專利名稱：同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦wssv和ihhnv的方法及所用檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)，具體是對(duì)蝦白斑綜合癥及傳染性皮下及造血
組織壞死病毒的核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV最早出現(xiàn)在上世紀(jì)90年代初，是一種具有高度感染性 和致死性的病毒，是危害全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)最主要的病毒。WSSV能感染廣泛的宿主，包括所有 種類的對(duì)蝦和其它大多數(shù)甲殼類動(dòng)物，甚至在昆蟲體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，而且還能垂直傳播。對(duì)蝦 被感染后表現(xiàn)出非常高的死亡率，累積死亡率通常在觀察到第一次明顯的感染跡象后3-10 天達(dá)到100%。 傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)最初在夏威夷地區(qū)養(yǎng)殖的細(xì)角濱對(duì) 蝦(Litopenaeus stylirostris)中被發(fā)現(xiàn)，分布廣，危害嚴(yán)重，引起死亡率高達(dá)90 %以上 (Lightneret al， 1983)，而且可感染世界各地養(yǎng)殖對(duì)蟲下，是國際獸疫局(0IE)劃定的甲殼 類其他重要疾病之一，對(duì)世界對(duì)蝦養(yǎng)殖事業(yè)發(fā)展影響重大。在可感染南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)的多種病毒中，IHHNV可導(dǎo)致慢性矮小殘缺綜合癥(Runt-deformity syndrome, 簡稱RDS)，雖不會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦大量死亡，但是病毒感染實(shí)際上會(huì)造成經(jīng)濟(jì)上的重大損失。感染 IHHNV的南美白對(duì)蟲下，畸形率高，個(gè)體成長差異性大，餌料效率差，商品價(jià)值低，產(chǎn)量偏低，整 體養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失可能高達(dá)50% 。研究發(fā)現(xiàn)感染傳染性皮下及造血組織壞死病毒或患病后存 活下來的南美白對(duì)蝦會(huì)終生帶毒，并可通過垂直和水平傳播方式把病毒傳給下一代和其他 種群。 對(duì)于對(duì)蝦病毒性疾病，目前還沒有有效的藥物進(jìn)行治療，生產(chǎn)上多以預(yù)防為主，所 以病毒病原的檢測(cè)，特別是早期的檢測(cè)顯得格外重要。 目前，有關(guān)對(duì)蝦病毒的檢測(cè)方法主要有五種，第_種是電鏡觀察法，第二種是HE染 色法，第三種是抗體檢測(cè)法，第四種是核酸探針雜交法，第五種是PCR檢測(cè)法。電子顯微鏡 技術(shù)雖然可以直觀察到病毒粒子的存在，但操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長、成本高。HE染色法基于 病理學(xué)技術(shù)，不能直接對(duì)病毒進(jìn)行檢查，只能利用發(fā)病的組織病理征兆進(jìn)行檢測(cè)；抗體檢測(cè) 法和核酸探針雜交法是對(duì)病毒本身的蛋白質(zhì)或核酸成分進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度較低，耗 時(shí)較長，只能用于發(fā)病對(duì)蝦或即將發(fā)病的對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于尚未引發(fā)感染或在感染的極 早期很難用以上的方法檢測(cè)；PCR檢測(cè)法，雖然克服了前四種方法的缺點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下 能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的相對(duì)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，但由于常規(guī)的PCR檢測(cè)需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳 和成像系統(tǒng)，且檢測(cè)時(shí)間稍長，也大大限制了 PCR檢測(cè)方法在生產(chǎn)實(shí)際中的推廣應(yīng)用。
近年來發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)，該方法可以高靈敏地非常有選擇性 地高效擴(kuò)增靶序列，最終的LAMP產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán) 花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜。 LAMP是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，和其它核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，其反應(yīng)原理、引物設(shè)計(jì)更 加復(fù)雜。但是它具有等溫?cái)U(kuò)增只需要一個(gè)恒溫裝置就可以；高效靈敏模板僅需要10個(gè)拷貝或更少；擴(kuò)增特異性強(qiáng)應(yīng)用包含了六個(gè)區(qū)段的四條引物按嚴(yán)格順序進(jìn)行擴(kuò)增；檢測(cè) 時(shí)間短擴(kuò)增可以在60min完成，比普通PCR反應(yīng)要省時(shí)間；產(chǎn)物可以通過直接在反應(yīng)管中 加熒光染色或用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以LAMP為基礎(chǔ)發(fā)展而來的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法 (multi-LAMP)可以實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系中一步同時(shí)檢測(cè)多種耙基因，同LAMP —步反應(yīng)只 能檢測(cè)一種耙基因相比，節(jié)省了檢測(cè)步驟和檢測(cè)時(shí)間。 鑒于目前在對(duì)蝦養(yǎng)殖或相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易中經(jīng)常出現(xiàn)多種病毒混合感染的 狀況，如WSSV和IHHNV等病毒混合感染南美白對(duì)蟲下，開發(fā)一項(xiàng)對(duì)多種病毒同時(shí)進(jìn)行一步檢 測(cè)的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)顯得非常迫切和急需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供 一 種檢測(cè)靈敏度高且易操作的對(duì)蝦WSSV及 IHHNV同時(shí)檢測(cè)的方法以及配套的試劑盒。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下WSSV和IHHNV核酸多重等
溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括 (1)、研磨液管內(nèi)裝研磨液； (2)、核酸提取液A管內(nèi)裝乙酸鈉溶液； (3)、核酸提取液B管內(nèi)裝無水乙醇； (4)、核酸提取液C管內(nèi)裝質(zhì)量濃度為70%的乙醇； (5) 、 TE緩沖液管內(nèi)裝TE緩沖液； (6) 、 UNG酶管內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶； (7) 、multi-LAMP反應(yīng)液管內(nèi)裝multi-LAMP反應(yīng)液； (8) 、 Bst DNA聚合酶管內(nèi)裝Bst DNA聚合酶； (9)、顯色劑管內(nèi)裝核酸染料SYBR Green I ; (10)、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)裝拷貝數(shù)比為1 : 1的對(duì)蝦WSSV和IHHNV陽性DNA ;
(11)、陰性對(duì)照管內(nèi)裝滅菌的雙蒸水。 作為本發(fā)明的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的改進(jìn)， 研磨液是由以下體積份的組份組成 1 2M的三羥甲基氨基甲烷溶液5 10份，O. 25 1. OM的乙二胺四乙酸二鈉溶 液0. 5 2. 0份，質(zhì)量濃度5 10%的十二烷基磺酸鈉溶液5 10份，巰基乙醇0. 01 1. 0份，8-羥基喹啉0. 01 0. 02份，平衡酚5 10份和氯仿5 10份，以雙蒸水定容到 100份。 作為本發(fā)明的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的進(jìn) 一步改進(jìn)，multi-LAMP反應(yīng)液由以下組份組成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP禾P IHHNV-BIP各1 4 ii M， multi-LAMP引物WSSV—F3、 WSSV—B3、 IHHNV—F3和 IH麗-B3各0. 1 0. 4線dATP、 dGTP和dCTP各0. 5 2mM， dTTP、 dUTP各0. 25 lmM， Tris-HCllO 40mM， KC1 10 20mM， (NH4)2S04 5 15mM， MgS04 1 4mM， TritonX-100 0. 05% 1. 0%， Betaine 0. 8 1. 2M ;其余為雙蒸水。 作為本發(fā)明的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一 步改進(jìn)，multi-LAMP引物的核酸序列如下
WSSV-FIP(SEQ ID NO. 1): WSSV-BIP(SEQ ID NO. 2): 5' -GCGAGCAAGGCAATTTCAGCTTTTCAAATCCAAGAGGCACTCCAAAT ; WSSV-F3 (SEQ ID NO. 3): 5' -CTCCTGCGATAAAGGGATGTC ; WSSV-B3(SEQ ID NO. 4): 5' -AGTTGGATGGATTGAGGCGT ; IHHNV-FIP (SEQ ID NO. 5): IH麗-BIP(SEQ ID NO. 6): 5' -GAAAATCTCTTACCATCGGTGCATTTTGAAGGTGTTTGAGTCTCCT ;
IHHNV-F3 (SEQ ID NO. 7):
5' -CGACATCCGTGTACCAGA ;
IHHNV-B3 (SEQ ID NO. 8):
5' -AGAGCGTAGGACTTTCCG。 本發(fā)明還同時(shí)公開了利用上述任意一種試劑盒同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下WSSV和IHHNV的方 法，包括下列步驟 (1)、取待測(cè)品對(duì)蝦的頭胸部組織0. 2g置于離心管I中，加入0. 5ml研磨液，用研 磨棒充分磨碎至槳狀； (2)、將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸后以10000r/min離心5min，取上清液置于 離心管II中； (3)、向離心管II內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，所述乙酸鈉溶液 與上清液的體積比為1/10 ;再加入-2(TC預(yù)冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合，靜置 10min，以12000r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，所述無水乙醇與上清液的體積比 為2 : 1 ; (4)、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(3)所得的沉淀物，然后以 12000r/min離心5min，棄去上清液，并保留沉淀物； (5)、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(4)所得的沉淀物，然后以 12000r/min離心5min，棄去上清液，并保留沉淀物； (6)，將上述步驟(5)所得的沉淀物于室溫晾干，加入20 iU TE緩沖液溶解沉淀 物，得到樣品核酸； (7)、分別將上述樣品核酸、陰性對(duì)照管內(nèi)的雙蒸水及陽性對(duì)照核酸管內(nèi)的陽性對(duì) 照核酸2iil，加入43ii1 multi-LAMP反應(yīng)液，再加入liil UNG酶，從而分別得檢測(cè)管、陰性 對(duì)照管和陽性對(duì)照管；將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管均于37t:保溫10min進(jìn)行 酶解； (8)、將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管中的酶解后的反應(yīng)體系分別進(jìn)行如 下操作先于95t:保溫5min，然后再迅速置于碎冰塊中5min ; (9)、向步驟(8)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管的反應(yīng)體系中再分別加入2 ill Bst DNA聚合酶和2 ii 1核酸染料SYBR Green I ; (10)、將上述步驟(9)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管別進(jìn)行如下操作 先于64。C保溫45min，然后于90。C保溫2min完成multi-LAMP反應(yīng)； (11)、multi-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，如果檢測(cè)管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色同陰性對(duì)照管內(nèi)反 應(yīng)產(chǎn)物的顏色，則待測(cè)品IHHNV檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果檢測(cè)管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色同陽性對(duì) 照管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，則待測(cè)品IHHNV檢測(cè)結(jié)果為陽性。 在本發(fā)明的試劑盒中，原料能以市購的方式獲得，例如乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲 基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、醋酸鈉、氯仿、平衡酚、巰基乙醇、8-羥基喹啉、MgCl2、 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP購自上海生物工程有限責(zé)任公司，dUTP購自上海閃晶分子生物科技有限 公司，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、Bst DNA聚合晦等購自美國NEB公司，核酸染料SYBR Green I購自北京鼎國生物科技有限公司，Betaine、 Triton X-100購自Sigma公。
multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和IHHNV-BIP以及multi-LAMP 引物WSSV-F3、WSSV-B3、IHHNV-F3和IHHNV-B3可委托美國invitrogen (上海)英駿生物技 術(shù)有限公司合成。 對(duì)蟲下WSSV陽性DNA的獲得方式為感病對(duì)蟲下樣品采自浙江寧波對(duì)蟲下養(yǎng)殖場，按 照本發(fā)明的步驟1) 步驟6)提取模板DNA，用PCR引物WSSV-Pf和WSSV-Pr對(duì)其進(jìn)行 擴(kuò)展，反應(yīng)體系為25iU體系包括2. 5iU 10XPCR反應(yīng)緩沖液、1. OiU dNTPs(10mM)、 l.Oii 1WSSV-Pf和WSSV-Pr (20 iiM)、0. 5 ii 1 Taq DNA聚合酶(5U/ii l，北京鼎國生物科技有 限公司)，其余為雙蒸水。擴(kuò)展程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，之后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，94t:變性30s， 60。C退火30s， 72。C延伸60s完成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，重復(fù)循環(huán)30次，最后72°C 10min， 4。C保存。 擴(kuò)增得635bp的條帶，回收該片段后，按T載體說明書要求連接到T載體(pMD-18T-Vector， 購自大連寶生物公司)上，并按感受態(tài)細(xì)胞操作要求將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞JM109(購自大連寶生物公司)內(nèi)，用藍(lán)白斑方法篩選陽性菌，并用引物WSSV-Pf和 WSSV-Pr進(jìn)行PCR驗(yàn)證(程序同上)。最后用堿法提取陽性菌的質(zhì)粒，作為WSSV陽性DNA。
對(duì)蝦IHHNV陽性DNA的獲得方式為感病對(duì)蝦樣品采自浙江蕭山對(duì)蝦養(yǎng)殖場，按 照本發(fā)明的步驟1) 步驟6)提取模板DNA，用PCR引物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr對(duì)其進(jìn) 行擴(kuò)展，反應(yīng)體系為25iU體系包括2. 5iillOXPCR反應(yīng)緩沖液、1.0ii1 dNTPs(10mM)、 l.Oii IIHHNV-Pf禾P IHHNV-Pr(20iiM)、0.5ii 1 Taq DNA聚合酶(5U/ii 1，北京鼎國生物科 技有限公司)，其余為雙蒸水。擴(kuò)展程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，之后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，94t:變 性30s，58。C退火30s，72。C延伸60s完成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，重復(fù)循環(huán)30次，最后72°C 10min， 4t:保存。擴(kuò)增得523bp的條帶，回收該片段后，按T載體說明書要求連接到T載體 (pMD-18T-Vector，購自大連寶生物公司)上，并按感受態(tài)細(xì)胞操作要求將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109(購自大連寶生物公司)內(nèi)，用藍(lán)白斑方法篩選陽性菌，并用引 物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr進(jìn)行PCR驗(yàn)證(程序同上)。最后用堿法提取陽性菌的質(zhì)粒，作為 IHHNV陽性DNA。 病毒IHHNV由Lightner D V， Redman R M， Bell T A等人于1983年在美國細(xì) 角濱對(duì)蝦和南美白對(duì)蝦中首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道。IHHNV DNA的GenBank序列號(hào)為EF633688，目 標(biāo)序列位置為2195-2410。 WSSV DNA的GenBank序列號(hào)為AF369029，目標(biāo)序列位置為: 55303-55517。
本發(fā)明檢測(cè)方法的步驟(7)中，通過在提取的對(duì)蝦樣品核酸中加入1個(gè)單位的UNG 酶來消除模板污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。在步驟(9)中預(yù)先加入核酸染料，能避免開蓋檢測(cè) 反應(yīng)結(jié)果，大大降低了模板污染的產(chǎn)生可能，進(jìn)一步降低了假陽性的產(chǎn)生。
本發(fā)明檢測(cè)方法的步驟(ll)multi-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，陽性對(duì)照管內(nèi)顯示藍(lán)綠色， 陰性對(duì)照管內(nèi)顯示紫色；用肉眼觀察被測(cè)樣品(即檢測(cè)管)的multi-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果 顯示藍(lán)綠色則表示該樣品的檢測(cè)為陽性，樣品中含有其中一種(WSSV或IHHNV)或兩種病毒 (WSSV和IHHNV);若顯示紫色則表示該樣品的檢測(cè)為陰性，樣品中不含其中的任意一種病 毒(WSSV或IHHNV)。 與其他報(bào)道的LAMP技術(shù)相比，本發(fā)明的核心之_是針對(duì)WSSV及IHHNV基因組，優(yōu) 選了目的基因區(qū)段來設(shè)計(jì)multi-LAMP特異性引物，使得該引物能有效檢測(cè)WSSV及IHHNV 的所有毒株，而且檢測(cè)特異性好；核心之二是用專門設(shè)計(jì)的研磨液進(jìn)行樣品的處理，使得樣 品的處理過程極其簡單；核心之三是在同一反應(yīng)體系中能同時(shí)檢測(cè)WSSV及IHHNV的存在， 判斷檢測(cè)的對(duì)蝦樣品或養(yǎng)殖水體是否存在這兩種病毒或其中之一 ；核心之四是采用尿嘧啶 DNA糖基化酶(UNG酶)消除LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，避免了由于multi-LAMP檢測(cè)方法的產(chǎn) 物擴(kuò)增量非常大，極易使被檢樣品污染，造成的假陽性的結(jié)果；核心之五是使用不抑制反應(yīng) 的核酸染料，實(shí)現(xiàn)了不開蓋檢測(cè)，從源頭上避免了污染的產(chǎn)生，進(jìn)一步降低了假陽性結(jié)果的 出現(xiàn)；核心之六是優(yōu)化了整個(gè)操作過程的技術(shù)參數(shù)，并將其標(biāo)準(zhǔn)化、配套化，形成檢測(cè)試劑 盒，以便于現(xiàn)場應(yīng)用。 本發(fā)明的積極效果在于在試劑盒中匯集WSSV及IHHNV檢測(cè)所需的研磨液、核酸 提取液等十種試劑和三種器材，使得WSSV-IHHNV的檢測(cè)能有序地進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程現(xiàn) 場化、程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，使得操作規(guī)范、不易出錯(cuò)；本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)方法是以根據(jù)WSSV 及IHHNV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的一套LAMP引物為主體而設(shè)計(jì)的，因而使WSSV-IHHNV檢測(cè) 完全具有了 LAMP技術(shù)靈敏、快速、安全和簡便的特點(diǎn)；同時(shí)本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法中 采用不開蓋檢測(cè)，降低污染產(chǎn)生的可能，另外UNG酶能徹底消除多次檢測(cè)過程中核酸污染 導(dǎo)致的假陽性，解決了限制LAMP技術(shù)廣泛應(yīng)用的易被污染干擾的問題。使用本發(fā)明的試劑 盒及檢測(cè)方法在2小時(shí)內(nèi)就可完成對(duì)蝦WSSV及IHHNV的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)過程無需昂貴的儀 器設(shè)備如PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)，僅需有水浴鍋或金屬浴和離心機(jī)即可；而且檢測(cè)結(jié)果非 常容易判別；與對(duì)蝦病毒已有檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)方法成本低，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場 檢測(cè)，并且檢測(cè)靈敏度極高，檢出病毒的拷貝可低至100個(gè)?？傊?，該方法具有比普通PCR 檢測(cè)方法更高的特異性、靈敏性和便捷性，可以替代對(duì)蝦白斑綜合病及傳染性皮下及造血 器官壞死病毒之前的相關(guān)檢測(cè)方法如電鏡觀察法、HE染色法、抗體檢測(cè)法、核酸探針雜交和 PCR檢測(cè)法。 綜上所述，本發(fā)明具有靈敏度高、簡單快速、方便、節(jié)約時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的優(yōu)點(diǎn)，在同一 反應(yīng)體系中可一步同時(shí)檢測(cè)WSSV、 IHHNV等多種病毒病原，大大提高了對(duì)蝦病毒檢測(cè)的效 率，既有技術(shù)上的突破和創(chuàng)新，又符合實(shí)際應(yīng)用的需要。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明(溶液中以雙蒸水為溶劑)。 實(shí)施例1 、一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒(5樣份，即可用于5樣次的檢測(cè))，其由以下內(nèi)容物組成
(1)研磨液管，1管，3ml。 研磨液配制1M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl， pH8. 0) 10份，O. 25M的乙二
胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2) 2. 0份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS) 10份，巰基
乙醇0. 5份，8-羥基喹啉0. 01份，平衡酚7份，氯仿8份，以雙蒸水定容到100份而成。 (2)核酸提取液A管，1管，內(nèi)裝400 ill 3M乙酸鈉溶液(NaAc， pH5. 2)。 (3)核酸提取液B管，1管，內(nèi)裝10ml無水乙醇。 (4)核酸提取液C管，1管，內(nèi)裝10ml質(zhì)量濃度70%的無水乙醇。 (5) TE緩沖液管，1管，內(nèi)裝400 ii 1 TE緩沖液(含10mM Tris-HCl和lmM EDTA，其
余為雙蒸水，pH8. 0)。 (6) UNG酶管，1管，內(nèi)裝6個(gè)單位(U)的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。 (7)multi-LAMP反應(yīng)液管，1管，內(nèi)裝450 ii 1 multi-LAMP反應(yīng)液， 該反應(yīng)液的組成成分如下multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和
IHHNV-BIP各2 ii M， multi-LAMP引物WSSV-F3、 WSSV-B3、 IHHNV-F3和IHHNV-B3各0. 5 ii M，
dATP、dGTP和dCTP各lmM，dTTP、dUTP各0. 5mM，Tris-HCl 25mM，KCl 15mM， (NH4)2S04 10mM，
MgS04 2mM， Triton X-1000. 5% (質(zhì)量濃度)，Betaine 1M ;其余為雙蒸水。 上述WSSV-IHHNV檢測(cè)試劑盒中所述的multi-LAMP引物根據(jù)WSSV及IHHNV
基因保守區(qū)序列(AF369029和EF633688)設(shè)計(jì)的，multi-LAMP引物設(shè)計(jì)的首選軟件是
PrimerExplore 4. 0 (http://primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)，也可以使用
常用的引物設(shè)計(jì)軟件(如Primer Primier 5. 0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的設(shè)計(jì)要求
進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。本發(fā)明中利用軟件PrimerExplore 4. 0在線設(shè)計(jì)的multi-LAMP引物的DNA
序列如下 WSSV-FIP : WSSV-BIP : 5' -GCGAGCAAGGCAATTTCAGCTTTTCAAATCCAAGAGGCACTCCAAAT ; WSSV-F3 : 5' -CTCCTGCGATAAAGGGATGTC ; WSSV-B3 : 5' -AGTTGGATGGATTGAGGCGT ; IH麗-FIP : IH麗-BIP : 5' -GAAAATCTCTTACCATCGGTGCATTTTGAAGGTGTTTGAGTCTCCT ; IHHNV-F3 : 5' -CGACATCCGTGTACCAGA ; IH麗-B3 : 5' -AGAGCGTAGGACTTTCCG。 (8)BstDNA聚合酶管，1管，內(nèi)裝lOii 1 BstDNA聚合酶。
(9)顯色劑管，1管，內(nèi)裝10 ill的液體染料，該液體染料由核酸染料SYBR Green I
和雙蒸水按照l : ioo的體積比混合而得。 (10)陽性對(duì)照核酸管，1管，10 iU，內(nèi)裝分別帶有對(duì)蟲下WSSV及IHHNV DNA的T載 體重組質(zhì)粒，各100copies/iil。
制備方法具體如下 用分別位于WSSV及IHHNV LAMP目標(biāo)片段上下游的PCR引物
WSSV-Pf(SEQ ID NO. 9) :5' -AGCCAACCAAGCACCCGT，
WSSV-Pr(SEQ ID NO. 10) :5' -CGATTTCCTCCCCCGTCTT，
IHHNV-Pf(SEQ ID NO. 11) :5' —GAAAACCAGACTACGACAAT，
IHHNV-Pr(SEQ ID NO. 12) :5' -TCGTACTGGCTGTTCATC， 分別對(duì)WSSV及IHHNV基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到635bp及523bp的條帶，回收該片段后，
分別與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒，分別稀釋至200copies/ y 1，之后再
等量混合；從而對(duì)蝦WSSV及IHHNV DNA的T載體重組質(zhì)粒，各100copies/ ii 1 。 (11)陰性對(duì)照管，l管，內(nèi)裝100iU滅菌雙蒸水。 (12)研磨棒，5支。 (13)盒子(78 X 78 X 50mm)。 (14) —塊泡沫板，泡沫板高22mm，有三列空，第-列四個(gè)孔，孔徑5. 5mm，第二列三 個(gè)空，孔徑10mm，第三列三個(gè)空，孔徑15. 5mm。上述各小管放置于這些小孔中，泡沫板與上 述盒子的底面大小相同，裝于盒子中。
(15)試劑盒使用說明書_份。 實(shí)施例2、一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒(5樣 份)，其僅以下內(nèi)容不同于實(shí)施例l，其余均同實(shí)施例1。 研磨液配制2M的三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl， pH8. 0)5份，O. 5M的乙二胺四乙 酸二鈉(EDTANa》l份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)7X的十二烷基磺酸鈉(SDS) 7份，巰基乙醇1份，8-羥基 喹啉0. 02份，平衡酚5份，氯仿10份，以雙蒸水定容到100份而成。 multi-LAMP反應(yīng)液由以下組份組成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和IHHNV-BIP各1 ii M，multi-LAMP引物WSSV-F3、WSSV-B3、 IHHNV-F3和IHHNV-B3 各O. liiM，dATP、dGTP和dCTP各2mM，dTTP、dUTP各lmM，Tris-HC110mM，KCl 10mM， (NH4)2S04 5mM，MgS04 4mM， Triton X-100 0. 05%， Betaine 1. 2M ;其余為雙蒸水。
實(shí)施例3、一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒(5樣 份)，其僅以下內(nèi)容不同于實(shí)施例l，其余均同實(shí)施例1。 研磨液配制1. 5M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl， pH8. 0)7份，1. 0M的乙二 胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2) 0. 5份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS) 5份，巰基 乙醇0. 01份，8-羥基喹啉0. 015份，平衡酚10份，氯仿10份，以雙蒸水定容到100份而成。
multi-LAMP反應(yīng)液由以下組份組成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP和IHHNV-BIP各4 ii M，multi-LAMP引物WSSV-F3、WSSV-B3、 IHHNV-F3和IHHNV-B3 各0. 4線dATP、 dGTP和dCTP各0. 5mM， dTTP、 dUTP各0. 25mM， Tris-HC140mM， KC1 20mM， (NH4)2S04 15mM，MgS04 4mM， Triton X-1001 %， Betaine 0. 8M ;其余為雙蒸水。
實(shí)施例4、一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下WSSV和IHHNV的方法，利用上述實(shí)施例1 實(shí)施例3中任意一種試劑盒，依次進(jìn)行下列步驟 (1)、取待測(cè)品對(duì)蝦的頭胸部組織0. 2g置于離心管I中，加入0. 5ml研磨液，用研 磨棒充分磨碎至槳狀； (2)、將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸(IO(TC， 10min)后以10000r/min離心5min， 取上清液置于離心管II中； (3)、向離心管11內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，所述乙酸鈉溶液與 步驟(2)所得上清液的體積比為1/10 ;再加入-2(TC預(yù)冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇 混合，靜置10min，以12000r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，所述無水乙醇與步驟 (2)所得上清液的體積比為2 : 1 ; (4)、用核酸提取液C管內(nèi)的lml乙醇溶液洗滌上述步驟(3)所得的沉淀物，然后 以12000r/min離心5min，棄去上清液，并保留沉淀物； (5)、用核酸提取液C管內(nèi)的lml乙醇溶液洗滌上述步驟(4)所得的沉淀物，然后 以12000r/min離心5min，棄去上清液，并保留沉淀物； (6)，將上述步驟5)所得的沉淀物于室溫晾干，加入20 iU TE緩沖液溶解沉淀物， 得到樣品核酸； (7)、分別將上述樣品核酸、陰性對(duì)照雙蒸水及試劑盒中的陽性對(duì)照核酸2iU，加 入43 iil multi-LAMP反應(yīng)液，再加入1 yl UNG酶，分別得檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照 管；將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管均于37t:保溫10min進(jìn)行酶解；目的是以酶解 方法消除其中可能存在的污染模板； (8)、將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管中的酶解后的反應(yīng)體系分別進(jìn)行如 下操作先于95t:保溫5min，然后再迅速置于碎冰塊中5min ; (9)、向步驟(8)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管的反應(yīng)體系中再分別加 入2 iil Bst DNA聚合酶和2 ii 1核酸染料； (10)、將上述步驟(9)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管分別進(jìn)行如下操 作先于64。C保溫45min，然后于90。C保溫2min，終止multi-LAMP反應(yīng)；
(11)、multi-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，如果檢測(cè)管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色為紫色，即同陰性 對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，則待測(cè)品檢測(cè)結(jié)果為陰性；即樣品中不含其中的任意一種病毒 (WSSV或IH麗)。 如果檢測(cè)管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色為藍(lán)綠色，即同陽性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，則 待測(cè)品檢測(cè)結(jié)果為陽性；即樣品中含有其中一種(WSSV或IHHNV)或兩種病毒(WSSV和 IH麗)。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)1、以自然感染IHHNV的南美白對(duì)蟲下作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例1中的試 劑盒，按實(shí)施例4的方法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果顯示陽性對(duì)照管與檢查管均為藍(lán)綠色，陰性對(duì)照管為紫色，表示該樣品的檢 測(cè)結(jié)果為陽性。 將上述同一只南美白對(duì)蝦按照常規(guī)的PCR檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，具體為將模板使用 引物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)序，結(jié)果證實(shí)是IHHNV陽性結(jié)果。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)2、以自然感染W(wǎng)SSV的南美白對(duì)蝦作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例1中的試劑 盒，按實(shí)施例4的方法進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果顯示陽性對(duì)照管與檢查管均為藍(lán)綠色，陰性對(duì)照管為紫色，表示該樣品的 WSSV檢測(cè)結(jié)果為陽性。
將上述同一只南美白對(duì)蝦按照常規(guī)的PCR檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，具體為將模板使用 引物WSSV-Pf和WSSV-Pr進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)序，結(jié)果證實(shí)是WSSV陽性結(jié)果。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)3、以混合感染W(wǎng)SSV和IHHNV南美白對(duì)蝦作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例1中 的試劑盒，按實(shí)施例4的方法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果顯示陽性對(duì)照管與檢查管均為藍(lán)綠色，陰性對(duì)照管為紫色，表示該樣品的檢 測(cè)結(jié)果為陽性。 將上述同一只南美白對(duì)蝦按照常規(guī)的PCR檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，具體為將模板分別 使用引物WSSV-Pf 、WSSV-Pr和IHHNV-Pf、IHHNV-Pr進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，并測(cè)序，結(jié)果證實(shí)是 WSSV和IHHNV的陽性結(jié)果。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 1、以同一只南美白對(duì)蝦(已確認(rèn)僅感染IHHNV)作為待測(cè)樣品，利用實(shí)
施例1中的試劑盒，按實(shí)施例4中步驟(1) 步驟(6)的方法制備自然感染IHHNV對(duì)蟲下的
檢測(cè)模板(即樣品核酸)。將模板(即提取的感染IHHNV對(duì)蝦DNA模板)用TE緩沖液進(jìn)行
101， 102， 103， 104， 105， 106， 107倍系列稀釋，分別作為multi-LAMP和PCR檢測(cè)模板。 1)、按照實(shí)施例4中步驟(7) 步驟(11)所述方法，分別對(duì)1(^-107模板進(jìn)行檢查。 2)、以同樣的模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，使用引物IHHNV-Pf和IHHNV-Pr 。 結(jié)果表明，本發(fā)明的LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到106倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至103
倍稀釋的模板，LAMP檢測(cè)的靈敏度比PCR高1000倍，且用時(shí)更少，設(shè)備更簡單。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 2、以確認(rèn)僅被感染W(wǎng)SSV的南美白對(duì)蝦作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例1中
的試劑盒，按實(shí)施例4中步驟(1) 步驟(6)的方法制備自然感染W(wǎng)SSV對(duì)蝦的檢測(cè)模板。
將模板(即提取的感染W(wǎng)SSV對(duì)蝦DNA模板)用TE緩沖液進(jìn)行IO1， 102， 103， 104， 105， 106， 107
倍系列稀釋，分別作為multi-LAMP和PCR檢測(cè)模板。 1)、按照實(shí)施例4中步驟(7) 步驟(11)所述方法，分別對(duì)1(^-107模板進(jìn)行檢查。 2)、以同樣的模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，使用引物WSSV-Pf 、 WSSV-Pr。 結(jié)果表明，本發(fā)明的LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到106倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至103
倍稀釋的模板。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 3、以確認(rèn)被同時(shí)感染W(wǎng)SSV和IHHNV的南美白對(duì)蟲下作為待測(cè)樣品，利 用實(shí)施例1中的試劑盒，按實(shí)施例4中步驟(1) 步驟(6)的方法制備自然感染W(wǎng)SSV和 IHHNV對(duì)蟲下的檢測(cè)模板。將模板(即提取的感染W(wǎng)SSV和IHHNV對(duì)蟲下DNA模板)用TE緩沖 液進(jìn)行IO1， 102， 103， 104， 105， 106， 107倍系列稀釋，分別作為multi-LAMP和PCR檢測(cè)模板。
1)、按照實(shí)施例4中步驟(7) 步驟(11)所述方法，分別對(duì)1(^-107模板進(jìn)行檢 查。 2)、以同樣的模板進(jìn)行PCR檢領(lǐng)lj ，使用引物WSSV-Pf 、 WSSV-Pr禾P IHHNV-Pf 、 I朋NV-Pr進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增。 結(jié)果表明，本發(fā)明的LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到1(f倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至103 倍稀釋的模板。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)5. 1 對(duì)比實(shí)驗(yàn)5. 3，利用實(shí)施例2中的試劑盒，其余內(nèi)容對(duì)應(yīng)地等同于 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 1 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 3 : 對(duì)比實(shí)驗(yàn)5. 1的結(jié)果為LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到10M咅稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至 103倍稀釋的模板。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)5. 2的結(jié)果為LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到106倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至 103倍稀釋的模板。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)5. 3的結(jié)果為LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到106倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至 103倍稀釋的模板。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)6. 1 對(duì)比實(shí)驗(yàn)6. 3，利用實(shí)施例3中的試劑盒，其余內(nèi)容對(duì)應(yīng)地等同于 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 1 對(duì)比實(shí)驗(yàn)4. 3 : 對(duì)比實(shí)驗(yàn)6. 1的結(jié)果為LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到10M咅稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至 103倍稀釋的模板。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)6. 2的結(jié)果為LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到106倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至 103倍稀釋的模板。 對(duì)比實(shí)驗(yàn)6. 3的結(jié)果為LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到106倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至 103倍稀釋的模板。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表SEQ ID NO. 1 :ctgcaacctc aaaaategcc tctgttttgg cagtttcttccgttcttttg t51SEQ ID NO. 2 :gcgagc朋gg c朋tttcagc ttttca朋tc C朋g3ggC3Ctccaaat47SEQ ID NO. 3 :ctcctgcgat aaagggatgt c21SEQ ID NO. 4 :3gttgg3t gg3ttg3ggC gt22SEQ ID NO. 5 :gtccttggag tecaagagtg tttettttte atcttegcttggateatcat cgt53SEQ ID NO. 6 :gaaaatctct teccatcggt gcattttgaa ggtgtttgag tctcct46SEQ ID NO. 7 :cgacatccgt gteccaga18SEQ ID NO. 8 :agagcgtegg actttccg18SEQ ID NO. 9 :agccaaccaa gcacccgt18SEQ ID NO. 10 :
cgatttcctc ccccgtctt 19 SEQ ID NO. 11 : gaaaaccaga ctecgacaat 20 SEQ ID NO. 12 : tcgtactggc tgttcatc 18
權(quán)利要求
一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征是該試劑盒包括(1)、研磨液管內(nèi)裝研磨液；(2)、核酸提取液A管內(nèi)裝乙酸鈉溶液；(3)、核酸提取液B管內(nèi)裝無水乙醇；(4)、核酸提取液C管內(nèi)裝質(zhì)量濃度為70％的乙醇；(5)、TE緩沖液管內(nèi)裝TE緩沖液；(6)、UNG酶管內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶；(7)、multi-LAMP反應(yīng)液管內(nèi)裝multi-LAMP反應(yīng)液；(8)、BstDNA聚合酶管內(nèi)裝Bst DNA聚合酶；(9)、顯色劑管內(nèi)裝核酸染料SYBR Green I；(10)、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)裝拷貝數(shù)比為1∶1的對(duì)蝦WSSV和IHHNV陽性DNA；(11)、陰性對(duì)照管內(nèi)裝滅菌的雙蒸水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑 盒，其特征在于所述研磨液是由以下體積份的組份組成1 2M的三羥甲基氨基甲烷溶液5 IO份，O. 25 l.OM的乙二胺四乙酸二鈉溶液 0. 5 2. 0份，質(zhì)量濃度5 10%的十二烷基磺酸鈉溶液5 10份，巰基乙醇0. 01 1. 0 份，8-羥基喹啉0. 01 0. 02份，平衡酚5 10份和氯仿5 10份，以雙蒸水定容到100 份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試 劑盒，其特征在于所述multi-LAMP反應(yīng)液由以下組份組成multi-LAMP引物WSSV-FIP、 WSSV-BIP、 IHHNV-FIP禾P IHHNV-BIP各1 4 ii M， multi-LAMP弓|物WSSV-F3、 WSSV-B3、 IHHNV-F3和IH麗-B3各0. 1 0. 4線dATP、 dGTP和dCTP各0. 5 2mM， dTTP、 dUTP各 0. 25 lmM，Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM， (NH4) 2S045 15mM，MgS04l 4mM， Triton X-1000. 05% 1. 0%， Betaine 0. 8 1. 2M ;其余為雙蒸水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求書3所述的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑 盒，其特征在于所述multi-LAMP引物的核酸序列如下<formula>formula see original document page 2</formula>I朋NV-F3 :<formula>formula see original document page 2</formula>
5.利用如權(quán)利要求書1 4中任意一種試劑盒同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV的方法，其 特征在于包括下列步驟(1) 、取待測(cè)品對(duì)蝦的頭胸部組織0. 2g置于離心管I中，加入0. 5ml研磨液，用研磨棒 充分磨碎至槳狀；(2) 、將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸后以10000r/min離心5min，取上清液置于離心 管II中；(3) 、向離心管I1內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，所述乙酸鈉溶液與步驟 (2)所得上清液的體積比為1/10 ;再加入-2(TC預(yù)冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合， 靜置10min，以12000r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，所述無水乙醇與步驟(2)所 得上清液的體積比為2 : 1;(4) 、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(3)所得的沉淀物，然后以12000r/ min離心5min，棄去上清液，保留沉淀物；(5) 、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(4)所得的沉淀物，然后以12000r/ min離心5min，棄去上清液，保留沉淀物；(6) ，將上述步驟(5)所得的沉淀物于室溫晾干，加入20 iU TE緩沖液溶解沉淀物，得 到樣品核酸；(7) 、分別在上述樣品核酸、陰性對(duì)照管內(nèi)的雙蒸水及陽性對(duì)照核酸管內(nèi)的陽性對(duì)照核 酸2iil中，加入43ii1 multi-LAMP反應(yīng)液，再加入liil UNG酶，分別得檢測(cè)管、陰性對(duì)照管 和陽性對(duì)照管；將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管均于37t:保溫10min進(jìn)行酶解；(8) 、將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管中的酶解后的反應(yīng)體系分別進(jìn)行如下操 作先于95t:保溫5min，然后再迅速置于碎冰塊中5min ;(9) 、向步驟(8)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管的反應(yīng)體系中再分別加入 2 ii 1Bst DNA聚合酶和2 ii 1核酸染料SYBR Green I ;(10) 、將上述步驟(9)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管分別進(jìn)行如下操作先 于64。C保溫45min，然后于90。C保溫2min完成multi-LAMP反應(yīng)；(11) 、multi-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，如果檢測(cè)管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色同陰性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn) 物的顏色，則待測(cè)品檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果檢測(cè)管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色同陽性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng) 產(chǎn)物的顏色，則待測(cè)品檢測(cè)結(jié)果為陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV的核酸多重等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括內(nèi)裝研磨液的研磨液管、內(nèi)裝乙酸鈉溶液的核酸提取液A管、內(nèi)裝無水乙醇的核酸提取液B管、內(nèi)裝質(zhì)量濃度為70％的乙醇的核酸提取液C管、內(nèi)裝TE緩沖液的E緩沖液管、內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶的UNG酶管、內(nèi)裝multi-LAMP反應(yīng)液的multi-LAMP反應(yīng)液管、內(nèi)裝Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管、內(nèi)裝核酸染料SYBR Green I的顯色劑管、內(nèi)裝拷貝數(shù)比為1∶1的對(duì)蝦WSSV和IHHNV陽性DNA的陽性對(duì)照核酸管和內(nèi)裝滅菌雙蒸水的陰性對(duì)照管。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種檢測(cè)靈敏度高的同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101792818SQ20091015431
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者何琳, 徐海圣, 王美珍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)