專利名稱：生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺是一種中性多功能氨基酸，因其獨特而復(fù)雜的生理功能逐漸成為了營養(yǎng) 學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的研究熱點。谷氨酰胺具有維持機體酸堿平衡，調(diào)節(jié)機體免疫功 能等諸多的生理作用，是治療腸潰瘍、慢性胃炎的有效藥物，它不僅為機體物質(zhì)和能量代謝 提供原料，而且為核酸、糖蛋白等的生物合成提供氮。關(guān)于谷氨酰胺的生產(chǎn)，由于它特殊 的理化性質(zhì)，用化工合成的方法生產(chǎn)難度很大，目前較為理想的方法是通過谷氨酰胺的前 體-谷氨酸為原料，以Raney鎳鋁合金為催化劑化工合成谷氨酰胺；但是仍存在反應(yīng)步驟多 的問題，而且需要多次分離，得率低(20% 40%)，不穩(wěn)定；PH、溫度等條件要求苛刻，易出 現(xiàn)多種強副反應(yīng)-生成的谷氨酰胺重新分解或形成焦谷氨酸。此外，終產(chǎn)物的分離尚存在 較大技術(shù)難度，而且成本較高，還存在環(huán)境污染等問題。國內(nèi)的一些研究機構(gòu)在90年代開 始對發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺進行了一些探索，獲得了一些產(chǎn)量較高的菌株，但生產(chǎn)谷氨酰胺 都還只是實驗室階段。目前谷氨酰胺都是進口的，國內(nèi)生產(chǎn)的得率很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方 法，依次包括如下步驟(1)選取重量比分別為15%、1.5%、0. 01%、0. 05%、10%、5%的葡萄糖、玉米槳、 磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸銨、CaCO3，其余部分為水，然后將上述物質(zhì)攪拌并制成溶液；(2)待上述溶液制成后再加入硫酸錳120mg/L、硫酸銅10mg/L、硫酸鐵lmg/L、維生 素Biang/L、生物素H ang/L，再次攪拌，制得均一穩(wěn)定的底物；(3)在步驟( 制得的底物中接種黃色短桿菌，并控制溫度在30-32°C ；(4)在第1 M小時將PH控制在7. 0 7. 2，M小時后將PH控制在6. 5，并發(fā)酵 44-48小時。黃色短桿菌在市場上能夠買到，它的形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性及生理特性如下短桿 至棒狀，無鞭毛，不運動，不形成芽孢，菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、菌落半透明 狀；適宜培養(yǎng)溫度30°C，適宜保存溫度-70°C。發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺的難點在于生產(chǎn)中不清楚該在發(fā)酵液中需放置什么配料，特 別是無機鹽需要放哪幾種，各放多少量以及條件的控制。本發(fā)明人經(jīng)過長時間的試驗和總 結(jié)得出了上述配方，并通過嚴(yán)格的條件控制可將谷氨酰胺的產(chǎn)量提升到45g/L，達到國內(nèi)先 進水平。作為優(yōu)選，在發(fā)酵用時到達44小時后，將底物中生成的谷氨酰胺分離出來的同時 補充葡萄糖、玉米槳、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸銨、CaCO3、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鐵、維生素Bi、生物素H，以維持發(fā)酵液中各物質(zhì)含量的穩(wěn)定。優(yōu)選后的方案可實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)，其難度之一在于如何將谷氨酰胺適時地分離出 來，以避免谷氨酰胺向谷氨酸轉(zhuǎn)化，本發(fā)明人經(jīng)過長期的實踐，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后的44 48分 鐘分離谷氨酰胺，能獲得較好的得率；難度之二在于如何保證黃色短桿菌維持在穩(wěn)定期，防 止它向衰亡期轉(zhuǎn)變。本發(fā)明人經(jīng)過長期實踐，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵進行M小時后將PH控制略微調(diào) 低，即控制在6. 5時可有效延長穩(wěn)定期。綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明方法可替代化工合成方法生產(chǎn)谷氨酰胺，這樣不僅生產(chǎn)成本低，效率高， 而且可有效減輕對環(huán)境的污染；2、本發(fā)明方法是實驗室研究轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn)的典型，其谷氨酰胺得率與實驗室的 得率相差不大，實驗室為46. 6g/L，工業(yè)生產(chǎn)為45g/L ；達到國內(nèi)先進水平。


圖1是谷氨酰胺發(fā)酵過程曲線圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人 員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本 發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法，依次包括如下步驟(1)選取重量比分別為15%、1.5%、0. 01%、0. 05%、10%、5%的葡萄糖、玉米槳、 磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸銨、CaCO3，其余部分為水，然后將上述物質(zhì)攪拌并制成溶液；(2)待上述溶液制成后再加入硫酸錳120mg/L、硫酸銅10mg/L、硫酸鐵lmg/L、維生 素Biang/L、生物素H ang/L，再次攪拌，制得均一穩(wěn)定的底物；(3)在步驟⑵制得的底物中接種黃色短桿菌，并控制溫度在30-32°C ；(4)在第1 M小時將PH控制在7. O 7. 2，M小時后將PH控制在6. 5，并發(fā)酵 44-48小時。在發(fā)酵用時到達44小時后，將底物中生成的谷氨酰胺分離出來的同時補充葡萄 糖、玉米槳、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸銨、CaCO3、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鐵、維生素Bi、生物素 H，以維持發(fā)酵液中各物質(zhì)含量的穩(wěn)定。谷氨酰胺工業(yè)預(yù)生產(chǎn)的研究1材料與方法1. 1 菌種H'fe^iff ' (Brevibacterium flavum)1. 2試劑和儀器玉米漿、葡萄糖、其他均為國產(chǎn)試劑(化學(xué)純)1. 2. 1 儀器721型分光光度計、pH計、4
發(fā)酵罐①NBS公司SF2116型自控罐配有pH電極和溶氧電極；②往復(fù)無節(jié)調(diào)速搖床。1. 2. 2 培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15 %，玉米槳1.5%，磷酸二氫鉀0.01%，硫酸鋅0.05%，硫酸 銨10%，硫酸銅10mg/L，硫酸錳120mg/L，CaC035%，硫酸鐵lmg/L ；維生素Bl^iig/L，生物素 H 2mg/L ；PH 6. 5。1.2.3培養(yǎng)條件16L自控罐裝液量8L，118°C消毒5min，冷卻后種量3% 5%接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液 中，按試驗需要控制PH、風(fēng)量、轉(zhuǎn)速、溶氧水平。發(fā)酵過程中定期取樣，在培養(yǎng)基平板上劃線， 檢查有無染菌，并測定PH、及谷氨酰胺產(chǎn)量。1.2.4分析方法1.2. 4. 1谷氨酰胺測定紙層析法發(fā)酵液經(jīng)離心除去菌體等固體物質(zhì)，在層析紙上定量點樣，用谷氨酰胺 標(biāo)準(zhǔn)液對照。以正丁醇、冰醋酸、水G 1 1)作展開劑。展開完畢，吹干濾紙，用0.5% 茚三酮丙酮溶液顯色。洗脫液為0. 1 % CuSO4 · 5H20 75%乙醇O 38)，洗脫30min后 在510nm測0. D值，并與標(biāo)準(zhǔn)谷氨酰胺比較計算樣品中谷氨酰胺含量。1. 2. 4. 2發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y定采用斐林定糖法1.2. 4. 3pH 值的測定用酸度計或精密pH試紙，發(fā)酵過程用pH電極測定。2實驗結(jié)果與討論(1)ρΗ對谷氨酰胺發(fā)酵的影響由于菌體對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的利用和代謝產(chǎn)物的形成，使培養(yǎng)液的pH不斷發(fā)生 變化。培養(yǎng)基中的(NH4)2S0 4被菌體利用以及糖被利用生成有機酸等中間代謝產(chǎn)物，使pH 值下降；谷氨酰胺的形成，耗用大量的氨也使PH值下降。因此，需要不斷補充氮源(氨)和 調(diào)節(jié)PH值，直至發(fā)酵結(jié)束。本研究采用的黃色短桿菌在中性和微堿性條件下，發(fā)酵產(chǎn)生積 累谷氨酸；在酸性條件下(PH 5. O 5. 8)產(chǎn)生谷氨酰胺(見下表)。產(chǎn)胺期PH對谷氨酰胺的影響
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法，依次包括如下步驟(1)選取重量比分別為15%U.5%,0.01%,0. 05%、10%、5%的葡萄糖、玉米槳、磷酸 二氫鉀、硫酸鋅、硫酸銨、CaCO3，其余部分為水，然后將上述物質(zhì)攪拌并制成溶液；(2)待上述溶液制成后再加入硫酸錳120mg/L、硫酸銅10mg/L、硫酸鐵lmg/L、維生素 Biang/L、生物素H ang/L，再次攪拌，制得均一穩(wěn)定的底物；(3)在步驟( 制得的底物中接種黃色短桿菌，并控制溫度在30-32°C；(4)在第1 24小時將PH控制在7.0 7. 2，M小時后將PH控制在6.5，并發(fā)酵44-48 小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法，其特征在于在發(fā)酵用時到達44 小時后，將底物中生成的谷氨酰胺分離出來的同時補充葡萄糖、玉米槳、磷酸二氫鉀、硫酸 鋅、硫酸銨、CaCO3、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鐵、維生素Bi、生物素H，以維持發(fā)酵液中各物質(zhì)含 量的穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)谷氨酰胺的發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法可替代化工合成方法生產(chǎn)谷氨酰胺，這樣不僅生產(chǎn)成本低，效率高，而且可有效減輕對環(huán)境的污染；本發(fā)明方法是實驗室研究轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn)的典型，其谷氨酰胺得率與實驗室的得率相差不大，實驗室為46.6g/L，工業(yè)生產(chǎn)為45g/L；達到國內(nèi)先進水平。
文檔編號C12R1/13GK102051391SQ20091015320
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者姜禮輝, 鄒曉庭 申請人:浙江博信藥業(yè)有限公司