉默方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐低磷蛋白及其編碼基因與應用。植物耐低磷蛋白是序列表中SEQ ID No2，其編碼基因是序列表中SEQ ID No1 DNA序列。本發(fā)明利用耐低磷蛋白的編碼基因增強植物耐低磷能力，如抑制植物中上述植物耐低磷相關蛋白的編碼基因的表達，為農作物耐低磷育種提供基因與技術支持。
文檔編號C12N15/82GK101602800SQ20091014414
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月16日 優(yōu)先權日2009年7月16日 公開號200910144143.9
發(fā)明者任永兵, 孫佳佳, 曹樹青, 力 江, 洋 汪, 簡紅勇, 袁懷波, 邊小會, 陳正義 申請人:合肥工業(yè)大學