專利名稱：快速提取測定氧化葡萄糖桿菌胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速提取、測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacteroxydans)胞內(nèi) 右旋糖酐糊精酶的方法。
背景技術(shù)：
右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，是一種由葡萄糖單元脫水形成的高分子聚合 物，是世界上最早發(fā)現(xiàn)的微生物多糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是由葡萄糖的a-l，6_鍵首尾脫水 縮合而成的一條線形長分子鏈，在分子結(jié)構(gòu)中含有不同比例的a-l，2、a_l，3及a_l， 4-糖苷鍵的支鏈，分子式為(C6H1(l05)n。右旋糖酐因其安全、無毒、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，被 廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、色譜分析等多個(gè)領(lǐng)域。右旋糖酐膠體液具有擴(kuò)充血容量、維持血壓 的功效，可作為血漿代用品。在食品工業(yè)中，因其具有持水性、粘稠性，作為食品添加劑。在 石油工業(yè)中，右旋糖酐可作為油井鉆泥添加劑。同時(shí)也可應(yīng)用于精細(xì)化工，制成交聯(lián)葡聚糖 凝膠，廣泛應(yīng)用于分子篩色譜技術(shù)。此外，新型的改性右旋糖酐合成酶合成的改性葡聚糖作 為低熱量食品和益生源物質(zhì)受到了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。右旋糖酐的生產(chǎn)有兩種方法微生物直接發(fā)酵法和酶合成法，工業(yè)生產(chǎn)主要以直 接發(fā)酵法為主。直接發(fā)酵法生產(chǎn)葡聚糖時(shí)，產(chǎn)物分子大小難以控制，發(fā)酵后菌體與產(chǎn)品很難 分離，生產(chǎn)中引入的氮、氯等雜質(zhì)，致使右旋糖酐質(zhì)量低，臨床副反應(yīng)多。利用誘導(dǎo)分離出的 葡聚糖合成酶來制備右旋糖酐可以克服這些不足。因此，從特有的微生物中通過分子生物 學(xué)技術(shù)構(gòu)建和篩選的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重點(diǎn)之一。Hehre和Hamilton等在研究中發(fā)現(xiàn)來源于G. oxydans中的某種酶能夠利用麥芽糊 精和淀粉部分水解物合成右旋糖酐，這種酶被命名為右旋糖酐糊精酶(DDase)。該酶可催化 形成只含有a-l，6和a-1，4_糖苷鍵的右旋糖酐，該右旋糖酐與利用腸膜明串珠菌制備的 右旋糖酐相比，粘度和含熱值較低，且具有持水性、粘稠性的特點(diǎn)，作為低熱量食品添加劑， 廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。研究表明，應(yīng)用DDase是一條優(yōu)良的右旋糖酐合成途徑。該種產(chǎn)品 還有許多潛在的應(yīng)用領(lǐng)域亟待開發(fā)，如新型食品添加劑、淀粉基甜味劑、低脂肪食物替代品 等等。近二十年來，人們開始慢慢關(guān)注這種特殊的轉(zhuǎn)糖基酶(DDase)，分別對該酶的特性進(jìn) 行了深入的研究，包括影響產(chǎn)酶的環(huán)境因素、酶的純化、酶的底物特異性以及糖基衍生物的 合成等等。對于氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶的研究也 成為研究熱點(diǎn)，目前對于胞內(nèi)右旋糖酐酶的提取測定方法主要使用超聲波破碎法，由于該 方法每次只能破碎一個(gè)樣品，不但操作時(shí)間長，而且不能對樣品進(jìn)行平行分析，導(dǎo)致結(jié)果平 行性和重復(fù)性差；同時(shí)破碎條件不溫和，導(dǎo)致部分酶失活；因此開發(fā)一種快速的胞內(nèi)右旋 糖酐酶的提取測定方法是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速提取、測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要包括如下步驟A)將氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)發(fā)酵液離心，并使用磷酸緩沖液 洗滌菌體；B)將步驟A獲得的菌體，添加5-25%的甘氨酸+0. 5_5%的Triton X-100對細(xì)胞 進(jìn)行透性化處理；C)將步驟B的細(xì)胞透性化處理液，調(diào)節(jié)pH至pH6. 0-7. 5，進(jìn)行細(xì)胞透性化處理 l_5h，使得細(xì)胞內(nèi)的氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶釋放出來；D)測定胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶轉(zhuǎn)化對硝基苯_ a -D-吡喃葡糖苷(NPG)生成對硝基 苯酚(p-nitrophenol)的酶活。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比的顯著優(yōu)點(diǎn)是胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶提取過程中，細(xì)胞破 壁條件溫和，既能使胞內(nèi)酶盡可能多的釋放出來，又能維持胞內(nèi)酶及系列生化活性物質(zhì)的 穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶的快速提取測定，并且一次性試驗(yàn)處理量大、平行 性好。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)將氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)發(fā)酵液離心，并使用磷酸緩沖 液洗滌菌體；(2)將步驟(1)獲得的菌體，添加15%的甘氨酸+1%的Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行 透性化處理；(3)將步驟⑵的細(xì)胞透性化處理液，調(diào)節(jié)pH至pH6. 0 ；(4)按照步驟(3)，進(jìn)行細(xì)胞透性化處理3h，使得細(xì)胞內(nèi)的氧化葡萄糖桿菌右旋糖 酐糊精酶釋放出來；(5)然后測定胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶轉(zhuǎn)化對硝基苯-a -D-卩比喃葡糖苷(NPG)生成對 硝基苯酚(p-nitrophenol)的酶活。步驟5 為一種常規(guī)的方法，根據(jù) Process Biochemistry 39 (2004) 1299-1304 文獻(xiàn) 報(bào)道的方法作了適當(dāng)修改，簡述如下向L 0. 6mL 2mM 的 p-nitrophenyl-a -D-glucopyranoside (NPG)，7中 液(50mM pH6. 47)的體系中，加入0. 5mL步驟(4)得到的酶提取液，30°C下反應(yīng)30min，然后 加入500 uL 1M碳酸鹽緩沖液(pH10. 83)，測定A410下的吸光值。實(shí)施例2實(shí)施例1中，將步驟2改為添加25%的甘氨酸+0. 5%的Triton X-100對細(xì)胞進(jìn) 行透性化處理。實(shí)施例3實(shí)施例1中，將步驟2改為添加15 %的甘氨酸+1 %的Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行 透性化處理。實(shí)施例4實(shí)施例1中，將步驟2改為添加5%的甘氨酸+5%的Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行透 性化處理。
實(shí)施例5實(shí)施例1中，將步驟3改為調(diào)節(jié)pH至pH6. 5。實(shí)施例6實(shí)施例1中，將步驟3改為調(diào)節(jié)pH至pH7. 0。實(shí)施例7實(shí)施例1中，將步驟3改為調(diào)節(jié)pH至pH7. 5。實(shí)施例8實(shí)施例1中，將步驟4改為進(jìn)行細(xì)胞透性化處理lh，使得細(xì)胞內(nèi)的氧化葡萄糖桿菌 右旋糖酐糊精酶釋放出來。實(shí)施例9實(shí)施例1中，將步驟4改為進(jìn)行細(xì)胞透性化處理5h，使得細(xì)胞內(nèi)的氧化葡萄糖桿菌 右旋糖酐糊精酶釋放出來。
權(quán)利要求
一種快速提取測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶的方法，其主要步驟為A)將氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)發(fā)酵液離心，并使用磷酸緩沖液洗滌菌體；B)將步驟A獲得的菌體用細(xì)胞透性化處理液對細(xì)胞進(jìn)行透性化處理，使得細(xì)胞內(nèi)的氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶釋放出來；C)測定右旋糖酐糊精酶轉(zhuǎn)化對硝基苯 α D 吡喃葡糖苷(NPG)生成對硝基苯酚(p nitrophenol)的酶活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟B的胞透性化處理液為5-25%的甘氨酸 +0. 5-5% 的 Triton X-IOO0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟B的細(xì)胞透性化處理液pH為6.0-7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟B中細(xì)胞透性化處理時(shí)間為1-5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速提取測定氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶的方法，主要步驟包括將氧化葡萄糖桿菌發(fā)酵液離心收集菌體，并用磷酸緩沖液洗滌菌體后，采用適量的甘氨酸+Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行透性化處理，使得細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來，然后測定右旋糖酐糊精酶轉(zhuǎn)化對硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(NPG)生成對硝基苯酚(p-nitrophenol)的酶活。本發(fā)明方法操作簡便、重復(fù)性和平行性好，可用于對氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)胞內(nèi)右旋糖酐糊精酶的快速提取和活性檢測。
文檔編號C12N9/00GK101928698SQ200910148259
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者毛相朝, 王華磊, 王舒, 邢艷瓏, 魏東芝 申請人:青島生物能源與過程研究所