專利名稱：：一種惡臭假單胞菌株及其在制備羥基乙酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種惡臭假單胞菌株，以及酶法制備羥基乙酸的方法。
背景技術(shù)：
：羥基乙酸(乙醇酸)是一種重要的中間體，廣泛用于日用品、工業(yè)清洗劑、聚合物的單體及醫(yī)藥領(lǐng)域等。傳統(tǒng)制備羥基乙酸的方法是通過化學(xué)合成，但通?；瘜W(xué)合成需要高溫、高壓，且純度難以滿足需求。目前工藝較為成熟的化學(xué)法制備羥基乙酸的方法主要有氯乙酸堿性水解法。但該方法存在的缺陷是反應(yīng)效率低、產(chǎn)物容易產(chǎn)生聚酯或者交酯等問題。生物法制備羥基乙酸受到普遍關(guān)注，主要有腈水解酶水解羥基乙腈法和乙二醇不對(duì)稱氧化法。這些方法所使用的原料羥基乙腈和乙二醇都較貴，且羥基乙腈和制備過程中使用的氫氰酸都是劇毒品，因此用來生產(chǎn)羥基乙酸具有一定的限制。鹵代乙酸脫鹵酶是一類可以水解氯乙酸的酶，該酶來源廣泛，已經(jīng)在假單胞菌屬、根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬等發(fā)現(xiàn)。鹵代乙酸脫鹵酶目前主要用于污水或工業(yè)廢水中的氯乙酸的環(huán)境治理，至今沒有人用來生產(chǎn)制備羥基乙酸。因此開發(fā)從氯乙酸酶法制備羥基乙酸的方法，一方面可以在治理環(huán)境中變廢為寶，也可以用來直接以氯乙酸為原料制備羥基乙酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種新的惡臭假單胞菌株及其在制備羥基乙酸中的應(yīng)用。發(fā)明人首次分離純化到一株能快速降解氯乙酸的菌株。經(jīng)過16SrRNA和生理生化鑒定，該菌株為惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)，命名為惡臭假單胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15)。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2009年9月7日，保藏號(hào)為CGMCCNo.3267。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是該菌株為惡臭假單胞菌株CA15，菌種保藏號(hào)為CGMCCNo.3267。本發(fā)明的惡臭假單胞菌株CA15為生物催化劑的應(yīng)用，以用于制備羥基乙酸。本發(fā)明使用惡臭假單胞菌株CA15制備羥基乙酸的方法是主要包括如下步驟(1)添加誘導(dǎo)劑對(duì)惡臭假單胞菌CA15進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心獲得細(xì)胞或者在獲得細(xì)胞后進(jìn)一步經(jīng)過破胞提取粗酶；(2)以獲得的靜息細(xì)胞或者粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中添加氯乙酸鹽作為底物進(jìn)行反應(yīng)，然后從反應(yīng)液中收集羥基乙酸。進(jìn)一步地，本發(fā)明在步驟(1)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如下所述誘導(dǎo)劑為1070mM的氯乙酸鈉；培養(yǎng)溫度為2050°C。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述培養(yǎng)溫度為2540°C。進(jìn)一步地，本發(fā)明在進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)還添加輔助碳源，所述輔助碳源為0.510g/L的蔗糖或甘油。進(jìn)一步地，本發(fā)明在步驟(2)中，所述緩沖溶液的pH為5ll，反應(yīng)溫度為2050°C。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述緩沖溶液的pH為8IO，反應(yīng)溫度為2535°C。本發(fā)明的惡臭假單胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑氯乙酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心獲得細(xì)胞或者進(jìn)一步經(jīng)過破胞提取粗酶。以獲得的靜息細(xì)胞或者破胞粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中，通過一次或多次添加氯乙酸鈉，然后從反應(yīng)液中收集羥基乙酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有(1)采用新的酶法，水解氯乙酸獲得羥基乙酸，在環(huán)境治理中，可以變廢為寶。(2)相比于化學(xué)堿性水解氯乙酸制備羥基乙酸，本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，且產(chǎn)物純度高，可以達(dá)99%以上，滿足大多數(shù)的醫(yī)藥需求。(3)發(fā)明所使用的原料氯乙酸相比于羥基乙腈，價(jià)格較低，來源廣泛，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。(4)惡臭假單胞菌CA15具有較強(qiáng)的脫鹵能力，制得的粗酶活力高。圖1是羥基乙酸和氯乙酸的高效液相分析的標(biāo)準(zhǔn)譜圖；實(shí)驗(yàn)分析條件如下Agilent1100系統(tǒng)，有機(jī)酸分析柱Bio-RadHPX-87H(30cmX7.8mm)，流動(dòng)相為5mM硫酸水溶液，流速為0.6ml/min，室溫下測定紫外(UV)210nm下吸收值；氯乙酸和羥基乙酸在此條件下的保留時(shí)間分別為15.392min和12.154min。圖2是底物為不同氯乙酸鈉濃度時(shí)的酶活圖。圖3是反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相譜圖；分析條件同圖1的條件，其出峰時(shí)間為12.156min，與羥基乙酸的出峰時(shí)間相同。生物材料樣品的保藏信息保藏的生物材料樣品惡臭假單胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15);保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC);保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所(郵編100101);保藏日期2009年9月7日；保藏登記號(hào)CGMCCNo.326具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用的酶活力單位定義為每分鐘水解氯乙酸產(chǎn)生lPmol羥基乙酸所需要的酶量。本發(fā)明采用的種子培養(yǎng)基組成3.2g的十二水磷酸氫二鈉，1.5g的磷酸二氫鉀，0.0980.2g的硫酸鎂，0.20.5g的酵母抽提物，0.51.0g的硫酸銨，加水至1L，滅菌。本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成在種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加通過過濾滅菌的誘導(dǎo)劑，或者為提高產(chǎn)酶量，進(jìn)一步添加輔助碳源。氯乙酸和羥基乙酸的分析方法見附圖1。[OO37](—)菌種篩選及鑒定本發(fā)明從垃圾場附近土壤、許多含氯化合物的化工廠附近土壤或活性淤泥共8處土壤，在種子培養(yǎng)基中，添加30mM氯乙酸為唯一碳源富集培養(yǎng)，通過稀釋培養(yǎng)挑取單菌落至96深孔板中，培養(yǎng)24h后測定氯離子含量，挑取脫氯能力較強(qiáng)的進(jìn)行復(fù)篩，提取粗酶檢測活性并驗(yàn)證脫鹵產(chǎn)物，最后挑取并通過16SrRNA和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定該菌株為惡臭假單胞菌株P(guān)seudomonasputida命名為惡臭假單胞菌CA15。[OO39](二)脫鹵酶菌株的培養(yǎng)條件的確定培養(yǎng)溫度的確定在含有80ml的種子培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑，在溫度分別為2(TC、25t:、3(rC、4(rC或5(rC條件下振蕩培養(yǎng)24h，測定酶活。結(jié)果顯示，3(TC時(shí)的酶活為177.8U/L，2(TC、25t:、4(rC、5(rC下的活性分別對(duì)應(yīng)為30°C時(shí)的酶活的22%、65%、78%、50%，因此較佳的培養(yǎng)溫度為2540°C。誘導(dǎo)劑濃度的確定在含有80ml的種子培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，分別添加10mM、20mM、30mM、50mM、70mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑，3(TC下培養(yǎng)24h，測定0D550考察細(xì)菌的生長過程和測定酶活考察最終的產(chǎn)酶量，發(fā)現(xiàn)以10mM及20mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑時(shí)，細(xì)胞較早的進(jìn)入凋亡期，酶活分別為30mM誘導(dǎo)劑濃度時(shí)的產(chǎn)生的酶活(由上可知，其中30mM的氯乙酸鈉的酶活為177.8U/L)的34%和47%;當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為3050mM的氯乙酸鈉時(shí)，菌體生長相差不大，50mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑所產(chǎn)的酶是30mM的誘導(dǎo)劑濃度時(shí)產(chǎn)生的酶活的93%;誘導(dǎo)劑濃度為70mM時(shí)的所得到菌體的最大0D550值為30mM時(shí)的最大0D550的70%。因此較佳的誘導(dǎo)劑濃度為3050mM。輔助碳源的影響在含有80ml的種子培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑的基礎(chǔ)上，繼續(xù)添加10g/L蔗糖、10g/L葡萄糖或10g/L甘油為輔助碳源。3(TC下振蕩培養(yǎng)24h，結(jié)果如表1。如從表1中所示添加蔗糖所產(chǎn)生的酶活是不添加輔助碳源時(shí)的酶活的1.5倍。表1:輔助碳源種類對(duì)酶活及菌體it的影響輔助碳源OD550酶活U/L葡萄糖2.826.9蔗糖0.991268.9甘油2.40341.1不加輔助碳源0.999177.8輔助碳源濃度的影響在含有80ml的種子培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑，繼續(xù)添加如表2所示的不同濃度的蔗糖或甘油。從表2可得以0.5g/L的甘油、10g/L或5g/L的蔗糖為輔助碳源時(shí)，所產(chǎn)的酶活均超過450U/L。而以5g/L的蔗糖為輔助碳源時(shí)所產(chǎn)的菌體量和酶活相對(duì)最高。表2:輔助碳源濃度對(duì)酶活及菌體量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(三)利用靜息細(xì)胞為催化劑水解氯乙酸在250ml搖瓶內(nèi)，含有80ml的種子培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑基礎(chǔ)上，繼續(xù)添加5g/L蔗糖，3(TC培養(yǎng)24h后，在離心力為4000g的條件下離心收集細(xì)胞，用0.lmol的pH7.5的10.0的磷酸緩沖溶液分別清洗及離心兩次，獲得細(xì)胞。取培養(yǎng)后所獲的靜息細(xì)胞，以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加30mM氯乙酸鈉為底物，在3(TC振蕩反應(yīng)，反應(yīng)5h時(shí)，底物剛好反應(yīng)完全，羥基乙酸濃度為12.3mM。取培養(yǎng)后所獲的靜息細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的O.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加30mM的氯乙酸鈉為底物，在2(TC振蕩反應(yīng)12h時(shí)，底物剛好反應(yīng)完全，此時(shí)的羥基乙酸濃度為6.2mM。取培養(yǎng)后所獲的靜息細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH9.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加30mM的氯乙酸鈉為底物，30。C振蕩反應(yīng)5h時(shí)，底物消耗了26.lmM，此時(shí)的羥基乙酸濃度為9.3mM。取培養(yǎng)后所獲的靜息細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH8.0的磷酸緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加50mM的底物，3(TC振蕩反應(yīng)，5h時(shí)，底物消耗了20mM，此時(shí)的羥基乙酸濃度為10.8mM。取培養(yǎng)后所獲的靜息細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加110mM的氯乙酸鈉為底物，在3(TC振蕩反應(yīng)12h時(shí)，底物剛好反應(yīng)完全，此時(shí)的羥基乙酸濃度為40.7mM。取培養(yǎng)后所獲的靜息細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加110mM的氯乙酸鈉為底物，在5(TC振蕩反應(yīng)8h時(shí)，底物剛好反應(yīng)完全，此時(shí)的羥基乙酸濃度為30.2mM。取培養(yǎng)后所獲的細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸6/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加llOmM的氯乙酸鈉為底物，在35°C振蕩反應(yīng)9h時(shí)，底物剛好反應(yīng)完全，此時(shí)的羥基乙酸濃度為37.7mM。取培養(yǎng)后所獲的細(xì)胞，細(xì)胞以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.lmol的pH5.0的乙酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細(xì)胞懸液中添加30mM的氯乙酸鈉為底物，在3(TC振蕩反應(yīng)12h時(shí)，底物消耗了3.2mM，此時(shí)的羥基乙酸濃度為2.lmM。(四)利用粗酶為催化劑水解氯乙酸制備羥基乙酸在250ml搖瓶內(nèi)，含有80ml的種子培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導(dǎo)劑的基礎(chǔ)上，繼續(xù)添加5g/L蔗糖，3(TC培養(yǎng)24h后，在離心力為4000g的條件下離心收集細(xì)胞，再用O.lmol的pH7.5的磷酸緩沖溶液清洗及離心兩次，獲得細(xì)胞。以每克濕細(xì)胞添加10ml的0.02M的pH7.5的Tris-硫酸緩沖溶液中，400kHz的超聲頻率，超聲10min，4。C下以12000g的離心力離心20min，取上清液為粗酶。以該粗酶為催化劑，考察底物濃度的影B向，具體過程如下取1ml的粗酶液，分別添加底物濃度為10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或llOmM的氯乙酸鈉，繼續(xù)添加水至2ml的反應(yīng)體系，3(TC振蕩反應(yīng)0.5h，添加200ul的10X硝酸沉淀所有的蛋白質(zhì)以終止反應(yīng)，HPLC檢測產(chǎn)物的量，作底物與對(duì)應(yīng)的初始速率的圖，如圖2。從圖2中可得，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^30mM時(shí)，初始速率隨底物濃度升高反而下降，因此較佳的底物濃度為30mM。緩沖溶液pH值和反應(yīng)溫度的確定配制兩組不同pH緩沖溶液的反應(yīng)體系，每組體系的配制方法如下，取lml的上述提取的粗酶，分別添加500ul的pH5、6、7、8、9、9.5、10或11的緩沖溶液，其中一組添加直接30mM的氯乙酸鈉為底物，分別在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C下測定其酶活，另一組預(yù)先在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C對(duì)應(yīng)的溫度下放置24h后，再分別添加30mM的氯乙酸鈉為底物，并加水至2ml，然后在各自對(duì)應(yīng)的溫度下測定其殘余酶活，數(shù)據(jù)見表3。從表3可見，雖然在各種pH條件下，溫度為50°C時(shí)的酶活最高，但是放置24h后殘余酶活幾乎為零。而溫度為25t:35t:雖然活性并不是最高，但是放置24h后殘余酶活較高，于是綜合考慮活性及穩(wěn)定性，較佳的pH和溫度分別為8.010.0和25°C35°C。表3:緩沖溶液pH值和反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(注表3中的"前"指酶不經(jīng)過預(yù)先放置而直接進(jìn)行反應(yīng)，"后"指酶先預(yù)先放置24h后再測定酶活。)—次性添加底物法制備羥基乙酸取上述所提取的粗酶10ml，添加50mM的氯乙酸鈉為底物，添加5ml的0.2mol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液，繼續(xù)加水至總體積為20ml，3(TC振蕩反應(yīng)12h，添加2ml的10%硫酸沉淀蛋白，HPLC檢測分析結(jié)果如見圖3，從圖中可見，反應(yīng)產(chǎn)物中只有羥基乙酸，沒有其他雜質(zhì)。該產(chǎn)物的濃度為49.7mM，產(chǎn)率達(dá)99.4%。多次添加底物法制備羥基乙酸先取上述所提取的粗酶50ml，置250mlpH可控的搖瓶(NCBIOsHpH-6，上海國強(qiáng))中，添加25ml的0.2mol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液，在3(TC振蕩反應(yīng)，初始底物為30mM的氯乙酸鈉，每個(gè)半小時(shí)取樣，并通過HPLC檢領(lǐng)"當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?5mM時(shí)，添加15mM的底物使其繼續(xù)反應(yīng)，經(jīng)過15h，中間共添加8次，最后得到羥基乙酸濃度為148mM，回收率為98%以上，純度為99%以上。權(quán)利要求一種惡臭假單胞菌株，其特征是該菌株命名為惡臭假單胞菌株CA15，菌種保藏號(hào)為CGMCCNo.3267。2.—種權(quán)利要求1的惡臭假單胞菌株作為生物催化劑的應(yīng)用，其特征是該惡臭假單胞菌用于制備羥基乙酸。3.—種使用權(quán)利要求l的惡臭假單胞菌株制備羥基乙酸的方法，其特征是包括如下步驟(1)添加誘導(dǎo)劑對(duì)惡臭假單胞菌CA15進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心獲得細(xì)胞或者在獲得細(xì)胞后進(jìn)一步經(jīng)過破胞提取粗酶；(2)以獲得的靜息細(xì)胞或者粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中添加氯乙酸鹽作為底物進(jìn)行反應(yīng)，然后從反應(yīng)液中收集羥基乙酸。4.如權(quán)利要求3所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是在步驟(1)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如下所述誘導(dǎo)劑為1070mM的氯乙酸鈉；培養(yǎng)溫度為2050°C。5.如權(quán)利要求4所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是所述培養(yǎng)溫度為2540°C。6.如權(quán)利要求3或4所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是在進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)還添加輔助碳源，所述輔助碳源為0.510g/L的蔗糖或甘油。7.如權(quán)利要求3或4所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是在步驟(2)中，所述緩沖溶液的pH為5ll，反應(yīng)溫度為2050°C。8.如權(quán)利要求7所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是所述緩沖溶液的pH為810，反應(yīng)溫度為2535°C。全文摘要本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌株及其在制備羥基乙酸中的應(yīng)用，該菌株命名為惡臭假單胞菌株CA15，可用于制備羥基乙酸。本發(fā)明使用惡臭假單胞菌株CA15制備羥基乙酸的方法主要包括如下步驟添加誘導(dǎo)劑對(duì)惡臭假單胞菌CA15進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心獲得細(xì)胞或者在獲得細(xì)胞后進(jìn)一步經(jīng)過破胞提取粗酶；以獲得的靜息細(xì)胞或者粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中添加氯乙酸鹽作為底物進(jìn)行反應(yīng)，然后從反應(yīng)液中收集羥基乙酸。本發(fā)明得到的產(chǎn)物羥基乙酸的轉(zhuǎn)化率在99％以上，純度可達(dá)99％以上。本發(fā)明方法具有反應(yīng)條件溫和、無污染且工藝簡單等顯著特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12P7/42GK101705196SQ20091015412公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年11月5日優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日發(fā)明者吳堅(jiān)平,徐剛,楊立榮,林春嬌申請(qǐng)人:浙江大學(xué)