專利名稱：一種可溶表達(dá)的流感病毒血凝素ha2融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種流感病毒的血凝素HA2片 段的蛋白表達(dá)方法，該表達(dá)方法可在真核細(xì)胞如HEK-293系統(tǒng)中獲得可溶性的表達(dá)。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的可致人感冒，發(fā)燒，咽喉腫痛，咳嗽的一種病癥。其中最 具有高致命性的是禽流感的H5和H7亞型。從流感康復(fù)病人身上獲得的抗血清一直是流感 病人的一種重要的治療方式。但由于流感的類型多，每年的變異又很大，抗血清對(duì)新的突 變株的結(jié)合效果很差，這使得流感的針對(duì)性治療無法有效進(jìn)行。對(duì)流感康復(fù)病人的抗血清 分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分的抗血清主要針對(duì)血凝素蛋白(hemagglutinin，簡(jiǎn)稱HA)。凝集素蛋白 是流感病毒的受體結(jié)合和膜融合糖蛋白，也是感染_中和抗體的結(jié)合靶標(biāo)Laver WG等， Virology 1976,69(2) :511_522。它使得病毒與宿主細(xì)胞表面含唾液酸(sialic acid)的 受體貼附，并發(fā)生低PH誘導(dǎo)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，引發(fā)病毒外殼與內(nèi)體膜融合。該構(gòu)象轉(zhuǎn)變的過程 為蛋白酶將血凝素的前體蛋白HAO切割為兩個(gè)二硫鍵連接的HAl和HA2蛋白(lazarowitz. S.等，1975，Virology, 68 =440-454)。HA2亞基的N端有一段高度疏水的區(qū)域，該區(qū)域在不 同類型的流感病毒株中都高度保守，并且參與病毒與宿主受體細(xì)胞膜的融合活性(Lamb. R. A等，1983，Springer-Verlag，Berlin. 21-69)。該區(qū)域發(fā)生突變，病毒的融合活性會(huì)喪失 或很大程度降低(Mary-Jane. G.等，TheJournal of Cell Biology，1986，102 :11_23)。近來有實(shí)驗(yàn)室用康復(fù)病人的血液的B細(xì)胞建立了抗體文庫(kù)，通過大量的篩選找到 了針對(duì)HA2區(qū)域的較廣譜的中和抗體Damian C. Ε.等，Science2009，324 (5924)，246-251 ； Tkacova,M.等，1997，J Clin Microbiol 35，1196-1198，這些抗體可與 HA2 的融合肽或其 附近結(jié)合，抑制HA與細(xì)胞膜的融合功能E. Varekov等，2003，Arch Virol 148,469-486。 這個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)使獲得廣譜的中和抗體成為了可能。因此科學(xué)家都將目光投入到針對(duì)HA2 融合肽的抗體研究和具有交叉保護(hù)的抗流感病毒的疫苗研究工作中。HA蛋白為三聚體結(jié)構(gòu)，分析其晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其表面裸露的大部分蛋白都為HAl的 部分，而HA2蛋白由于其所含的疏水性蛋白較多，它位于蛋白的內(nèi)部。HAl蛋白在季節(jié)性流 感和禽流感等流感亞型病毒中的變異較大，但HA2蛋白卻相對(duì)保守。亞單位疫苗血凝素蛋白(hemagglutinin，簡(jiǎn)稱HA)是一個(gè)很有吸引力的流感病 毒滅活疫苗的替代品，HA蛋白疫苗的制備過程比滅活疫苗更安全，簡(jiǎn)單Treanor JJ等， Vaccine, 2001,19(13-14) :1732_17370，它不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)流感病毒內(nèi)部蛋白的抗體，這可 用于區(qū)分接種和受感染的禽類。由于其保守性和功能性，HA2蛋白亞單位流感疫苗的一個(gè) 很好的選擇有可能使人體產(chǎn)生具有廣譜和交叉保護(hù)的中和抗體，從而避免經(jīng)典流感滅活疫 苗每年需要接種的不利因素，更重要的是，可以使接種人群對(duì)未來不可預(yù)測(cè)的突發(fā)性新型 流感病毒感染具有免疫保護(hù)抗體。HA2蛋白還可以用于免疫動(dòng)物或用于從全人抗體庫(kù)中篩 選獲得針對(duì)HA2保守區(qū)域的具有交叉保護(hù)作用的治療性中和抗體。重組蛋白可以在多個(gè)真核細(xì)胞表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)，也可以采用微生物表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。對(duì)于結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，蛋白翻譯后修飾很少或翻譯后修飾對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和 活性沒有影響的蛋白，可以直接采用微生物表達(dá)體系，如大腸桿菌表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。 對(duì)于結(jié)構(gòu)相對(duì)比較復(fù)雜，蛋白翻譯后修飾很重要的蛋白通常很難采用微生物表達(dá)體系獲 得，而需要采用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。真核細(xì)胞表達(dá)體系包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵 母細(xì)胞，和昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)體系。常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系包括瞬時(shí)表達(dá)體系和穩(wěn)定表達(dá)體系，瞬時(shí)表達(dá)體系 可以采用人HEK293細(xì)胞，或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等，其主要方法是將大量的表達(dá)載體 DNA質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行短時(shí)間內(nèi)的蛋白表達(dá)，大部分DNA質(zhì)粒并未整合到 細(xì)胞的染色體上，因而不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的穩(wěn)定表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)體系是通過篩選DNA質(zhì)粒整合 到細(xì)胞染色體上的穩(wěn)定表達(dá)克隆并建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)。常用的穩(wěn)定表達(dá)宿 主細(xì)胞系有人HEK293細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，BHK細(xì)胞，SP2/0細(xì)胞等。重組蛋白也可以采用酵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，常用的酵母細(xì)胞有畢氏酵母表達(dá)體系 等。酵母細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白在糖基化修飾上存在一定的差 異，但其他翻譯后修飾與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似，所表達(dá)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)也正確，因而很可能具 有較好的生物學(xué)活性。采用商業(yè)化的表達(dá)載體，本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可將一個(gè)在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞體系內(nèi)表達(dá)的重組蛋白實(shí)現(xiàn)在酵母細(xì)胞表達(dá)體系上的表達(dá)和生產(chǎn)。重組蛋白還可以采用昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。常用的昆蟲 細(xì)胞有SF9，SF21，High Five細(xì)胞等。昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)體的重組蛋白與哺乳動(dòng)物 細(xì)胞表達(dá)的蛋白在糖基化修飾上也存在一定的差異，但其他翻譯后修飾與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相 似，所表達(dá)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)也正確，因而很可能具有較好的生物學(xué)活性。采用商業(yè)化的表達(dá) 載體，本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可將一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系內(nèi)表達(dá)的重組蛋白實(shí)現(xiàn)在昆蟲細(xì) 胞/桿狀病毒表體系上的表達(dá)和生產(chǎn)。血凝素蛋白HA蛋白可在真核表達(dá)系統(tǒng)中得到表達(dá)，包括人HEK293細(xì)胞，和昆蟲細(xì) 胞(如 SF9，SF21，High Five 細(xì)胞)/桿狀病毒系統(tǒng)等Dun Jifeng 等，Chinese Journal of Agricultural Biotechnology,2007,4 233-237 ；John Crawford 等，Vaccine,17(18), 4 May 1999，Pages 2265-2274。也有文獻(xiàn)報(bào)道在真核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)血凝素蛋白 HAl蛋白，但由于其N端的強(qiáng)疏水性，在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒/昆蟲細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中很難獲得可溶性的血凝素HA2蛋白。目前還沒有 成功表達(dá)血凝素HA2蛋白片段的文獻(xiàn)報(bào)道。許多文章都是通過合成不一定具有正確結(jié)構(gòu) 的HA2蛋白的多肽來篩選抗體，其獲得有效抗體的工作量也是非常大。Surender K.等， PLoSMedicine,2009，6(4) :e 1000049。本發(fā)明提供了一種可以成功在真核細(xì)胞表達(dá)體系中獲得流感病毒血凝素HA2蛋 白的方法。通過與人或哺乳動(dòng)物的IgG抗體Fc片段融合，可以提高HA2蛋白的表達(dá)水平， 降低融合蛋白的疏水性，從而成功解決了 HA2蛋白不能在真核細(xì)胞獲得可溶表達(dá)的技術(shù)難
點(diǎn)ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可在真核細(xì)胞中表達(dá)的流感病毒血凝素蛋白HA2的 融合蛋白和方法。該融合蛋白的具體結(jié)構(gòu)為Fc融合的HA2，其核苷酸序列為SEQ ID N0!,SEQ ID NO :2，由該核苷酸編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4。在一個(gè)實(shí)施例中，用于融合的是人IgGl的Fc區(qū)域和禽流感病毒H5W的血凝素蛋 白HA2片段。在一個(gè)實(shí)施例中，用于融合的是鼠IgGl的Fc區(qū)域和禽流感病毒H5W的血凝素蛋 白HA2片段。在一個(gè)實(shí)施例中，人和鼠IgGlFc融合蛋白與HA2蛋白之間插入了 EK的酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的實(shí)施例中所采用的人或鼠IgGl抗體的Fc片段可以替換成其他抗體亞 型，如人 IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM,鼠 IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM，或其他動(dòng)物種屬的抗 體Fc片段，如兔，狗，雞，猴，馬，羊等。不同種屬和不同亞型的抗體Fc片段的特性和結(jié)構(gòu)非 常相似，有些種屬的Fc基因還具有非常高的基因同源性。根據(jù)本發(fā)明所公布的方法和實(shí)施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以隨意選擇合適的抗體Fc片段基因，在真核表達(dá)體系中獲得可溶性 的HA2融合蛋白。本發(fā)明的實(shí)施例中所采用的流感病毒血凝素HA2基因片段可以替換成其他抗流 感亞型，如Hmi，H3N2，H7N2, H9N5等。不同種屬和不同亞型的流感病毒血凝素具有同樣的 結(jié)構(gòu)，特性，和功能。根據(jù)本發(fā)明所公布的方法和實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以隨意選擇流 感病毒亞型的HA2片段基因與抗體Fc片段融合后，在真核表達(dá)體系中獲得可溶性的HA2融
合蛋白ο本發(fā)明的實(shí)施例中所公開的血凝素HA2融合蛋白也可以采用酵母表達(dá)體系和昆 蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明所公布的方法和實(shí)施例，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以將融合蛋白的基因插入到相應(yīng)的真核表達(dá)載體中，如HEK293細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá) 體系，CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)體系，酵母表達(dá)載體，桿狀病毒表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)，獲得可 溶性的HA2融合蛋白。


IgGl Fc-HA2純化蛋白的SDS-PAGE圖左圖為鼠IgGl Fc_HA2純化蛋白的 SDS-PAGE圖，右圖為人IgGl Fc-HA2純化蛋白的SDS-PAGE圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、mFc-HA2真核表達(dá)載體的制備(1)鼠IgGl重鏈恒定區(qū)Fc段的制備收集一瓶T25新鮮鼠雜交瘤貼壁細(xì)胞，按BBI公司的classical total RNAisolation kit說明書的操作方案提取雜交瘤細(xì)胞總RNA。按BBI公司的MMLVfirst strand cDNA synthesis kit說明書的操作方案將白細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系 為 Ι μ RNA(2. 7 μ g) ,5Xreaction buffer 4 μ 1，RNase inhibitor (20U/ μ 1) 1 μ 1, dNTP mix (IOmmo 1/L) 2 μ 1, M-MuLV reverse transcriptase 1 μ 1,總反應(yīng)體積為 20 μ 1。根據(jù)已知的鼠IgGl序列設(shè)計(jì)Fc擴(kuò)增的PCR引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增獲得目的基因。PCR引物序列mFc-F 5' CGGGGGTGCACTCCGATGTGCCCAGGGATTC 3‘ (SEQ ID NO 5)
mFc-R 5' CGAGAATTCGACTCTTGTCATCGTCATCTTTACCAGGAGAGTGGGAGAG3‘ (SEQ ID NO 6)PCR 反應(yīng)體系2· 0μ 1 IO^Pyrobest buffer, 1. 6μ 1 2. 5mM dNTP, 1. 4μ 1 10 μ M 鼠 Fc 十亙定區(qū)弓 I 物對(duì)，O. 4μ 1 雜交瘤細(xì)胞 cDNA，0. 2μ 1 5U/μ 1 Pyrobest DNAPolymerase, 反應(yīng)體系為20 μ 1。擴(kuò)增條件變性94°C 4min;變性 94°C lmin，退火 60°C lmin，延伸 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；延伸72 °C 5min。(2)pcDNA3-S_mFc 載體的制備隨機(jī)選取ABI97155. 1登記的抗體所用的信號(hào)肽來用于分泌mouse IgGl Fe。并設(shè) 計(jì)引物合成該段序列，標(biāo)記該片段為S。S-Fl 5' GACGAAGCTTGCCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCC 3' (SEQ ID NO 7)S-Rl 5 ‘ GGAGTGCACCCCCGTGGCTGTGGCGACCAGGAACAGGATGATGCAG 3 ‘ (SEQ ID NO 8)PCR 反應(yīng)體系2· 0 μ 1 10*Pyrobest buffer, 1· 6 μ 1 2. 5mM dNTP, 1· 4 μ 1 10yMS-Fl+S-Rl 恒定區(qū)引物對(duì)，0. 2μ 1 5U/y 1 Pyrobest DNA Polymerase，反應(yīng)體系為 20 μ I。擴(kuò)增條件變性94°C 5min;退火 42°C 5min，延伸 72°C 30min。重疊PCR擴(kuò)增獲得S與mouse Fc片段的連接產(chǎn)物。引物為S-F1和mFc-R。PCR β. M 體 M :20u 1 10氺Pyrobest buffer, 16 μ 1 2. 5mM dNTP, 14 μ 1 10 μ MS-Fl+mFc-R引物對(duì)，4 μ 1雜交瘤細(xì)胞S合成片段，4 μ mFc PCR產(chǎn)物，2 μ 1 5U/ μ IPyrobest DNA Polymerase,反應(yīng)體系為 200 μ 1。擴(kuò)增條件為變性94°C 4min;變性 94°C lmin，退火 42°C lmin，延伸 72°C lmin，5 個(gè)循環(huán)；變性94°C lmin，退火，延伸72 °C 2min，25個(gè)循環(huán)，延伸72 °C 5min。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)薩幕布魯克J等，《分子克隆試 驗(yàn)指南》，北京科學(xué)出版社，重疊PCR產(chǎn)物分別用Hind III和EcoR I (TaKaRa)雙酶切，在 30μ1 體系中加入 3μ1 IOXM buffer，重疊 PCR 純化產(chǎn)物 20 μ 1，Hind III 2 μ 1, EcoR I 3 μ 1，37°C酶切 Ih0 pcDNA3 (Invitrogen)載體也用 Hind III 和 EcoR I 雙酶切，在 30 μ 1 體 系中加入 3μ1 IOXM buffer, pcDNA3 10 μ 1，Hind III 2 μ 1，EcoR I 3 μ 1，37°C 酶切 lh。 用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver. 2. 1試劑盒將酶切后的S_mFc重疊PCR產(chǎn)物插入到酶 切后的PCDNA3中，構(gòu)建為pcDNA3-S-mFc，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后保存。(3) pcDNA3-S-mFc-HA2 表達(dá)載體的制備全基因合成Vietman/1194/2004 的 HA 蛋白基因，PCR 獲得 HA2(347G-531Q)部分， HA2的PCR引物如下HA2-F 5' AGGATTATTTGGAGCTATAGC 3' (SEQ ID NO 9)HA2-R 5' CCTCTCGAGTTCATTGGTAAATTCCTATTGATTC 3' (SEQ IDNO=IO)PCR 反應(yīng)體系10μ1 10*Pyrobest buffer, 8 μ 1 2. 5mM dNTP, 7 μ 1 10yMHA2-F+HA2-R 弓丨物對(duì)，0.5μ1 Vietman/1194/2004 HA 合成基因，Ιμ 5U/ μ IPyrobest DNA Polymerase, 反應(yīng)體系為100 μ 1。擴(kuò)增條件為變性94°C 4min;變性 94°C lmin，退火 55°C lmin，延伸 72°C lmin，
630個(gè)循環(huán)，25個(gè)循環(huán)，延伸72 °C 5min。Xho I 酶切 HA2 PCR產(chǎn)物，在 30 μ 1 體系中加入 3 μ 1 IOXH buffer,ΗΑ2 PCR純化 產(chǎn)物 20 μ 1，Xho I 3μ 1，37°C酶切 lh。pcDNA3-S_mFc 載體也用 PshA I 禾Π Xho I 雙酶切， 在 30μ 1 體系中加入 3μ 1 IOXK buffer, pcDNA3-S-mFc 10 μ 1, PshAI 2 μ l,Xho I 3μ 1, 37°C酶切l(wèi)h。用TaKaRa的DNALigation Kit Ver. 2. 1試劑盒將酶切后的HA2 PCR產(chǎn)物插 入到酶切后的pcDNA3-S-mFc中，構(gòu)建為pcDNA3-S-mFc-HA2，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后保存。實(shí)施例2、mFc-HA2蛋白在HEK-293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)及純化(l)mFc-HA2在HEK-293貼壁細(xì)胞中的小規(guī)模表達(dá)mFc-HA2轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng) 宿主細(xì)胞為293細(xì)胞時(shí)，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法Jordan et al.， Nucleic Acids Res. 1996 24 :4，月旨質(zhì)體 lipofectamine 2000 包裝法(如 Iipofectamine 2000) [Audouy S. et al.，Mol Membr Biol. 2001 18 (2) :129，電穿孔法和顯微注射法Morrison et al.，Science 1985 229:1202。我們采用 PEI (Polyethylenimine) (Cat 23966, Polysciences Inc)轉(zhuǎn)染法，按其使用說明，平行制備1. 6 μ g表達(dá)載體質(zhì)粒和 4. O μ 1 PEI (lug/ul)的混合物，各轉(zhuǎn)染12孔板的一個(gè)孔中8 X IO5個(gè)HEK-293貼壁細(xì)胞，第 7天取樣測(cè)ELISA。(2)mFc-HA2表達(dá)產(chǎn)物的ELISA檢測(cè)兔anti-HA多克隆抗體包被于corning公司的ELISA板上，2 % BSA室溫下封閉 1小時(shí)，加入系列稀釋的mFc-HA2蛋白293表達(dá)產(chǎn)物，室溫結(jié)合2小時(shí)，第二抗體兔抗鼠 IgG(Fab)2/HRP，室溫結(jié)合1小時(shí)，加入TMB底物，室溫反應(yīng)30分鐘，停止反應(yīng)。7天的表達(dá) 量為5mg/L。(3)mFc-HA2的在HEK-293懸浮細(xì)胞中表達(dá)取健康的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293細(xì)胞，離心重懸到自制的S⑶4_4_TC2培養(yǎng)基 中，細(xì)胞密度為ι. ο X IO6細(xì)胞/ml。將細(xì)胞懸液分裝到IL的搖瓶中，每瓶200ml。取0. 75mg 的DNA和2. 25ml的PEI (lmg/ml)，在150mM的溶液中配制成50ml的混合物，加入到5個(gè)IL 搖瓶中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，5 7天后收料IL的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。蛋白表達(dá)過程中可以通過加料 來提高表達(dá)量。⑷ mFc_HA2 的純化無血清條件下在HEK-293懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)IL mFc_HA2。5000rpm離心獲得 細(xì)胞上清液，加入1/3體積的上樣緩沖液(3M Glycine, 1. 5M NaCl，pH9. 0)。Mabselet(GE) 柱經(jīng)平衡緩沖液(1M Glycine，0. 5M NaCl, ρΗ9· 0)平衡10個(gè)柱體積后，以6ml/min的速 度上樣，再用平衡緩沖液洗滌柱子至0D280吸光值降到基線，再加入洗脫緩沖液(IOOmM Glycine, IOmM NaCl, pH 3. 0)，洗脫液立即加入 1/20 體積的 IM Tris pH 8. 0。0D280 檢測(cè) 目標(biāo)蛋白濃度為0. 44mg/ml，總蛋白量為5. 5mg，_80°C凍存。實(shí)施例3、人Fc-HA2真核表達(dá)載體的制備(1)人IgGl重鏈恒定區(qū)Fc段的制備將液氮凍存的人淋巴結(jié)、脾臟、外周血淋巴細(xì)胞混合物在Trizol (Invitrogen)中 研碎，按Trizol說明書上的方法提取總RNA。并按Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶說明書的方法 取2μ g總RNA用200U Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為 15 μ 1 RNA(2 μ g) ,5Xreaction buffer 4 μ 1, RNaseinhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1, dNTP mix(10mmol/L)2y 1, M-MuLV reverse transcriptasel μ 1,20 μ 1。根據(jù)已知的人IgGl序列設(shè)計(jì)Fc擴(kuò)增的PCR引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增獲得目的基因。PCR引物序列Fc-F 5' CGGGGGTGCACTCCGAGCCCAAATCTTCTG 3' (SEQ ID NO 11)Fc-R 5 ‘ CGAGAATTCGACTCTTGTCATCGTCATCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG3 ‘ (SEQ ID NO 12)PCR 反應(yīng)體系2· Ομ 1 10*Pyrobest buffer, 1. 6μ 1 2. 5mM dNTP, 1. 4μ 1 10 μ M 人Fc 十亙定區(qū)弓 I 物對(duì)，O. 4μ 1 雜交瘤細(xì)胞 cDNA，0. 2μ 1 5U/μ 1 Pyrobest DNAPolymerase, 反應(yīng)體系為20 μ 1。擴(kuò)增條件變性94°C 4min;變性 94°C lmin，退火 58°C lmin，延伸 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；延伸72 °C 5min。(2)pcDNA3-S_Fc 載體的制備隨機(jī)選取ABI97155. 1登記的抗體所用的信號(hào)肽來用于分泌mouse IgGl Fe。并設(shè) 計(jì)引物合成該段序列，標(biāo)記該片段為S。S-Fl 5' GACGAAGCTTGCCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCC 3' (SEQ ID NO 7)S-Rl 5 ‘ GGAGTGCACCCCCGTGGCTGTGGCGACCAGGAACAGGATGATGCAG 3 ‘ (SEQ ID NO 8)PCR 反應(yīng)體系2· O μ 1 10*Pyrobest buffer, 1· 6 μ 1 2. 5mM dNTP, 1· 4 μ 1 10yMS-Fl+S-Rl 恒定區(qū)引物對(duì)，0. 2μ 1 5U/y 1 Pyrobest DNA Polymerase，反應(yīng)體系為 20 μ I。擴(kuò)增條件變性94°C 5min;退火 42°C 5min，延伸 72°C 30min。重疊PCR擴(kuò)增獲得S與Fc片段的連接產(chǎn)物。弓丨物為S-Fl和Fc_R。PCR β. M 體 M :20u 1 10氺Pyrobest buffer, 16 μ 1 2. 5mM dNTP, 14 μ 1 10yMS-Fl+Fc-R引物對(duì)，4μ 1雜交瘤細(xì)胞S合成片段，4μ 1 Fc PCR產(chǎn)物，2 μ 1 5U/ μ IPyrobest DNA Polymerase,反應(yīng)體系為 200 μ 1。擴(kuò)增條件為變性94°C 4min;變性 94°C lmin，退火 42°C lmin，延伸 72°C lmin，5 個(gè)循環(huán)；變性94°C lmin，退火，延伸72 °C 2min，25個(gè)循環(huán)，延伸72 °C 5min。重疊PCR產(chǎn)物分別用Hind III和EcoR I (TaKaRa)雙酶切，在30 μ 1體系中加 入 3μ1 IOXM buffer，重疊 PCR 純化產(chǎn)物 20 μ 1，Hind III 2 μ 1, EcoRI 3yl，37°C 酶切 lh。pcDNA3 (Invitrogen)載體也用Hind III和EcoR I雙酶切，在30 μ 1體系中加入3 μ 1 IOXM buffer, pcDNA3 10 μ 1，Hind III 2 μ 1，EcoR I 3 μ 1，37°C酶切 lh。用 TaKaRa 的 DNA Ligation Kit Ver. 2. 1試劑盒將酶切后的S-Fc重疊PCR產(chǎn)物插入到酶切后的pcDNA3 中，構(gòu)建為pcDNA3-S-Fc，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后保存。(3)pcDNA3-S-Fc-HA2 表達(dá)載體的制備全基因合成Vietman/1194/2004 的 HA 蛋白基因，PCR 獲得 HA2(347G-531Q)部分， HA2的PCR引物如下HA2-F 5' AGGATTATTTGGAGCTATAGC 3' (SEQ ID NO 9)
HA2-R 5' CCTCTCGAGTTCATTGGTAAATTCCTATTGATTC 3' (SEQ IDNO=IO)PCR 反應(yīng)體系10μ1 10*Pyrobest buffer, 8 μ 1 2. 5mM dNTP,7y 1 10yMHA2-F+HA2-R 弓丨物對(duì)，0.5μ1 Vietman/1194/2004 HA 合成基因，Ιμ 5U/ μ IPyrobest DNA Polymerase, 反應(yīng)體系為100 μ 1。擴(kuò)增條件為變性94°C 4min;變性 94°C lmin，退火 55°C lmin，延伸 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)，25個(gè)循環(huán)，延伸72 °C 5min。Xho I 酶切 HA2 PCR 產(chǎn)物，在 30 μ 1 體系中加入 3 μ 1 IOXH buffer, HA2 PCR 純 化產(chǎn)物 20yl，Xho I 3 μ 1，37°C酶切 lh。pcDNA3-S_Fc 載體也用 PshA I 和 Xho I 雙酶切， 在 30μ 1 體系中加入 3μ 1 IOXK buffer, pcDNA3-S-Fc 10 μ 1, PshAI 2 μ 1, Xho I 3μ 1, 37°C酶切l(wèi)h。用TaKaRa的DNALigation Kit Ver. 2. 1試劑盒將酶切后的HA2 PCR產(chǎn)物插 入到酶切后的pcDNA3-S-Fc中，構(gòu)建為pcDNA3-S-Fc-HA2，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后保存。實(shí)施例4、Fc-HA2蛋白在HEK-293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)及純化(l)Fc-HA2在HEK-293貼壁細(xì)胞中的小規(guī)模表達(dá)FC-HA2轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。我們 采用 PEI(Polyethylenimine) (Cat =23966, Polysciences Inc)轉(zhuǎn)染法，按其使用說明，平 行制備1.6yg表達(dá)載體質(zhì)粒和4.0μ1 PEI(lug/ul)的混合物，各轉(zhuǎn)染12孔板的一個(gè)孔中 8 X IO5個(gè)HEK-293貼壁細(xì)胞，第7天取樣測(cè)ELISA。(2) Fc-HA2表達(dá)產(chǎn)物的ELISA檢測(cè)兔anti-HA多克隆抗體包被于corning公司的ELISA板上，2% BSA室溫下封 閉1小時(shí)，加入系列稀釋的Fc-HA2蛋白293表達(dá)產(chǎn)物，室溫結(jié)合2小時(shí)，第二抗體兔抗人 IgG(Fab)2/HRP，室溫結(jié)合1小時(shí)，加入TMB底物，室溫反應(yīng)30分鐘，停止反應(yīng)。7天的表達(dá) 量為 6. 5mg/L。(3)Fc_HA2 的純化無血清條件下在HEK-293懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)2L Fc_HA2。5000rpm離心獲得細(xì) 胞上清液。Mabselet(GE)柱經(jīng)平衡緩沖液(50mM Tris, IOOmM NaCl, pH8. 0)平衡10個(gè)柱 體積后，以6ml/min的速度上樣，再用平衡緩沖液洗滌柱子至0D280吸光值降到基線，再加 入洗脫緩沖液(IOOmM Glycine, IOmM NaCl，ρΗ3· 0)，洗脫液立即加入1/20體積的IM Tris ρΗ 8.0。0D280檢測(cè)目標(biāo)蛋白濃度為0. 8me/ml，總蛋白量為10. 5mg，_80°C凍存。序列表<110>北京義翹神州生物技術(shù)有限公司<120> 一種可溶表達(dá)的流感病毒血凝素HA2融合蛋白<141>2009-06-10<160>12<210>1<211>1326<212>DNA<213>人造序列<400>1atgggctgga gctgcatcat cctgttcctg gtggccacag ccacgggggt gcactccgag 60
cccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgagctcctgggg120
ggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacc180
cctgaggtcaCgtgCgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtcaagttcaac240
tggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtac300
aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc360
aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatc420
tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggat480
gagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac540
atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctccc600
gtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg660
tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactac720
acgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagatgacgatgacaaaggattatttgga780
gctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtac840
caccatagcaatgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggca900
atagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtttgag960
gccgttggaagggaatttaacaacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaagatg1020
gaagacgggttcctagatgtctggacttataatgctgaacttctggttctcatggaaaat1080
gagagaactctagactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgacta1140
cagcttagggataatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcataaatgt1200
gataatgaatgtatggaaagtgtaagaaatggaacgtatgactacccgcagtattcagaa1260
gaagcgagactaaaaagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaataggaatttac1320
caatga1326
<210>2
<211>1314
<212>DNA
<213>人造序列
<400>2
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtcgccacagccacgggggtgcactccgat60
gtgcccagggattctggttgtaagccttgcatatgtacggtaccagaagtatcatctgtc120
ttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacg180
tgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagat240
gatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttc300
cgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaa360
tgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctcC3.3.3.3.CC3.3.3.420
ggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaag480
gataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggag540
tggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacaca600
gatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcagga660
aatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagc720
10
ctctcccactctcctggtaaagatgacgatgacaaaggattatttggagctatagcaggt780
tttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaat840
gagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtc900
accaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagg960
gaatttaacaacttagaaaggagaatagag￡1￡Ι ￡1￡1￡10￡1agaagatggaagacgggttc1020
ctagatgtctggacttataatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactcta1080
gactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggat1140
aatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcataaatgtgataatgaatgt1200
atggaaagtgtaagaaatggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcgagacta1260
aaaagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaataggaatttaccaatga1314<210>3<211>441<212>RPT<213>人造序列<400>3MetGlyTrpSerCyslielieLeuPhe LeuValAlaThrAlaThrGlyValHisSer Glu
5101520
ProLysSerSerAspLysThrHisThr CysProProCysProAlaProGluLeuLeu Gly
25303540
GlyProSerValPheLeuPheProPro LysProLysAspThrLeuMetlieSerArg Thr
45505560
ProGluValThrCysValValValAsp ValSerHisGluAspProGluValLysPhe Ash
65707580
TrpTyrValAspGlyValGluValHis AshAlaLysThrLysProArgGluGluGln Tyr
859095100
AsnSerThrTyrArgValValSerVal LeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsn Gly
105110115120
LysGluTyrLysCysLysValSerAsn LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThr lie
125130135140
SerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu ProGlnValTyrThrLeuProProSerArg Asp
145150155160
GluLeuThrLysAsnGlnValSerLeu ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer Asp
165170175180
lieAlaValGluTrp GluSer Asn Gly Gln ProGluAsn AsnTyrLys Thr ThrPro Pro
185190195200
ValLeuAspSerAsp GlySer Phe Phe Leu TyrSer Lys Leu ThrVal Asp Lys Ser Arg205210215220Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr225230235240
ThrGlnLysSer LeuSerLeuSerPro GlyLys AspAspAspAspLysGlyLeuPhe Gly
245250255260
AlaIleAlaGly PhelieGluGlyGly TrpGln GlyMetValAspGlyTrpTyrGly Tyr
265270275280
HisHisSerAsn GluGlnGlySerGly TyrAla AlaAspLysGluSerThrGlnLys Ala
285290295300
IleAspGlyVal ThrAsnLysValAsn SerlielieAspLysMetAsnThrGlnPhe Glu
305310315320
AlaValGlyArg GluPheAsnAsnLeu GluArg ArglieGluAsnLeuAsnLysLys Met
325330335340
GluAspGlyPhe LeuAspValTrpThr TyrAsnAlaGluLeuLeuValLeuMetGlu Asn
345350355360
GluArgThrLeu AspPheHisAspSer AsnValLysAsnLeuTyrAspLysValArg Leu
365370375380
GlnLeuArg Asp AsnAlaLysGluLeu GlyAsnGlyCysPheGluPheTyrHisLys Cys
385390395400
AspAsnGluCys MetGluSerValArg AsnGlyThrTyr AspTyrProGlnTyrSer Glu
405410415420
GluAlaArgLeu LysArgGluGlulie SerGlyValLysLeuGluSerlieGlylie Tyr
425430435440
Gln
441
<210>4
<211>437
<212>RPT
<213>人造序列
<400>4
MetGlyTrp Ser CyslielieLeuPhe LeuValAlaThrAlaThrGlyValHisSer Asp
5101520
ValProArg Asp SerGlyCysLysPro CyslieCysThrValProGluValSerSer Val
25303540
PheliePhePro ProLysProLysAsp ValLeuThrlieThrLeuThrProLysVal Thr
45505560
CysValValVal AsplieSerLysAsp AspProGluValGlnPheSerTrpPheVal Asp
65707580
AspValGluVal HisThrAlaGlnThr GlnProArgGluGluGlnPheAsnSerThr Phe
859095100
ArgSerValSer GluLeuProlieMet HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluPhe Lys
105110115120
CysArgValAsn SerAlaAlaPhePro AlaProlieGluLysThrlieSerLysThr Lys
125130135140
GlyArgProLys AlaProGlnValTyr ThrlieProProProLysGluGlnMetAla Lys
145150155160
AspLysValSer LeuThrCysMetlie ThrAspPhePheProGluAsplieThrVal Glu
165170175180
TrpGlnTrpAsn GlyGlnProAlaGlu AsnTyrLysAsnThrGlnProlieMetAsp Thr
185190195200
AspGlySerTyr PheValTyrSerLys LeuAsnValGlnLysSerAsnTrpGluAla Gly
205210215220
AsnThrPheThr CysSerValLeuHis GluGlyLeuHisAsnHisHisThrGluLys Ser
225230235240
LeuSerHisSer ProGlyLysAspAsp AspAspLysGlyLeuPheGlyAlalieAla Gly
245250255260
PheIleGluGly GlyTrpGlnGlyMet ValAspGlyTrpTyrGlyTyrHisHisSer Asn
265270275280
GluGlnGlySer GlyTyrAlaAlaAsp LysGluSerThrGlnLysAlalieAspGly Val
285290295300
ThrAsnLysVal AsnSerlielieAsp LysMetAsnThrGlnPheGluAlaValGly Arg
305310315320
GluPheAsnAsn LeuGluArg Arglie GluAsnLeuAsnLysLysMetGluAspGly Phe
325330335340
LeuAspValTrp ThrTyrAsn AlaGlu LeuLeuValLeuMetGluAsnGluArgThr Leu
345350355360
AspPheHis Asp SerAsn Val LysAsn Leu Tyr AspLysVal Arg Leu Gln ]Leu Arg Asp
365370375380
AsnAlaLys Glu Leu Gly AsnGly Cys PheGlu Phe TyrHisLys Cys Asp Asn Glu Cys
385390395400
MetGluSer Val Arg Asn GlyThr Tyr AspTyr Pro GlnTyrSer Glu Glu Ala Arg Leu
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LysArg Glu Glu IleSerGly Val Lys Leu 丨GluSerlie Gly lie Tyr Gln
425430435437
<210>5
<211>31
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<213>引物
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<213>引物
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<213>引物
<400>9
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<212>DNA
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<210>12
<211>49
<212>DNA
<213>引物
10
CN<400>12cgagaattcg actcttgtca tcgtcatctt tacccggaga cagggagag 49
權(quán)利要求
一種與抗體Fc片段融合的流感病毒血凝素HA2蛋白，其特征為將抗體的Fc片段融合在流感病毒血凝素HA2蛋白的N端。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，所用的抗體Fc片段為人、鼠、兔或猴的抗體Fc片段。
3.權(quán)利要求2所述的抗體Fc來源于如下種屬的抗體亞型a)人IgGl，IgG2，IgG3 或 IgG4 抗體；b)鼠IgGl，IgG2a，IgG2b 或 IgG3 ；或c)兔IgH抗體。
4.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，所包含的血凝素HA2蛋白來源于A型或B型流感病毒 的血凝素HA蛋白。
5.權(quán)利要求4所述的A型流感病毒包括普通人流感病毒，禽流感病毒和豬流感病毒。
6.權(quán)利要求1所述的融合蛋白所用的連接子為EK酶切位點(diǎn)。
7.權(quán)利要求6所述的連接子包括其他的蛋白酶酶切位點(diǎn)或小片段的柔性多肽。
8.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其核苷酸序列為SEQID NO :1，SEQ ID NO :2，由該核 苷酸編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4。
9.一種流感病毒血凝素HA2蛋白的可溶表達(dá)方法，其特征是通過與一個(gè)具有助溶性的 蛋白或蛋白片段融合后，在真核表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)HA2蛋白的可溶表達(dá)。
10.權(quán)利要求9所述的HA2蛋白的可溶表達(dá)方法，其特征是所采用的表達(dá)體系是哺乳動(dòng) 物細(xì)胞表達(dá)體系，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系和哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)體系。
11.權(quán)利要求10所述的HA2蛋白的可溶表達(dá)方法，其特征是所采用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬 時(shí)表達(dá)體系是人HEK293細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系或CHO細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系。
12.權(quán)利要求10所述的HA2蛋白的可溶表達(dá)方法，其特征是所采用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表 達(dá)體系是CHO細(xì)胞，BHK細(xì)胞，SP2/0細(xì)胞，或HEK293細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)體系。
13.權(quán)利要求9所述的HA2蛋白的可溶表達(dá)方法，其特征是所采用的表達(dá)體系是酵母表 達(dá)體系。
14.權(quán)利要求9所述的HA2蛋白的可溶表達(dá)方法，其特征是所采用的表達(dá)體系是昆蟲細(xì) 胞/桿狀病毒表達(dá)體系，包括SF9，SF21 JPHigh Five昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將流感病毒血凝素HA蛋白中的HA2片段融合表達(dá)的重組蛋白，該融合蛋白表達(dá)結(jié)構(gòu)為在HA2的N端插入人或小鼠IgG的Fc段，并且該融合蛋白可在HEK-293等真核細(xì)胞中獲得可溶性的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101921339SQ20091014765
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者孫春昀, 張延靜, 謝良志 申請(qǐng)人:北京義翹神州生物技術(shù)有限公司