專利名稱：毛細管電泳中的連續(xù)樣品注射的制作方法
毛細管電泳中的連續(xù)樣品注射
背景技術(shù)：
核酸測序和從測序反應中分離多核苷酸過程的自動化使得多種目的 核酸的快速和大規(guī)才莫測序得以實現(xiàn)。通常，核酸測序通過在測序反應中 摻入標記有焚光基團或染料的鏈終止核苷酸來進行。不同大小的核酸產(chǎn) 物通過凝膠電泳分離，并在自動測序儀上檢測。正在進行的大規(guī)模核酸 測序項目要求核酸測序過程盡可能高效。然而，現(xiàn)有的核酸測序方法受 到電泳步驟的限制。
現(xiàn)有的方法不能使通過自動化電泳技術(shù)分離和檢測的測序多核苷酸
產(chǎn)生的有用數(shù)據(jù)量最大化。使用毛細管電泳一般需要15到40分鐘才能 使樣品中的第一個核酸片段分離，生成峰形式的有用數(shù)據(jù)。沒有有用數(shù) 據(jù)產(chǎn)生的這段起始時間被稱為"樣品死時間"，時間長度隨核酸片段的大小 和電泳進行的條件而異。
另一個對現(xiàn)有的基于毛細管凝膠電泳的多核香酸測序方法產(chǎn)生有用 數(shù)據(jù)的限速因素是，凝膠在每個樣品通過電泳被分離和鑒定后需要沖洗 和替換新的凝膠。在通常的自動化毛細管凝膠電泳系統(tǒng)中，每個完整的 循環(huán)中沖洗步驟需大約10分鐘。因此，電泳運行一次需進行35到150 分鐘，而有用的凄t據(jù)只在該電泳運行的約10到100分鐘內(nèi)收集。
需要降〗氐樣品死時間和提高核酸樣品電泳效率的電泳方法，來使大 規(guī)模核酸測序項目得以更迅速而且全面低成本的進行。
發(fā)明概述
本發(fā)明滿足上述需要。本發(fā)明是進行電泳的方法，其能增加樣品通量并通過提高自動化毛細管凝膠電泳的負載循環(huán)而增加多核苷酸分析的 效率和速度。該方法包括提供毛細管電泳體系。該毛細管電泳體系包括 有上樣端和洗脫端的毛細管電泳凝膠。選擇一個以上的樣品。每個樣品 通常含有不同大小的多核苷酸的混合物，各個多核苷酸有與其大小相應 的電泳遷移率。樣品中最小的多核苷酸有最快的電泳遷移率，而最大的
多核苷酸有最慢的電泳遷移率。第 一 樣品在時刻T 。上樣到凝膠的上樣端， 當進行電泳時在該第一樣品中電泳遷移率最快的多核普酸在時刻TV通過 -險測窗口 ，而電泳遷移率最慢的多核苦酸在Ts時刻之前通過檢測窗口 。 對該第 一樣品進行電泳。第二樣品在(TS-TF)時刻上樣到凝膠的上樣端， 對第二樣品進行電泳以使第 一 樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第二 樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸早通過電泳體系的檢測窗口 。第三樣 品在2(Ts-TF)時刻上樣到凝膠的上樣端，對第三樣品進行電泳以使第二樣 品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第三樣品中電泳遷移率最快的多核苷 酸早通過電泳體系的沖企測窗口 。該方法還包括在n(Ts-IV)時刻連續(xù)上樣另 外的樣品到凝膠的上樣端的步驟，其中n為3-25的整數(shù)。來自各樣品的多 核芬酸當其通過^r測窗口時祐j企測。在一個實施方案中，該方法同時在 一個以上毛細管凝膠中對一個以上樣品進行。
附圖
本發(fā)明的這些特征、方面和優(yōu)勢，結(jié)合下面的說明書、權(quán)利要求書 和附圖將可以更好地理解，其中


圖1測序反應運行的帶有大小從54到294個石威基長度的標記片段的 PCR產(chǎn)物的電泳-潛圖2圖示本發(fā)明實施方案的含復合的數(shù)個樣品運行的單個電泳譜
圖3對圖l所述的PCR產(chǎn)物在一個毛細管中運^f亍的12個連續(xù)注射產(chǎn)生 的電泳i普圖；以及
圖4圖示本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)通常方法相比效率的提高。
發(fā)明詳述下述的討論描述本發(fā)明的實施方案和這些實施方案的一些變體。本 討論不應視為將本發(fā)明限制在這些特定實施方案。本領域的技術(shù)人員還 會認可若干其他的實施方案。在這里描述的所有實施方案中，被指稱為 優(yōu)選或特別優(yōu)選的這些實施方案盡管其可能是優(yōu)選的，但并不是必不可 少的。
本發(fā)明是提高樣品通量和允許更多的樣品在給定的時間段內(nèi)被處理 的電泳方法。該方法的第一步驟是提供帶有電泳凝膠的電泳體系。在優(yōu) 選的實施方案中，電泳凝膠是毛細管凝月交。該毛細管電泳凝膠包括上樣
端和洗脫端。在示例性的實施方案中，毛細管凝膠長度約10cm到約1 OOcm， 凝膠的含量為1 %到10%的聚丙烯酰胺聚合物。
選擇一個以上的樣品。每個樣品通常含有不同大小的多核苷酸，并 具有與多核普酸大小對應的電泳遷移率。樣品中最小的多核苷酸有最快 的電泳遷移率，而最大的多核苷酸有最慢的電泳遷移率。
含多核苷酸的樣品通常包含DNA片段。在優(yōu)選的實施方案中，多核
苷酸是測序反應的產(chǎn)物。在該實施方案中，不同大小的多核苷酸通常通
過測序反應中的鏈終止核苷酸產(chǎn)生。鏈終止核苷酸標記有對各核苷酸特
異的染料或熒光基團。其他的多核苷酸，包括RNA和修飾的核酸也可使
用。通常，DNA片段的長度范圍為約20到約800個核苷酸?；蛘?，樣品還
可以包含其他的生物分子，如蛋白質(zhì)，其能通過電泳被分離。用PCR擴增 子作為模板產(chǎn)生的測序反應產(chǎn)物通過毛細管電泳分離的實例見于圖1 。
本方法的下一步驟是在T。時刻將第 一樣品上樣到凝膠的上樣端。這一 步驟可以通過自動化手段進行，例如包括動電注射。在第二樣品上樣到 凝膠的上樣端之前的預定時刻，對第一樣品進行電泳。第二樣品和所有 后續(xù)樣品的注射時間通常是預知的或在通過在設定的電泳運行條件下試 運行和考慮樣品中多核苷酸大小的差異而預定的，該試驗運行。對第一 樣品進行電泳，第 一樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸在TV時刻通過檢測窗口 ，而第一樣品中電泳遷移率最慢的多核香酸在Ts時刻之前通過檢 測窗口(圖2)。
在第二樣品上樣到凝膠上樣端前的預定時刻，對第 一樣品進行電泳。 第一樣品的多核苦酸向毛細管凝膠的洗脫端遷移，在那里被檢測器檢測。 第二樣品上樣到凝膠的上樣端的步驟在某時刻進行，該時刻使第 一樣品 中遷移率最慢的多核苷酸比第二樣品中遷移率最快的多核苷酸早通過電 泳體系的檢測窗口。對第二樣品進行電泳，以使第一樣品中遷移率最慢 的多核苷酸比第二樣品中遷移率最快的多核苦酸早通過電泳體系的檢測 窗口。在優(yōu)選的實施方案中，第二樣品在(Ts-TF)時刻上樣，或在等同于 (TS-TF)時刻后檢測 一個峰寬的時刻進行，以防止第 一樣品的最后峰和第 二樣品的第一個峰共同遷移。因此，第二樣品通常在(Ts-IV)時刻上樣或 (TS-TF)時刻加等同于檢測 一 個峰寬的時間上樣。等同于檢測 一 個峰寬的 時間根據(jù)樣品和電泳運行條件而異，例如在l-30秒，及更通常的在1-10秒， 及更更通常在l-5秒。這些時間可根據(jù)樣品的大小和運行條件而變化。時 間點T。， TF, Ts等的微小變動是可接受的，只要防止樣品在檢測時重疊的整 體目標沒有被損害。
在優(yōu)選的實施方案中，本方法包括在2(Ts-TF)時刻將第三樣品上樣到 凝膠上樣端的下一步驟。對第三樣品進行電泳，并使第二樣品中遷移率 最慢的多核苷酸比第三樣品中遷移率最快的多核苷酸早通過電泳體系的 ;險測窗口 。
在優(yōu)選的實施方案中，本方法還包括連續(xù)地在n(Ts-TF)時刻上樣另外 的樣品到凝膠的上樣端的其他步驟，其中n是3到25的整數(shù)，(n+l)代表樣 品 數(shù)。通常，n在3到12。
本方法的最后步驟是檢測各樣品的多核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中， 電泳在自動化的系統(tǒng)中進行，如Beckman CEQ 2000 DNA分析系統(tǒng) (Beckman Coulter, Inc., Fullerton)。 Beckman CEQ 2000 DNA分析系統(tǒng)在多核苷酸通過才企測窗口時;f企測多核香酸。第 一樣品的多核普酸的^r測與 第二樣品的多核苦酸的電泳同時進行。類似的，第二樣品的多核香酸的 卩險測與第三樣品的多核苦酸的電泳同時進行。
因此，本發(fā)明的方法消除了第一樣品之外的所有樣品的死時間。這 可以使多個樣品在每個樣品單獨運行所需時間的一^卜部分內(nèi)進行電泳。
在示例性的實施方案中，在同一毛細管電泳凝膠中不經(jīng)沖洗或替換 毛細管凝膠最多可進行總計25次運行，以致同一毛細管聚丙烯酰胺凝膠 可對所有樣品進行電泳。更通常的，12到16個樣品，或8到12個樣品，連 續(xù)地在同一毛細管凝膠中不經(jīng)沖洗或替換毛細管凝膠進行電泳。
在優(yōu)選的實施方案中，在多個毛細管凝膠中對多個樣品同時進行電 泳。該方法包括下列步驟a)提供含毛細管電泳凝膠的電泳體系，凝膠具 有上樣端和洗脫端；b)選擇一種以上的樣品，每個樣品包含不同大小的多 核苷酸，并具有與其大小相對應的電泳遷移率，其中樣品中最小的多核 苷酸電泳遷移率最快而最大的多核普酸電泳遷移率最慢；c)將第一樣品上 樣到凝膠的上樣端；d)對第一樣品進行電泳以分離多核苷酸；在步驟d后， 在某時刻將第二樣品上樣到凝膠的上樣端，該時刻使得第 一 樣品中電泳 遷移率最慢的多核苷酸比第二樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸早通過 電泳體系的檢測窗口 ；及f)對第二樣品進行電泳；g)檢測來自各樣品的多 核苷酸。在示例性實施方案中，電泳體系包括約2到約100個毛細管電泳 凝膠，電泳在2個或更多的毛細管凝膠上同時進行。不過，包含超過IOO 個毛細管電泳凝膠的電泳體系仍屬于本發(fā)明的范圍。
載循環(huán)能降低樣品死時間和提高電泳過程速度和效率的電泳方法。 實施例I
每個毛細管凝膠進行12個連續(xù)樣品注射利用Beckman CEQ 2000 DNA分沖斤系統(tǒng)(Beckman Coulter, Inc., Fullerton)在8個不同的毛細管凝膠上進行電泳。每個毛細管凝膠被連續(xù)上 樣12個由測序反應產(chǎn)生的DNA片段樣品。該片段通過Beckman Coulter染 料標記的雙脫氧-終止子循環(huán)測序試劑盒，零件編號608000，(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)，產(chǎn)生。該模板是從人乳頭瘤病毒產(chǎn)生的294 個堿基對的PCR復制子。
分離介質(zhì)由高分子量的聚丙烯酰胺聚合物的30mM TRIS和100mM TAPS(p-羥基-l，1雙[輕甲基]乙基]氨基)l-丙烷磺酸)緩沖液組成。
樣品以動電方式在2kV下注射到30 cm長的充滿凝月交的毛細管中15 秒，而分離在6kV下進行?？偣?6個樣品在8個毛細管凝膠中分析。 一個 毛細管的電泳譜圖見于圖3。在電泳譜圖上4種核苷酸各自表示為不同顏 色，179分鐘內(nèi)96個樣品被分析和檢測產(chǎn)生大約23，040個被叫堿基(called base){12x8x(294-54)}。該凝膠沒有用新的凝膠替換，且毛細管凝膠在樣 品運行時沒有重新排列。通過常規(guī)的方法進行相似的分析需進行大約432 分鐘。因此，對該樣品而言，本方法只用了現(xiàn)有技術(shù)方法4全測和分析多 核苷酸所需時間的42%。
實施例II
每個凝膠超過12個連續(xù)樣品注射的預計通量增加
圖4顯示圖1和圖3中示例的通量最高達每個毛細管25個連續(xù)樣品注 射的預計增加。利用常規(guī)的方法對n個樣品進行電泳分析的時間量為36n, 其中36是系統(tǒng)預熱時間13分鐘，死時間13分鐘，及樣品時間13分鐘的總 和。總的死時間是23n，其包括每個樣品10分鐘系統(tǒng)預熱時間和13分鐘死 時間。反之，利用本發(fā)明的方法，對每個毛細管樣品而言，隨著運行次 數(shù)增加，死時間和樣品準備時間接近零，而通量時間只為13n。計算的通 量增加因子(TIF)為36N/13N =約2.8。因此，對大量的注射而言，建議 的方法比常規(guī)方法快2.8倍。圖2顯示本發(fā)明方法與常規(guī)方法比較進行多 樣品注射預計的時間。根據(jù)如上描述的本發(fā)明，顯而易見，在不偏離如上所述和如下文權(quán) 利要求所述的本發(fā)明的范圍和本意的情況下可采取很多的修飾和調(diào)整。
盡管本發(fā)明以相當詳細的程度參照其特定的優(yōu)選形式進行了描述， 其他的形式也是可行的。因此權(quán)利要求書的實質(zhì)和范圍不應限于此處描 述的優(yōu)選形式。
在說明書中公開的所有特征，包括權(quán)利要求書、摘要和附圖，及公開的 任何方法中的所有步驟，可以以任何組合方式組合，除了至少一些這樣的特 征和/或步驟是相互排斥的組合之外。除非另有說明，說明書中公開的每個特 征，包括權(quán)利要求書、摘要和附圖可以用實現(xiàn)相同、等同或相似目的的替代 特征替換。因此，除非另有說明，公開的每個特征只是一系列等同或相似特
;[正的一個示例。
權(quán)利要求
1.一種進行電泳的方法，該方法包括下列步驟a)提供含毛細管電泳凝膠的電泳體系，該凝膠具有上樣端和洗脫端；b)選擇一種以上樣品，每個樣品包含不同大小的多核苷酸，并具有與其大小相對應的電泳遷移率，其中樣品中最小的多核苷酸電泳遷移率最快而最大的多核苷酸電泳遷移率最慢；c)在To時刻將第一樣品上樣到凝膠的上樣端，其中當進行電泳時，在該第一樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸在TF時刻通過檢測窗口，而電泳遷移率最慢的多核苷酸在TS時刻之前通過檢測窗口；d)對第一樣品進行電泳；e)第二樣品在(TS-TF)時刻上樣到凝膠的上樣端，對第二樣品進行電泳以使第一樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第二樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸早通過電泳體系的檢測窗口；f)第三樣品在時刻2(TS-TF)上樣到凝膠的上樣端，對第三樣品進行電泳以使第二樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第三樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸早通過電泳體系的檢測窗口；g)在n(TS-TF)時刻連續(xù)上樣更多的樣品到凝膠的上樣端，其中n是4到25的整數(shù)，以及其中對每個樣品進行電泳，以使每個在前樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比每個后續(xù)樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸早通過檢測窗口；和h)當各樣品的多核苷酸通過檢測窗口時進行檢測。
2. —種進行電泳的方法，該方法包括下列步驟a) 提供含毛細管電泳凝膠的電泳體系，該凝膠具有上樣端和洗脫端；b) 選擇一種以上樣品，每個樣品包含不同大小的多核普酸，并具有與其 大小相對應的電泳遷移率，其中樣品中最小的多核苷酸電泳遷移率最快而最 大的多核苷酸電泳遷移率最慢；c) 將第 一樣品上樣到凝膠的上樣端；d) 對第一樣品進行電泳以分離多核苷酸；e) 在步驟d之后，將第二樣品在某時刻上樣到凝膠的上樣端，該時刻使 得第一樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第二樣品中電泳遷移率最快的 多核苷酸早通過電泳體系的檢測窗口 ；f) 對第二樣品進行電泳；g) 檢測每個樣品的多核苷酸。
3. —種進行電泳的方法，該方法包括下列步驟a) 提供含一個以上毛細管電泳凝膠的電泳體系，每個凝膠具有上樣端和 洗脫端；b) 對每個毛細管電泳凝膠選擇一種以上樣品，每個樣品包含不同大小的 多核苷酸，并具有與其大小相對應的電泳遷移率，其中樣品中最小的多核苷 酸電泳遷移率最快而最大的多核苷酸電泳遷移率最l曼；c) 在T。時刻將一個以上第一樣品上樣到一個以上凝膠的上樣端，其中 當進行電泳時，在該第一樣品中電泳遷移率最快的多核苷酸在Tp時刻通過 檢測窗口 ，而電泳遷移率最慢的的多核苷酸在Ts時刻之前通過檢測窗口 。d) 對第 一樣品進行電泳；e) 將一個以上第二樣品在(Ts-TF)時刻上樣到凝膠的上樣端，并對第二樣 品進行電泳，以致第一樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第二樣品中電泳 遷移率最快的多核苷酸早通過電泳體系的才全測窗口 ；f) 第三樣品在2(Ts-TF)時刻上樣到凝膠的上樣端，對第三樣品進行電泳 以使第二樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比第三樣品中電泳遷移率最快 的多核普酸早通過電泳體系的檢測窗口 ；g) 在n(Ts-TF)時刻連續(xù)上樣更多的樣品到凝膠的上樣端，其中n是4到 25的整數(shù)；h) 當各樣品的多核普酸通過檢測窗口時進行4企測。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中對一個以上樣品在一個以上毛細管凝膠中同 時進行電泳。
5. 權(quán)利要求1， 2或3的方法，其中樣品含有包括DNA片段的多核苷酸。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中DNA片段的大小為20到800個核苷酸長。
7. 權(quán)利要求l， 2或3的方法，其中該方法在自動化系統(tǒng)中進行。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中總共有4到16個樣品在同一毛細管電泳凝 膠中連續(xù)進行電泳。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中總共有6到12個樣品在同一毛細管電泳凝 膠中連續(xù)進行電泳。
10. 權(quán)利要求1, 2或3的方法，其中電泳體系還包括2到約100個毛細 管電泳凝膠，且電泳在2個或更多個毛細管凝膠上同時進行。
11. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟f)后該方法還包括單獨且連續(xù)地將3 到12個樣品上樣到凝膠的上樣端，并對各個樣品進行電泳，以致每個在前 的樣品中電泳遷移率最慢的多核苷酸比每個后續(xù)樣品中電泳遷移率最快的 多核苷酸早通過沖全測窗口 。
12. 權(quán)利要求2的方法，其中在第二樣品上樣前對第一樣品的電泳進行 預定的最少時間(TJ。
13. 權(quán)利要求2的方法，其中第二樣品在預定的最少時間(Tx)之后及預 定的最多時間(Ty)之前上樣。
14. 權(quán)利要求2的方法，其中該方法在自動化系統(tǒng)中進行。
全文摘要
本發(fā)明公開一種電泳方法，其能增加樣品通量和提高多核苷酸電泳分析的效率和速度。該方法為在每個毛細管凝膠中上樣和運行多個連續(xù)的樣品，無需在樣品之間進行沖洗或替換凝膠。
文檔編號C12Q1/68GK101581696SQ20091014699
公開日2009年11月18日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月25日
發(fā)明者克拉倫斯·盧, 斯特芬·L·小彭托尼, 楊大偉 申請人:貝克曼考爾特公司