專利名稱：：一種丹參異戊烯焦磷酸異構酶(SmIPPI)基因的分析及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于藥用植物基因工程領域，具體地說，涉及利用cDNA芯片技術克隆一種新的丹參異戊烯焦磷酸異構酶(isopentenyldiphosphateisomerase,IPPI)基因，轉化該基因以提高丹參中二萜類次生代謝產物含量的方法。
背景技術：
：藥用植物有效成分(次生代謝產物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因的產物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將破解藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制，為藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。砲類(te卬eiie)是植物界廣泛存在的一類天然烴類化合物，具有異戊二烯(is叩rene)單元組成的基本骨架，根據(jù)所含異戊二烯數(shù)目的不同，萜類可分為單萜、倍半萜、二萜、三萜等。許多二路類化合物是植物中重要的次生代謝產物之一，藥用植物中很多活性成分如紫杉醇、丹參酮IIA、雷公藤甲、乙素等均為二萜類化合物。藥用植物丹參&/由附服0^/加8§&為一味常用中藥，素有"一味丹參，功同四物"的美稱，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，是眾多復方、保健品的主要成分。丹參中主要含有兩類活性成分脂溶性的二萜醌類化合物和水溶性的酚酸類化合物。萜類化合物生物合成途徑亦稱為類異戊二烯生物合成途徑(isoprenoidbiosynthesispathway),由甲羥戊酸途徑(MVA)和丙酮酸、磷酸甘油醛途徑(MEP)組成。MVA途徑存在于細胞質和線粒體，主要為甾醇、特定的倍半萜和泛醌等提供前體物質MEP途徑位于質體，主要為半萜、單萜、二萜和多萜等提供前體物質。IPPI正是處于MVA和MEP途徑的交匯位置，其功能是催化異戊烯焦磷酸酯(IPP)和甲基丙稀基焦磷酸酯(DMAPP)之間的同分異構化。隨后，IPP和DMAPP之間，以及IPP和DMAPP縮合產生的中間產物間，可以發(fā)生多次聚合反應，最終合成出各種各樣的類異戊二烯類物質。異戊烯焦磷酸異構酶基因的表達水平直接影響萜類合成五碳前體庫的代謝流流向，是下游代謝途徑的總開關(2000)。Kajiwara認為(1997),植物體內的異戊烯焦磷酸異構酶可能是一關鍵性的限速酶，他們將酵母(pharfiarhosozyma)和雨生紅球藻中分離的IPP1cDNA轉入大腸桿菌菌株JM101后番茄紅素產量增加3.6-4.5倍。Sun等(1998)在單細胞綠藻中導入外源IPPI基因，導致細胞中類胡蘿卜素大量累積，并且含量與IPPI基因的表達量正相關。因此，IPPI基因在萜類物質生物合成中是一個重要的調節(jié)因子，它的超量表達，利于代謝流向下游流動，將促進下游相關產物的生物合成。植物中的IPPI，最早是1996年Blanc,V.M.等在伯惠繡衣(Cfor/b'a6rewmO中克隆到，而真正有功能的IPPI是1998年Campbell等在擬南芥中克隆到的。隨后在很多物種中都克隆至UlPPI基因，如橡膠凈對(Wewcf^"ov'7/emly)，j:兩草(Wz'coria"atokcwn),玉米(Zefl/waj^)等。本發(fā)明首次從藥用植物丹參中克隆到了乃參SmIPPI基因片段，采用RACE技術克隆得到其cDNA的全長序列，并對其進行功能鑒定及轉基因操作。本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的丹參異戊烯基轉移酶基因及其氨基酸序列。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種丹參cDNA芯片的制作、雜交、差異基因分析以及功能基因克隆的方法，并提供一種過表達IPPI基因以提高丹參中萜類成分含量的方法。本發(fā)明涉及的丹參cDNA芯片克隆關鍵酶基因、IPTG誘導大腸桿菌原核表達、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、丹參酮類成分提取及含量測定方法用于本發(fā)明，為利用轉基因丹參大規(guī)模生產有效成分奠定了堅實的基礎。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明應用cDNA基因芯片方法從丹參中克隆IPPI基因，檢測茉莉酸甲酯處理后SwIPPI基因的表達情況及丹參酮IlA含量的變化情況；構建含所述DNA分子的大腸桿菌原核表達載體，IPTG誘導原核表達；構建含所述DNA分子的植物過表達載體，用根癌農桿菌介導，將IPPI基因導入丹參并再生出植株；PCR檢測外源目的基因IPPI的整合情況，HPLC測定丹參中二萜類成分含量，篩選獲得二萜類成分含量顯著提高的轉基因丹參植株。本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用cDNA芯片方法獲得丹參異戊烯焦磷酸異構酶(SmIPPI)基因；(2)將SEQIDNo.1基因的cDNA克隆到原核表達載體pET32a的限制性內切酶HindIII和BamHl位點間，得到表達載體，利用CaCl2等方法得到含有該表達載體的大腸桿菌菌株。(3)轉入五.co"BL21(DE3)表達宿主菌采用IPTG誘導表達，表達產物經初步純化后，加入到以IPP或DMAPP為底物的體外酶促反應體系中，取上層乙醚抽提物GC-MS檢測反應產物。結果表明，此異構酶能夠以IPP為底物催化形成DMAPP，也能夠以DMAPP為底物催化形成IPP。從峰面積結果看，此異構酶利用底物的效率不同，更傾向于以IPP為底物向DMAPP方向進行。(4)構建含IPPI基因的植物過表達載體，轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化丹參的含IPPI基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(5)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化丹參，獲得經PCR檢測的轉基因丹參植株；(6)對獲得的轉基因丹參中萜類成分含量進行HPLC測定，篩選獲得丹參酮、隱乃參酮、丹參酮IIA等二萜類成分含量顯著提高的轉基肉丹參植株。結果表明，在過表達SwIPPI基因的轉基因發(fā)根高產株系中二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮I和丹參酮IIA含量比非轉基因對照組分別提高1.4、3.6、2.5、3倍，初步證明SmIPPI基因在丹參次生代謝產物生成過程中具有重要作用。這一結果對于培育高品質的藥用植物品種特別是丹參具有重要的理論及實際意義。本發(fā)明所提供的丹參異戊烯基焦磷酸異構酶(SmIPPI)首次從丹參中克隆制備，填補了從我國藥物植物丹參異戊烯基焦磷酸異構酶基因的空白。利用本發(fā)明可以通過基因工程技術來提高丹參等植物中萜類活性成分丹參酮類物質的含量。轉基因結果顯示，丹參異戊烯基焦磷酸異構酶基因可通過轉基因技術用于提高丹參酮等成分含量的研究和產業(yè)化，尤其可用于中藥材丹參的品質改良，能緩解丹參酮類藥源嚴重匾乏問題，對提高丹參酮類物質產量具有較好的促進作用，具有很好的應用前景。具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1、丹參cDNA芯片的制作1、丹參總RNA的分離和檢測取陜西商洛丹參(5Ww'flM/Wo/rW加Bge)根2g，在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉移至65'C預熱的10mL提取緩沖液中(CTAB(W/V)2%，Tris-HCl(pH8.0)100mmol'L",EDTASSmmol.L-1,NaCl2.0mol.L-1，PVP402%，亞精胺0.5g/L，巰基乙醇2%)，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的10MLiCl，混勻后放置4'C沉淀過夜;7500g離心20分鐘，沉淀用500pLSSTE(SDS0.5%,NaCl1molU1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol,L—1，EDTAlmmol丄1，在65'C溶解5分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，-70"放置2h;4'C13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于lOOpLDEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置于-8(TC冰箱備用。2、cDNA文庫的構建采用mRNA純化試劑盒(QuichprepTMMicromRNAPurificationKit,Pharmacia公司)分離mRNA后，通過在cDNA分子兩端加上EcoRI/NotI接頭，在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化，與表達載體入ZAPExpressPredigestedVector(ZAPExpressPredigestedVectorKit,stratagene公司)連接，然后采用stratagene公司的ZAPExpressPridigestedGigapackCloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)將包裝蛋白在體外包裝連接產物，感染E.coliXU-BlueMRF，構建成cDNA文庫。3、cDNA芯片的制備3.1PCR擴增挑取分離良好的噬菌斑溶于100nLSM緩沖液(Amresco公司)中混勻后作為PCR模板。PCR擴增引物為入ZAPExpress多克隆位點兩側的部分序列M13-20引物5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'，BK反向引物5'-GGAAACAGCTATGACCTTG陽3'。96孔板PCR反應體系，準備如下混合物dNTP(25mmol'L-l)，600pL;Mg2+600|aL，10X緩沖液lOOO^L;Taq(TakaraExTaq，5U'nU1)，40pL;M13-20引物(12.5pmol丄-l)，200pL;BK反向引物(12.5pmol七-l)200pL;高純水補足至10mL。混合均勻后，用排槍分裝至96孔PCR板。然后各加入6pLDNA模板，混合均勻。在ABI9700型基因擴增儀上進行PCR反應，反應條件為94'C預變性3分鐘，然后進行35個循環(huán)，為94°C30s，54°C30s，72°C2分鐘，循環(huán)結束后72'C后延伸5分鐘。取3pL反應產物在含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳在SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。3.2PCR產物純化使用96孔Multiscreenfilterplates(Millipore公司)純化板進行PCR產物的純化。將1.4.1項下瓊脂糖凝膠檢測為單一條帶的PCR產物(lOO^L)轉入純化板中；將純化板放于Millipore的真空裝置上，于15mmHg真空抽濾10分鐘，直至抽干；加入100nL水，15mmHg真空抽濾10分鐘，直至抽干；從真空抽濾裝置上取下PCR純化板，加入40^L(pH8.0左右)的水，將純化板放至搖床上輕搖20~30分鐘重懸DNA;將純化產物吸出，置于酶標板上測定濃度和純度；取lnL純化產物在1.5。/。的瓊脂糖凝膠上電泳檢領j;將純化產物真空干燥。3.3cDNA芯片點制根據(jù)上述測定的濃度差異加入適量50。/。DMSO作為點樣液，調節(jié)濃度至約250ng^L-l后，將樣品轉移至384孔板中準備芯片點制。點樣儀為GeneMachine公司OmniGrid100。點樣參數(shù)為針2X12，X:8000，Y:6000;點間距300microns;點陣13X14;點陣間距500microns;矩陣模式4X12。實施例2、丹參異戊烯焦磷酸異構酶基因的克隆1、實驗材料的準備丹參毛狀根為發(fā)根農桿菌15834直接感染的方式進行Ri-質粒轉化誘導的毛狀根。取6，7-V固體培養(yǎng)基(不含激素)暗藏保存的丹參毛狀根，在無菌條件下將2g濕根接種于裝有200ml無激素的6-7V液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶屮進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)至18d后作為試驗材料。培養(yǎng)條件為25'C，110120rmin"，黑暗條件下培養(yǎng)。2、誘導子的制備和處理酵母提取物(yeastextract,YE)生物誘導子的制備取25g酵母提取物溶于125mL蒸餾水中，加入100mL無水乙醇，置于4'C冰箱靜置4d，傾去上清液，膠狀沉淀溶于125mL蒸餾水中，加入無水乙醇(乙醇含量達80%)二次沉淀，離心，沉淀溶于100mL蒸餾水中，120'C滅菌20min，冷卻后置于4'C冰箱備用。銀離子(Ag+)的制備取AgNO35.096g溶于100mL蒸餾水中，制備得3mmol七-l的Ag+。誘導子處理向培養(yǎng)18d的丹參毛狀根培養(yǎng)基中分別加入誘導子組合YE+Ag+(YE2ml、Ag+66.7ul)進行誘導處理，每個處理3個重復，分別于YE+Ag+處理后不同時期收獲，用吸水紙吸干，各樣本稱取約2g鮮重于液氮速凍后-7(TC保存(提取總RNA)或4(TC干燥至恒重，精密稱量毛狀根的干重用于測定毛狀根中丹參酮IIA的含量。3、誘導子處理后丹參酮IIA的含量變化采用高效液相色譜法測定誘導子處理后丹參酮IIA的含量。取干燥至恒重的丹參毛狀根適量，研碎過40目篩，混勻。取藥材細粉約0.2§，精密稱量，置20mL容量瓶中，加甲醇溶液4mL，精密稱重，超聲處理40min，取出放冷，加甲醇溶液補足至原重，搖勻，靜置，過0.45pm微孔濾膜即得。色譜條件為Waters2695高效液相色譜儀，RP-WatersC18柱(150mmx3.9mm,5—，檢測波長270nm;柱溫30°C，流速1.0m'min"，流動相為0.5%醋酸甲醇(A)禾口0.5。/。醋酸水(B)線性梯度洗脫025min，30°/。60%A;2530min，60%65%A;3050min，65%70%A;5060min，70%80%A;6061min,80%30%A。經過誘導子處理后，丹參酮IIA含量迅速上升，處理后第48h，丹參酮IIAYE+Ag+處理組是對照組的2.1倍，處理后第6d處理組是對照組的5.4倍，處理后第9d，處理組是對照組的6.9倍。結果表明丹參毛狀根經誘導子處理之后，丹參酮類成分在短時間內迅速積累。4、芯片雜交分析根據(jù)上述誘導子處理后丹參酮IIA的變化情況，選用YE+Ag+處理后48h的毛狀根及對照組作為芯片雜交樣品，以對照組(C)為參照，與YE+Ag+(YA)的材料進行雜交，重復兩次，每組均采用正反標記以消除染料的誤差。采用間接標記法進行探針標記，包括雙鏈cDNA合成、T7介導的RNA體外轉錄合成cRNA、隨機引物反轉錄、cDNA用KLENOW酶標記等步驟。(1)雙鏈cDNA合成取5g總RNA，以T7—01igo(dT)15，(5'-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'，V可以是G、C禾口A，上海博亞生物技術有限公司)為引物，用cDNASynthesisKit(TaKaRa公司)合成雙鏈cDNA;雙鏈合成以后用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化。(2)體外轉錄合成cRNA:用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProductionSystem(Promega公司)將雙鏈cDNA進行體外轉錄合成cRNA;然后用RNeasy試劑盒(Qiagen公司)純化。(3)隨機引物反轉錄取2gcRNA，用SuperscriptII反轉錄酶，200U'iliL"(Invitrogen公司)，9RandomPrimer進行反轉錄，反轉錄產物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化。(4)cDNA用KLENOW酶標記取lgcRNA反轉錄產物，用隨機引物進行KLENOW標記，標記產物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化，純化后抽干。標記過程中dATP，dGTP，dTTP使用濃度為120M，dCTP使用濃度為60M，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用濃度為40M。將不同樣品分別用Cy3、cy5(Amersham公司)進行標記，然后溶于30L雜交液中(3><SSC,0.2%SDS，5xDenhart，s,25%甲酰胺)，于42。C雜交過夜。雜交結束后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩干后進行掃描。將不同樣品分別用cy3、cy5(Amersham公司)進行標記，然后溶于30L雜交液中(3xSSC,0.2%SDS,5xDenhart，s，25。/。甲酰胺)，于42。C雜交過夜。雜交結束后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩干后進行掃描。芯片用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀(Capita舊io公司)進行掃描。采用GenePixPro4.0圖像分析軟件(AxonInstruments公司)對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數(shù)字信號；然后對芯片上的數(shù)據(jù)用Lmvess方法進行歸一化；最后用Ttest方法結合兩倍差異的標準來確定差異表達基因。5、差異基因的獲得和分析將每組芯片兩次重復的共同差異基因進行5'單向測序，獲得的EST序列采用Windows系統(tǒng)下的StadenPachage(gap4)(http://staden.sourceforge.net)軟件進行序列前處理以及拼接聚類。去掉載體、接頭以及低質量序列和較短的序列。使用BLASTX(6December2005:BLAST2.2.13released;http:〃www.ncbi.nih.gov/BLAST/)將處理后的EST序列在蛋白質水平上與NCBI非冗余蛋白質數(shù)據(jù)庫(non-redundantproteindatabase)進行同源性比較，結果克隆號為chipl8fD3的基因在YA/C天雜交結果中表現(xiàn)為上調基因，B1ASTX注釋為(isopentenyldiphosphateisomerase,IPPI)基因，命名為丹參異戊烯焦磷酸異構酶(SwIPPI)基因。6、cDNA末端快速擴增(5'-RACE和3'-RACE)采用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司)試劑盒進行擴增5"wIPPI的5'末端和3'末端的擴增，按照說明書進行操作。總RNA用Trizol(Invitrogene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊。以設計的GSP1(5'-CAATTCACAAGCTGACTTAGCC-3')為5'RACE特異引物，進行cDNA5'末端的擴增。PCR條件為94°C5min，94。C30s、68。C30s、72°C2min(35個循環(huán))，72°C7min。擴增得到長約1000bp的特異性cDNA片段。根據(jù)SmIPPI基因片段設計的3'RACE特異引物為GSP2(5'-GGATGATTACTTGTCTGCCTCCTGGG-3')，以GSP2為擴增引物，進行SmlPPIcDNA3'末端的擴增。PCR條件為94°C5min，94°C30s、68°C30s、72°C1.5min(35個循環(huán))，72°C7min。擴增出約400bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara公司)回收目的片段，按pMD19T載體(Takam公司)試劑盒操作手冊將上述片段克隆至pMD19-T載體中，鑒定陽性克隆并測序(北京三博遠志生物有限公司)。通過cDNA雜交所得EST序列和5，-RACE獲得的部分片段測序結果可得到序列表SEQIDNO:1所示的丹參IPPI基因全長cDNA序列，其所推導的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。7、全長cDNA的克隆和測序根據(jù)5'RACE和3'RACE所得到的結果和芯片雜交獲得的Unigene序列，從兩端設計得到鉤取S附IPPI全長cDNA的引物，IPPI-F:5'-GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA-3';IPPI-R:5、-GCGGTGAATGAAGCGGCGAAACGGAGGC-3、；再以5、-RACE-ReadycDNA為模板，進行LA-PCR。瓊脂糖凝膠電泳表明約在1300bp處出現(xiàn)特異片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takam)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T載體中(Takara)，鑒定陽性克隆并進行雙向測序(北京三博遠志生物有限公司)，用于原核表達載體的構建。實施例3、SmIPPI基因的生物信息學分析本發(fā)明涉及的丹參異戊烯焦磷酸異構酶基因全長cDNA的長度為1320bp，編碼序列表中由305個氨基酸殘基組成的蛋白質序列SEQIDNo.2。詳細序列見序列表中的序列1，其中開放讀碼框位于127~1044bp。將丹參全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸同源性檢索，結果表明丹參歸PPI與IPPI同源性介于70.4%(葛根，AAQ84167)至99.1%(煙草，BAB40974)之間，具有高度的同源性，丹參SWIPPI與杠柳(BAC65421),胡黃連(ABO14800)的IPPI同源性也較高，分別為89.8%和88.9%。在IPPI基因有多處氨基酸序列保守區(qū)，均可作為同源PCR克隆的引物設計位點。實施例4、茉莉酸甲酯處理后S附IPPI基因表達與丹參酮IIA含量的分析利用茉莉酸甲酯(lOOmM)處理丹參毛狀根，收集不同時間點的材料用于丹參IPPI基因表達量和丹參酮IIA的含量。IPPI基因表達量采用熒光實時定量PCR。總RNA用Trizol(Invitrogene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊。取lpgRNA模板按RT試劑盒(Takara公司)說明書反轉錄得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABIPrism7000SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,USA)禾卩SYBGREENPCRMasterMix(AppliedBiosystems，UK)試劑盒，以丹參actin基因(GenBank登錄號DQ243702)(引物序列actin-222:5，-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3，，actin-488:5，-AGGAACCACCGATCCAGACA-3，)作為對照，確證不同時間都符合要求而且cDNA的量都相差不多。IPPI基因引物為IPPI正向F5'-3':GCGGTGAATGAAGCGGCGAAACGGAGGC，反向5'-3':TAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG。按94°Cfor5min，(94°Cfor30sec,55。Cfor30secand72°Cfor2min)36cycles,72°C7min的PCR條件進行擴增。結果表明經過MJ處理后，IPPI基因表達水平于24h內迅速升高，之后逐漸降低到對照組水平。經actin內參基因均一化之后，與對照組比較，處理后24h，MJ處理組是同時期對照組的2.1倍，說明丹參毛狀根經茉莉酸甲酯處理后，SwIPPI基因表達水平內迅速升高，從而有利于提高SmIPPI活性，推動代謝流向目的產物丹參酮類成分流動。采用HPLC測定丹參酮IIA含量，色譜條件為Waters2695高效液相色譜儀，Waters2996二極管陣列檢測器，Millennium32工作站，色譜甲醇(天津)；水為三重蒸餾水，氯仿(分析純)，無水乙醇(分析純)，丹參酮IIA(購自北京市藥品檢定所)。RP-WatersCI8(150mmX3.9mm,5tim)柱，檢測波長270nm;柱溫30°C，其流動相條件為流速1.0mL.min—1，流動相為0.5%醋酸甲醇(A)和0.5。/。醋酸水(B)線性梯度洗脫0~25min，30%60%A;2530min，60%65%A;3050min，65%70%A;5060min，70%80%A;60~61min，80%30%A。在該色譜條件下對丹參毛狀根中丹參酮IIA進行含量測定。結果顯示經過MJ處理后5d，丹參酮類成分含量迅速上升，處理后第5d，丹參酮IIA成分是對照組的2.1倍，處理后第10d，丹參酮IIA成分含量是對照組的6.3倍；處理后第15d，丹參酮IIA成分含量是對照組的6.9倍。結果表明丹參毛狀根經茉莉酸甲酯處理后，丹參IPPI基因表達量能被顯著的誘導表達，且伴隨丹參酮IIA的迅速積累。由上推測所得到的丹參IPPI基因為丹參酮類成分生物合成途徑的關鍵酶基因。實施例5、S/nlPPI基因原核表達分析1、大腸桿菌表達載體的構建依據(jù)丹參IPPI基因全長cDNA序列(SEQIDNO.l)的ORF，設計擴增完整開放閱讀框的引物，分別在正、反向引物上分別引入限制性酶切位點Hindin和BamHI。以全長cDNA片段為模板，經PCR擴增后，保證丹參IPPI基因的閱讀框完全正確，并用Hindlll和BamHI內切酶進行酶切反應，回收目的片段；大腸桿菌表達載體pET32a用HindIII和BamHI內切酶進行酶切反應，回收目的片段。將經酶切的丹參IPPI基因的目的片段克隆至酶切過的pET32a表達載體上，轉化大腸桿菌BL21，進行重組子的PCR鑒定和酶切鑒定。2、蛋白表達的誘導挑取蛋白接種于2mL的LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，于37X:振蕩培養(yǎng)過夜。次閂按l:IOO稀釋加入到50mLLB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD,為0.3-0.5，加入IPTG至終濃度0.5mM,誘導目標蛋白表達，繼續(xù)于37'C搖床培養(yǎng)3-4小時。當細菌培養(yǎng)至OD600為1.0時，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液(5Ommol/LPBS,pH7.2)重懸，冰上超聲破碎，SDS-PAGE電泳檢測總蛋白和可溶解蛋白。3、丹參異戊烯焦磷酸異構酶活性的分析取經N產-瓊脂糖柱純化的菌液蛋白10ug，加入100uL反應體系(10Ommol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0，含5mmol/LMgC12，20ugIPP或DMAPP，1Ommol/L巰基乙醇)，37。C反應12h。在反應體系中加入100ul100mmol/LTrisHC1(pH9.5)，然后加入堿性磷酸酶(1U)，37'C反應12h。加入200ul乙醚，充分渦旋振蕩后10000r/min離心，取上層乙醚抽提物GC-MS檢測反應產物。結果表明，此異構酶能夠以IPP為底物催化形成DMAPP，也能夠以DMAPP為底物催化形成IPP。從峰面積結果看，此異構酶利用底物的效率不同，更傾向于以IPP為底物向DMAPP方向進行。實施例6、根癌農桿菌介導IPPI基因遺傳轉化丹參獲得轉基因丹參植株1.Gateway過表達載體的構建設計擴S附IPPI基因全長的引物(SwIPPI-Bl:TAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG;SwIPPI-B2:GCGGTGAATGAAGCGGCGAAACGGAGGC)。應用高保真酶進行PCR，將產物切膠回收。BP反應<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>A.反應體系置25度溫育12小時(PCR儀)，B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度溫育10分鐘，終.lhBP反應。C.將BP反應產物經過DH5a克隆D.含40ug/mlkan(卡那霉素)LB培養(yǎng)板上過夜，PCR驗證，測序驗證，提質粒。LR反應<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>A.反應體系置25度溫育12小時(PCR儀)，B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度溫育10分鐘，終止BP反應。C.將BP反應產物經過DH5ot克隆D.含50ug/mlSpe(壯觀霉素)LB培養(yǎng)板上過夜，PCR驗證，測序驗證。提質粒并通過電擊轉化的方法轉入農桿菌中。2、根癌農桿菌ACCC10060介導基因轉化丹參2.1外植體預培養(yǎng)選取10d的丹參無菌苗，將葉片剪成0.5X0.5cn^的小塊，用刀將葉表面劃傷，以背面向上方式將葉片置于MS固體培養(yǎng)基上，于25。C光照16h，黑暗8h條件下預培養(yǎng)2d。2.2農桿菌活化擴增4'C保存的平板上挑取單菌落于新的含50mg/LRif和80mg/LSpe的YEB培養(yǎng)基上，劃線，挑取單菌落接種于15ml含50mg/LRif和80mg/LSpe的YEB液體培養(yǎng)基中，于28振蕩培養(yǎng)至OD26o0.5左右(250rpm，23h)，保菌，將菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心10min，棄上清，用等體積的MS液體培養(yǎng)基重懸沉淀菌體，用于侵染。2.3侵染及共培養(yǎng)將預培養(yǎng)材料放入MS重懸液中，侵染10min，取出外植體，用無菌濾紙吸去菌液，放入新的MS固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)48-72h。2.4選擇培養(yǎng)將共培養(yǎng)的外植體用無菌水清洗3次，400mg/Lcef水浸泡5min左右，無菌水清洗1次，吸干水分后移入含2mg/LHyg和400mg/Lcef的MS同體培養(yǎng)基匕與黑暗中進行篩選培養(yǎng)。每7天更換一次培養(yǎng)基，選擇生長迅速至2-3cm的抗性毛狀根，將其切下，單獨標號轉入2mg/LHyg和400mg/Lcef的MS培養(yǎng)基上，將除菌后的陽性根轉入2mg/LHyg的MS培養(yǎng)基繼代。2.5進一步篩選確定毛狀根經過綠色熒光顯微鏡檢測(GFP)，再經過特異引物PCR檢測目的基因是否插入植物基因組，選擇陽性株系進行放大培養(yǎng)(6,7-V培養(yǎng)基)。實施例7、轉基因丹參植株的PCR檢測根據(jù)SEQIDNo.l基因的ORF序列設計SwIPPI基因的雙向引物對目的基因進行檢測。結果表明，轉IPPI丹參株系在910bp左右處擴增出特異DNA片段，而以非轉化丹參基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化丹參的含IPPI基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化丹參，獲得經PCR檢測的轉基因丹參植株。實施例8、轉基因丹參中丹參酮類成分成分含量測定生長45d的丹參毛狀根37'C干燥，研磨成粉，100mg加4ml甲醇，4'C浸泡過夜，超聲30min，離心(3000rpm，3min)，上清取出液氮吹干，加入lml甲醇復溶，過0.22um濾膜。采用HPLC測定二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮I和丹參酮IIA含量，色譜條件為Waters2695高效液相色譜儀，Waters2996二極管陣列檢測器，Millennium32工作站，色譜甲醇(天津)；水為三重蒸餾水，氯仿(分析純)，無水乙醇(分析純)，二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮I和丹參酮nA(購自北京市藥品檢定所)。RP-WatersC18(150mmX3.9mm,5um)柱，檢測波長270nm;柱溫30°C，其流動相條件為流速L0mL.min"，流動相為0.5%醋酸甲醇(A)和0.5。/。醋酸水(B)線性梯度洗脫0~25min，30%60%A;2530min，60%65%A;3050min，65%70%A;5060min，70%80%A;60~61min，80%30%A。結果表明，在過表達SmIPPI基因的轉基因發(fā)根高產株系中二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮I和丹參酮IIA含量比非轉基因對照組分別提高1.4、3.6、2.5、3倍。結果證明，丹參SmIPPI基因對促進丹參酮類含量的提高有明顯作用，SmIPPI基因可用于利用轉基因技術來提高丹參酮含量的研究和產業(yè)化中，具有很好的應用前景。序列表〈110〉中國中醫(yī)科學院中藥研究所〈120〉一種丹參異戊烯焦磷酸異構酶基因(SMPPI)基因的分析及應用〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉1320〈212〉DNA〈213〉丹參(SaJK^g#_z7〃arr/^'^3Bge.)〈220〉〈221〉CDS〈222〉(127),，(1044)〈400〉1atcctctagagattctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagta60cgcggggacct犯aaagagcccagtattaaaaatgccataaatttccattaa^taagaaa120agaaaaatgtcgtccttgaccagcatcccgtttcaaaaattgttggctgcatccgctgca180gctgcttcttcttcttcttcatcgatttctccgctcaaatctctccttttaaagcccact240tcttgtagagcccttttccatcccaaacccaacgccgccgctaccccttttggcctccgt300ttcgccgcttcattcaccgccgctacctcaaccatgggtgacgtcgccgccgccgattcc360gccatggacgccgttcagaggcgcctcatgtttgaagacgaatgcatattggttgatgag420aatgatcacgttgttggccatgaatccaagtacaattgtc已tctgatggaaaagattgag480gctctaaatctgttgcacggagctttcagtgtcttcctgtttaactcaaaatacgagtta540ttgcttcagcaacgatccacaactaaggttacttttccgttggtgtggacaaacacttgc600tgcagtcatccactataccgagattctgagcttattgaagagaatgctcttggtgtgagg660aatgctgctcagaggaagctgttggatgaactcggcatccctgctgaagatgtcccagtc720gatcagtttgttcctttggggcgtatgctgtacaaggccccgtcagatggaaaatgggga780gagcatgaattggattatctcctattcattgtccgggatgtgagcgtgcatccaaatcca840gacgaagtgcacgatgtgaaatatgtgaaccgggaggagctga已agagcttctacgga已g900gc卿tgccggtgaggggggcttg犯gctatcgccgtggttc卿ttagtggtggacaac960ttcttgttcaagtggtgggaccacgtcgagaaagggacgataaaggaagctgttgacatg1020aagacaattcacaagctgacttagaaatgaagtagtaatgtctgatttcatttcaacttg1080tgtcattttatcatattcagttgtttgaaactgatcaaacttggttgccaaataggggtg1140ttgttgacgccggtaagtttgaatcgtgttgcaaattcaatttgctcttggtggtgaatt1200ttggcaggccttctaagtttaggtatatctccttgtctttgtttgatgtggtcagttttt1260gttgtggctttgaaataaaatttattgttacctgtcgaaaaagcggccgcgaattcaaaa1320〈210〉2<211〉305〈212〉PRT<213>丹參(5^is組"。r/toaBge.)<400>2Met.SerSerLeuThrSerlieProPheGinLysLeuLeuAlaAlaSer151015AlaAlaAlaAlaSerSerSerSerSerSerlieSerProLeuLysSer202530LeuLeuLeuLysProThrSerCysArgAlaLeuPheHisProLysPro354045AsnAlaAlaAlaThrProPheGlyLeuArgPheAlaAlaSerPheThr505560AlaAlaThrSerThrMetGlyAspValAlaAlaAlaAspSerAlaMet65707580AspAlaValGinArgArgLeuMetPheGluAspGluCyslieLeuVal859095AspGluAsnAspHisValValGlyHisGluSerLysTyrAsnCysHis100105110LeuMetGluLyslieGluAlaLeuAsnLeuLeuHisGlyAlaPheSer115120125ValPheLeuPheAsnSerLysTyrGluLeuLeuLeuGinGinArgSer130135140ThrThrLysValThrPheProLeuValTrpThrAsnCysCysSer145150155160HisProLeuTyrArgAspSerGluLeulieGluGluAsnAlaLeuGly165170175ValArgAsnAlaAlaGinArgLysLeuLeuAspGluLeuGlyliePro180185190AlaGluAspValProValAspGinPheValProLeuGlyArgMetLeu195200205TyrLysAlaProSerAspGlyLysTrpGlyGluHisGluLeuAspTyr210215220LeuLeuPhelieValArgAspValSerValHisProAsnProAspGlu225230235240ValHisAspValLysTyrValAsnArgGluGluLeuLysGluLeuLeu245250255ArgLysAlaAspAlaGlyGluGlyGlyLeuLysLeuSerProTrpPhe260265270ArgLeuValValAspAsnPheLeuPheLysTrpTrpAspHisValGlu275280285LysGlyThrlieLysGluAlaValAspMetLysThrlieHisLysUu290295300Thr30權利要求1、本發(fā)明所提供的丹參異戊烯基焦磷酸異構酶基因(SmIPPI)，為下列核苷酸序列之一序列表中SEQIDNo.1的DNA序列。其特征在于該基因的讀碼框位于127-1044位核苷酸；與序列表中SEQIDNo.1限定的DNA序列具有一個或幾個堿基突變，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。2、該基因所編碼的蛋白質為丹參異戊烯基焦磷酸異構酶(SmIPPI)，是以下核苷酸序列之一具有序列表中SEQIDNo.2的氨基酸殘基序列。其特征在于序列表中SEQIDNo.2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代且具有序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。3、含有權利要求1所述基因全序列或部分片段的重組載體。4、含有權利要求1所述基因全序列或部分片段的宿主細胞。5、含有權利要求l所述基因的轉基因細胞系。6、權利要求l所述基因在丹參藥材鑒定及育種中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種丹參異戊烯焦磷酸異構酶(IPPI)基因及其編碼的蛋白酶與用途，該基因為首次利用cDNA芯片技術從丹參中克隆而得，填補了從我國傳統(tǒng)名貴中藥材丹參中分離克隆SmIPPI基因的空白。本發(fā)明所提供的SmIPPI基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的SmIPPI基因可以應用于生物技術方法提高丹參中二萜類活性成分的含量、利用轉基因技術提高丹參酮類物質含量的研究和產業(yè)化、有助于丹參藥材的品質改良及選育等，具有良好的應用前景。文檔編號C12N15/61GK101654678SQ20091014859公開日2010年2月24日申請日期2009年6月30日優(yōu)先權日2009年6月30日發(fā)明者崔光紅,張夏楠,戴住波,王學勇,黃璐琦申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所