專利名稱：：核酸分子和鑒別gpr84活性調(diào)節(jié)劑的方法核酸分子和鑒別GPR84活性調(diào)節(jié)劑的方法
背景技術(shù)：
：在整個(gè)動(dòng)物王國(guó)中，從簡(jiǎn)單的后生動(dòng)物到最復(fù)雜的脊椎動(dòng)物，都存在味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)信味覺(jué)是由受體介導(dǎo)的，即促代謝受體或收縮性受體。表達(dá)味覺(jué)受體的細(xì)胞在接觸某些化學(xué)刺激時(shí)，除極化產(chǎn)生動(dòng)作電位，由動(dòng)作電位觸發(fā)感覺(jué)而引起味覺(jué)。這樣，味覺(jué)受體特異性識(shí)別能夠引起特定味覺(jué)的分子。這些分子在這里也被稱為"促味劑"。許多味覺(jué)受體屬于7個(gè)跨膜受體的超家族(Hoon等，(1999)Cell,96:451;Adler等，(2000)Cell,100:693)，也稱為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。據(jù)信其他味道是由通道蛋白介導(dǎo)的。許多這些受體的生物化學(xué)分析和分子克隆揭示了關(guān)于這些受體功能的基本原理。例如，美國(guó)專利5,691,188描述了配體如何結(jié)合GPCR，假定該受體發(fā)生構(gòu)象變化而導(dǎo)致G蛋白的活化。G蛋白包括三個(gè)亞單位脒基核苷酸結(jié)合a亞單位、P亞單位和Y亞單位。當(dāng)GDP結(jié)合時(shí)，G蛋白以異質(zhì)三聯(lián)體形式存在，即Ga^復(fù)合物。當(dāng)GTP結(jié)合時(shí)，a亞單位從異質(zhì)三聯(lián)體解離，形成GJ^復(fù)合物。當(dāng)Ga(3Y復(fù)合物與細(xì)胞膜中活化的G蛋白偶聯(lián)受體可操作地相關(guān)聯(lián)時(shí)，GTP對(duì)結(jié)合的GDP的交換速率增加，結(jié)合的Ga亞單位從Ga^復(fù)合物解離的速率增加。因此，游離的Ga亞單位和G(3Y復(fù)合物能夠?qū)⑿盘?hào)傳遞到各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游元件。這些事件形成不同細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的多樣性的基礎(chǔ)，包括例如鑒別為神經(jīng)感覺(jué)(例如味覺(jué)和/或嗅覺(jué))的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。據(jù)信哺乳動(dòng)物具有5種基本的味覺(jué)樣態(tài)，甜、苦、酸、咸和鮮(谷氨酸鈉的味道)。例如參見(jiàn)，Kinnamon等，(1992)Ann.Rev.Physiol.54:715-31;Lindemann(1996)Physiol.Rev.76:718-66;Stewart等，(1997)Am.JPhysiol.272:1-26。大量動(dòng)物的生理學(xué)研究表明，味覺(jué)受體細(xì)胞可以對(duì)不同的化學(xué)刺激選擇性地作出響應(yīng)。例如參見(jiàn)，Akabas等，(1988)Science242:1047-50;Gilbertson等，(1992)J.Gen.Physiol.100:803-24;Bernhardt等，(1996)J.Physiol.4卯:325-36;Cummings等，(1996)J.Neurophysiol.75:1256-63。關(guān)于味覺(jué)細(xì)胞功能的精神物理和生理學(xué)大多已知。因此，新型味覺(jué)受體和味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的鑒別與分離將實(shí)現(xiàn)味道轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化學(xué)和遺傳調(diào)節(jié)的新方法。例如，利用受體和通道分子可以實(shí)現(xiàn)高親和力激動(dòng)劑、拮抗劑、反相激動(dòng)劑和味覺(jué)活性調(diào)節(jié)劑。這些味覺(jué)調(diào)節(jié)性化合物可用于藥品和食品工業(yè)以改善各種消費(fèi)品的味道，或阻斷不希望的味道，例如在某些藥物中。各種人和其他真核化學(xué)感受受體的完整或部分序列是已知的。參見(jiàn)例如，Pilpel和Lancet(1999)ProteinScience8:969-977;Mombaerts(1999)Annu.Rev.Neurosci,22:487-50;Wang等，(2006)J.Biol.Chem.M608019200。也可見(jiàn)于，美國(guó)專利5,874,243，WO92/17585，WO95/18140，WO97/17444，WO99/67282和WO2007/027661。此外，已進(jìn)行G蛋白偶聯(lián)受體如GPR84的配體的鑒別。參見(jiàn)Wang等，(2006)同上；WO2007/027661;和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?007/0196867。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種編碼CD36、Gqi9和/或G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)蛋白的分離的核酸分子。本發(fā)明也包括能使CD36、Gqi9和GPR84誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)的表達(dá)載體，以及共表達(dá)CD36、Gw和GPR84蛋白的分離的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及鑒別GPR84活性調(diào)節(jié)劑的方法。該方法包括使共表達(dá)CD36、G^和GPR84蛋白的重組宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物相接觸并測(cè)定測(cè)試化合物對(duì)GPR84活性的功能性影響從而鑒別GPR84的調(diào)節(jié)劑。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了編碼G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)、CD36和Gqi9的分離核酸分子及其在鑒別GPR84的配體(例如激動(dòng)劑和拮抗劑)中的應(yīng)用。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及作為脂肪味受體的GPR84及其在模擬脂肪味的化合物的篩選試驗(yàn)中的應(yīng)用。本文所用術(shù)語(yǔ)"分離"表示核酸分子時(shí)是指不同于天然存在的純化或濃縮狀態(tài)的核酸分子。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法和過(guò)程，本文所述的核酸分子可以是分離的或者與它們通常不相關(guān)的結(jié)構(gòu)或化合物相關(guān)聯(lián)。GPR84已被鑒定為中鏈游離脂肪酸的受體(Wang等，(2006)同上)。許多物種中存在GPR84蛋白，包括人、小鼠、大鼠等，根據(jù)本發(fā)明可使用編碼這些蛋白質(zhì)中任何一種的核酸分子。在這方面，本發(fā)明包括表1所列編碼GPR84蛋白的核酸分子。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*%相同性基于與人GPR84蛋白的比對(duì)。在一些實(shí)施方式中，核酸分子編碼人G2R84蛋白。在其它實(shí)施方式中，核酸分子編碼SEQIDNO:1的人GPR84蛋白。在具體實(shí)施方式中，編碼人GPR84蛋白的核酸分子如SEQIDNO:9所示。功能上說(shuō)，本文所述的GPR84蛋白是相關(guān)的7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，據(jù)信參與味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)構(gòu)上說(shuō)，GPR84家族成員的核苷酸序列可編碼相關(guān)蛋白，包括胞外區(qū)、7個(gè)跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。來(lái)自其他物種的相關(guān)GPR84家族成員在長(zhǎng)度至少約50個(gè)氨基酸殘基，任選IOO、200、300或更多個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域內(nèi)與SEQIDNO:1，3，5或7有至少約為60%、70%、800/o或90%的蛋白質(zhì)序列相同性。GPR84氨基酸序列的特定區(qū)域可用于鑒別GPR84家族成員的多態(tài)性變體，種間同系物和等位基因。這種鑒別可體外進(jìn)行，例如在嚴(yán)格雜交條件下或PCR(如，采用編碼GPR84共有序列的引物)，或通過(guò)使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的序列信息與其他核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。單一物種群體內(nèi)GPR84基因的不同等位基因也可用于確定等位基因序列的差異是否與群體成員間的味覺(jué)差異有關(guān)。經(jīng)典的PCR型擴(kuò)增和克隆技術(shù)可用于分離同源基因，例如簡(jiǎn)并足以檢測(cè)物種間的相關(guān)基因的引物，通常比單一物種內(nèi)GPR84家族的共生同源成員具有更高水平的相同性。通常，GPR84家族的多態(tài)性變體和等位基因的鑒別可通過(guò)比較約25個(gè)氨基酸或更多，例如50-100個(gè)氨基酸的氨基酸序列來(lái)進(jìn)行。至少約60%，70%，75%，80%，85%，90%，95-99%，或更高的氨基酸相同性通常表明，蛋白質(zhì)是T1R家族成員的多態(tài)性變體、種間同系物、或等位基因。序列比對(duì)可采用任何常規(guī)序列對(duì)比算法進(jìn)行。特異性結(jié)合GPR84多肽的抗體或其保守區(qū)域也可用于鑒別等位基因、種間同系物和多態(tài)性變體。本發(fā)明的一個(gè)方面中，GPR84核苷酸序列如下atgtggaacagctctgacgccaacttctcctgctaccatgagtcgtgctcaccctactggccttggccatccagcccaagctccgtacccgattcaacctgetcatagccaacctcacactggctgatctcctctactgcacgctccttcagcccttctctgtggacacctacctccacctgcactgaccctctgcctcatcgcactgggacgctacctcctcattgcccaccctaagctttttccccaagttttcagtgccaaggggatagtgctggcactggtgagcacctgggttgtgggcgtggccagctttgctcccctaccaccatcctcatgggcatctactttgtgcttgggctcagcagtgttggcatcttctattgcctcatccggacccagtgaggggatttcatctgagccagtcagtgctgccaccacccagaccctggaaggggactcatcgaatgtgttttgctgtgttcctctgctttgccctgagctacatccccttcttgctgctcaacattctggcaaccctgtgctctatgcagccatgaaccgccaattccgccaagcatatggctccattttaaaaagagggccccggagtttccataggctccattag本發(fā)明的一個(gè)方面中，GPR84氨基酸序列如下ILMGIYFVLGLSSVGIFYCL工HRQVKRAAQALDQYKLRQASIHSNHVARTDEAMPGRFQELDSRLASGGPSEGISSEPVSAATTQTIiEGDSSEVGDQINSKRAKQMAEKSPPEASAKAQPIKGARRAPDSSSEFGKVTRMCFAVFLCFALSYIPFLLLNILDARVQAPRWHMLAANLTWLNGC工NFVXYAAMNRQFRQAYGSILKRGPRSFHRLH除GPR84之外，本發(fā)明的核酸分子還編碼由G蛋白(Xq亞單位組成的嵌合鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)，其中C-端9個(gè)殘基被G蛋白質(zhì)ai亞單位的對(duì)應(yīng)部分取代。該嵌合G蛋白稱為Gqi9，是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)Parmentier等，(1998)Mol.Pharmacol.53(4):778-86;Perroy等，((2001)J.Biol.Chem.276:45800-45805)對(duì)于磷脂酶C的偶聯(lián)受體的描述。通過(guò)示例的方式，GENBANK登錄號(hào)NP—002063.2(SEQIDNO:IO)所示Gq亞單位的9個(gè)C端氨基酸殘基被G蛋白(Xi亞單位的9個(gè)C端氨基酸殘基，即被Asn-Asn-Leu-Lys-Asp-Cys-Gly-Leu-Phe(SEQIDNO:ll)取代。雖然本發(fā)明中優(yōu)選采用人Gq亞單位，但也可使用非人Gq亞單位。例如，表2所列的Gq亞單位適用于本發(fā)明。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*%相同性基于與人Gq蛋白亞單位的比對(duì)。根據(jù)本發(fā)明使用的Gq亞單位優(yōu)選在長(zhǎng)度至少約50個(gè)氨基酸殘基，任選地長(zhǎng)度IOO、200、300或更多個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域內(nèi)與SEQIDNO:10，13或15具有至少約90。/。蛋白質(zhì)序列相同性。如GPR84所述，可采用許多常規(guī)方法，采用嚴(yán)格雜交條件或抗體交叉反應(yīng)來(lái)鑒別相關(guān)序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，下文所示為嵌合蛋白——人鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(q)a亞單位，其最后的9個(gè)殘基被鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(i)a亞單位所取代atgactctggagtccatcatggcgtgctgcctgagcgaggaggccaaggaaagctgctgctgctcgggacaggagagagtggcaagagtacgtttatcaagcagatgagaatcatccatgcaattagttcgagaagttgatgtggagaaggtgtctgcttttgagaatccatatgtagatgcaataaagagtttctagtagcgcttagtgaatatgatcaagttctcgtggagtcagacaatgagaaccgaatggaggaaaccccagagagatgcccaggcagcccgagaattcattctgaagatgttcgtggacctgaacccagacagttcaaggacaccatcctccagaacaacctgaaggactgcggcctcttctaa在本發(fā)明的一個(gè)方面中，Gqi9的氨基酸序列如下MTLESIMACCLSEEAKEARRINDEIERGLRRDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGSGYSDEDKRGFTKLVYQNIFTAMQAMIRAMDTLKIPYKYEHNKAHAQLVREVDVEKVSAFENPYVDAIKSL麗DPG工QECYDRRREYQLSDSTKYYLNDLDRVADPAYLPTQQDVL本發(fā)明核酸分子中還包括編碼CD36的序列。已提出GPR120和CD36形成脂肪酸接收的獨(dú)立途徑(Matsumura等，(2007)Biomed.Res.28:49-55)。而且，考慮CD36還與GPR84在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和飲食脂質(zhì)的傳感中聯(lián)合起作用。因此，本發(fā)明涵蓋CD36與GPR84和Gqi9的共表達(dá)。雖然本發(fā)明優(yōu)選采用人CD36，但也可使用非人CD36。例如，表3所列的CD36蛋白適用于本發(fā)明。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*%相同性基于與人CD36蛋白的比對(duì)。既然本文所述的CD36蛋白用作脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，本發(fā)明涵蓋了在長(zhǎng)度至少約50個(gè)氨基酸殘基，任選地長(zhǎng)度100、200、300或更多個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域內(nèi)與SEQIDNO:17，19或21具有至少約90%蛋白質(zhì)序列相同性的其他CD36蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面中，CD36核苷酸序列如下tattctaatgccagttggagacctgcttatccagaagacaattaaaaagcaagttgtcctcgaagaaggtacaattgcttttaaaaattgggttaaaacaggcacagaagtttacagacagttttggatctttgatgtgcaaaatccacaggaagtgatgatgaacagcagcaacattcaagttaagcaaagaggtccttatacgtacagagttcgttttctagccaaggaaaatgtaacccaggacgctgaggacaacacagtctctttcctgcagcccaatggtgccatcttcgaaccttcactatcagttggaacagaggctgacaacttcacagttctcaatctggctgtgttccgtaccctgttactaccacagttggtctgttttatccttacaacaatactgcagatggagtttataaagttttcaatggaaaagataacataagtaaagttgccataatcgacacatataaaggtaaaaggaatctgtcaatgcaaagaagggagacctgtgtacatttcacttcctcattttctgtatgcaagtcctgatgtttcagaaggtgatgagsaggcaaacatgttcagaagtcaagtaactggaaaaataaacctccttggcctgatagaaat在本發(fā)明的一個(gè)方面中，CD36的氨基酸序列如下:MGCDRNCGL工AGAVIGAVLAVFGGILMPVGDLLIQKTIKKQWLEEGT工AFKNWVKTGTEVYRQFW工FDVQNPQEVMMNSSNIQVKQRGPYTYRVRFLAKENVTQDAEDNTVSFLQPNGAIFEPSLSVGTEADNFTVLNLAVAAASH工YGN(2FVQMILNSL工NKSKSSMFQVRTLRELLWTIGDEKANMFRSQVTGKINLLGLIEMILLSVGVVMFVAFMISYCACRSKTIK本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列可通過(guò)編碼核酸序列的推定翻譯來(lái)鑒別。這些氨基酸序列和編碼核酸序列可采用許多方法相互比較或與其他序列進(jìn)行比較。例如，在序列比對(duì)中，通常一個(gè)序列用作參比序列，測(cè)試序列與其進(jìn)行比較。采用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要設(shè)定坐標(biāo)軸，然后指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂肂LASTN和BLASTP程序的默認(rèn)程序參數(shù)，如下所述，或者指定參數(shù)。然后序列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的百分序列相同性。本文所用"比較窗"包括在毗連位置數(shù)例如20-600，通常約50-200或約100-150個(gè)位置中的任一個(gè)區(qū)段內(nèi)，最佳排列后將序列與相同毗連位置數(shù)的參比序列進(jìn)行比較。用于比較的序列的排列方法是本領(lǐng)域所公知的。用于比較的序列的最佳排列可通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)，例如Sm池和Waterman的局部同源性算法((1981)Adv.Appl.Math.2:482)，Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法((1970)J.Mol.Biol.48:443)，Pearson和Lipman的搜索相似性方法((1988)Proc.Natl.AcadSci.USA85:2444)，這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(威斯康星遺傳軟件包(VisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳計(jì)算機(jī)公司(GeneticsComputerGroup),威斯康星州麥迪遜)，或通過(guò)手動(dòng)比對(duì)和視覺(jué)檢查(參見(jiàn)例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)(1995)Ausubd等編，增補(bǔ)本)。適用于測(cè)定百分序列相同性的算法的一個(gè)優(yōu)選的例子是BLAST和BLAST2.0算法，參見(jiàn)Latched等，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等，(1990)J.MolBiol.215:403-410的描述。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過(guò)生物技術(shù)信息國(guó)立中心公眾可得。該算法包括首先通過(guò)鑒別詢問(wèn)序列中長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒別高得分序列對(duì)(HSP)，與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字對(duì)齊時(shí)匹配或滿足某一正值閾得分T。T表示鄰域字得分閾值(Altschul等，(1990)同上；Altschul等，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402)。這些初始鄰域字值(wordhit)用作啟動(dòng)搜索的種子以發(fā)現(xiàn)包含它們的較長(zhǎng)的HSP。該字值沿各個(gè)序列雙向延伸直到累積比對(duì)得分增加。累積得分是采用核苷酸序列，參數(shù)M(對(duì)于一對(duì)匹配的殘基的犒賞得分；總是>0)計(jì)算的。對(duì)于氨基酸序列，采用評(píng)分矩陣來(lái)計(jì)算累積得分。當(dāng)累積比對(duì)得分從其最大實(shí)現(xiàn)的值下降量X時(shí)；由于一種或多種負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的累積而導(dǎo)致累積得分變成零或零以下時(shí)；或者到達(dá)序列末端時(shí)，字值沿各個(gè)方向的延伸停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)(W)11，期望值(E)10，M=5，N=4，兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP采用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)3，期望值(E)10，BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見(jiàn)，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nati.Acad.Sci.USA89:10915)為比對(duì)(B)50，期望值(E)IO，M=5，Nz=4，兩條鏈的比較。有用的算法的另一個(gè)例子是PILEUP。PILEUP采用進(jìn)行性配對(duì)比對(duì)產(chǎn)生來(lái)自相關(guān)序列組的多重序列比對(duì)以顯示關(guān)系和百分序列相同性。它還繪制所謂的"樹(shù)"或"樹(shù)圖"，顯示用于產(chǎn)生比對(duì)的成簇關(guān)系。PILEUP采用Fang和Doolittle((1987)J.Mol.Evol.35:351-360)的進(jìn)行性比對(duì)方法的簡(jiǎn)化形式。所用方法類似于Higgins和Sharp((1989)CABIOS5:151-153)所述的方法。程序可比對(duì)至多300個(gè)序列，各自的最大長(zhǎng)度為5000個(gè)核苷酸或氨基酸。多重比對(duì)程序從兩個(gè)最相似序列的配對(duì)比對(duì)開(kāi)始，產(chǎn)生兩個(gè)比對(duì)序列的簇。然后將該簇與下一最相關(guān)序列或比對(duì)序列的簇進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)序列簇通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)序列的配對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)單延伸進(jìn)行比對(duì)。最終的比對(duì)可通過(guò)一系列進(jìn)行性配對(duì)比對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該程序的運(yùn)行包括指定具體序列及其氨基酸或核苷酸坐標(biāo)軸中用于序列比較的區(qū)域，并指定程序參數(shù)。采用PILEUP，將參比序列與其他測(cè)試序列進(jìn)行比較以確定百分序列相同性關(guān)系，參數(shù)如下默認(rèn)間隙權(quán)重(3.00)，默認(rèn)間隙長(zhǎng)度權(quán)重(0.10)和加權(quán)端隙。PILEUP可從GCG序列分析軟件包(Devereaux等，(1984)Nuc.AcidsRes.12:387-395)獲得。如本文所示，采用BLASTP算法進(jìn)行的本發(fā)明人蛋白質(zhì)序列與公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有已知蛋白質(zhì)的比較表明，與人序列具有至少約80%氨基酸相同性的其他GPR84、G。亞單位和CD36蛋白具有強(qiáng)同源性。作為直接氨基酸或核酸序列比較的替代方式，合適的GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白可通過(guò)嚴(yán)格雜交條件下的核酸分子(例如，表1-3所示的核酸分子或其探針)與其他種類的核酸(例如，基因組或cDNA序列)的雜交來(lái)鑒別。短語(yǔ)"嚴(yán)格雜交條件"表示通常在核酸的復(fù)雜混合物中，探針可與其靶序列雜交但不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，不同環(huán)境中不同。較長(zhǎng)的序列在較高的穩(wěn)定性同源性雜交。核酸雜交的詳細(xì)指導(dǎo)參見(jiàn)Tijssan(1993)，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,HybridizationwithNucleicProbes(生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)，與核酸探針的雜交)，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays(雜交原理綜述與核酸分析戰(zhàn)略)"。通常，選定的嚴(yán)謹(jǐn)條件為在規(guī)定的離子強(qiáng)度、pH下，比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-l(TC。Tm是平衡時(shí)50%的與靶互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)(靶序列過(guò)量，TmT，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件是鹽濃度小于約1.0M鈉離子，通常約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH7.0-8.3，對(duì)于短探針(例如10-50個(gè)核苷酸)溫度至少約為3(TC，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核苷酸)溫度至少約為60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過(guò)加入去穩(wěn)定劑甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。為實(shí)現(xiàn)選擇性或特異性雜交，正信號(hào)是背景的至少2倍，任選10倍。示例性的雜交嚴(yán)謹(jǐn)條件如下50%甲酰胺，5XSSC和P/oSDS，在42。C孵育(或5XSSC，1%SDS，在65。C孵育)，在65i:用0.2XSSC和0.1%SDS洗滌。這種雜交和洗滌步驟可進(jìn)行例如1、2、5、10、15、30、60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。嚴(yán)謹(jǐn)條件下未能相互雜交的核酸如果它們所編碼的多肽實(shí)質(zhì)相關(guān)，則這些核酸仍然實(shí)質(zhì)相關(guān)。例如當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)發(fā)生上述情況。在這種情況下，核酸通常在中等嚴(yán)格雜交條件下雜交。示例性的"中等嚴(yán)格雜交條件"包括37。C在40%甲酰胺，1MNaCl，1%SDS的緩沖液中雜交，以及45"C在1XSSC中洗滌。這種雜交和洗滌步驟可進(jìn)行例如1、2、5、10、15、30、60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。陽(yáng)性雜交是背景的至少2倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易明白，可采用替代的雜交和洗滌條件來(lái)提供類似的嚴(yán)謹(jǐn)性條件。由本發(fā)明可知，編碼本發(fā)明GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白的核酸分子11可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法從許多來(lái)源分離得到，例如遺傳工程改造、擴(kuò)增、合成和/或重組表達(dá)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離和表達(dá)過(guò)程如下所述。采用PCR引物擴(kuò)增編碼GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白核酸，可任選地產(chǎn)生和篩選這些核酸文庫(kù)以鑒別適用于蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸。擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域所公知的，包括例如聚合酶鏈反應(yīng)，PCR(《PCR方案，方法與應(yīng)用指導(dǎo)》(PCRProtocols,aGuidetoMethodsandApplications)(1990)，Innis編，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress),紐約)；和《PCR策略》(PCRStrategies)(1995)，Innis編，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress,Inc.),紐約)；連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(參見(jiàn)例如，Wu(1989)Genomics4:560;Landegren(1988)Science241:1077;Barringar(1990)，Gene89:117);轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見(jiàn)例如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173);自動(dòng)維持序列復(fù)制(參見(jiàn)例如，Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874);QP復(fù)制酶(QBetareplicase)擴(kuò)增(參見(jiàn)例如，Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477-1491);自動(dòng)Q-P復(fù)制酶擴(kuò)增試驗(yàn)(參見(jiàn)例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes10:257-271)和其他RNA聚合酶-介導(dǎo)的技術(shù)(例如，NASBA;看基因公司(Cangene)，安大略省米西索加(Mississauga，Ontario))。引物可設(shè)計(jì)成保留感興趣蛋白質(zhì)的原始序列。或者，引物可編碼保守取代(例如，疏水取代疏水殘基)或功能良性取代(例如，不阻礙質(zhì)膜插入，導(dǎo)致肽酶裂解，導(dǎo)致受體異常折疊等)的氨基酸殘基。一旦擴(kuò)增，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法單獨(dú)或以文庫(kù)形式克隆核酸。事實(shí)上，操縱核酸的技術(shù)，例如在序列中產(chǎn)生突變、亞克隆、標(biāo)記探針、測(cè)序、雜交等是科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中公開(kāi)描述的。參見(jiàn)例如，Sambrook編，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(第2版)，第1-3巻，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory)禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(最親jf分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)(1997)Ausubel編，約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.),紐約。作為擴(kuò)增和/或克隆的替代方式，可根據(jù)公知的化學(xué)合成技術(shù)來(lái)合成本發(fā)明的核酸，例如參見(jiàn)Carruthers(1982)ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.47:411-418;Adams(簡(jiǎn))Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25:3440-3444;Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19:373-380;Blommers(1994)10Biochemistry33:7886-7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109所述。然后，合成互補(bǔ)鏈并使該連在適當(dāng)條件下退火在一起而獲得雙鏈DNA片段，或者采用具有適當(dāng)引物序列的DNA聚合酶，通過(guò)加入互補(bǔ)鏈而獲得雙鏈DNA片段。一旦獲得，將編碼GPR84、Gq亞單位和CD36蛋白的核酸引入重組蛋白表達(dá)的表達(dá)載體中。根據(jù)指定用途(例如，在表型或配體結(jié)合試驗(yàn)中)，可釆用任何表達(dá)載體系統(tǒng)，除哺乳動(dòng)物細(xì)胞外，包括例如細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)或植物系統(tǒng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"表示用于在任意細(xì)胞，包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)本發(fā)明核酸分子的任何重組表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括線性或環(huán)形表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括保持游離或整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)具有自身復(fù)制的能力，或者不具有，即在細(xì)胞中僅短暫表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)包括僅含有重組核酸轉(zhuǎn)錄所需最少元件的重組表達(dá)盒。為實(shí)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)，要求本發(fā)明核酸可操作地連接于轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，例如轉(zhuǎn)錄和翻譯引發(fā)序列，、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列和用于將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的其他序列。在重組核酸分子和載體的結(jié)構(gòu)中，啟動(dòng)子可操作地連接一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸分子，以介導(dǎo)所需核酸在細(xì)胞或組織的所有類型或亞類中的表達(dá)。"啟動(dòng)子"定義為介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸陣列。如本文所用，啟動(dòng)子包括陣列開(kāi)始位置附近的必需核酸序列，例如對(duì)于聚合酶II型啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)是TATA元件。啟動(dòng)子也任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑物元件，它們可離開(kāi)陣列開(kāi)始位置差不多幾千個(gè)堿基對(duì)的距離。在具體實(shí)施方式中，采用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。"組成型"啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下具有活性的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的例子包括但不限于P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子、"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)中具有活性的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括但不限于人c-fos啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和小分子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"表示核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置的陣列)與第二核酸分子之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，將編碼GPR84、CD36和的核酸分子串聯(lián)引入一個(gè)表達(dá)載體中，用于在宿主細(xì)胞中以單獨(dú)蛋白質(zhì)的形式表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，將編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子各自引入不同的表達(dá)載體中，用于在宿主細(xì)胞共表達(dá)。在另一些實(shí)施方式中，釆用編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子的各種組合的兩個(gè)表達(dá)載體(例如，一個(gè)表達(dá)載體包含GPR84和Gqi9核酸，另一個(gè)表達(dá)載體包含CD36核酸)。此外，還考慮本發(fā)明蛋白質(zhì)可以融合蛋白的形式表達(dá)，例如GPR84-Gqi9融合蛋白。將編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串聯(lián)引入表達(dá)載體，用于在宿主細(xì)胞中共表達(dá)單獨(dú)的蛋白質(zhì)的情況下，一些實(shí)施方式包括使用一種用于調(diào)節(jié)所有三種蛋白質(zhì)的表達(dá)的啟動(dòng)子。這樣，編碼G2R84、CD36和Gqi9的核酸分子相互間被內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)隔離。IRES元件已知來(lái)自病毒和哺乳動(dòng)物基因(Martinez-Salas(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:458-64)，并且也已在小合成寡核苷酸的篩選中鑒別(Vankatesan禾卩Dasgupta(2001)Mol.Cell.Biol.21:2826-37)。已詳細(xì)分析來(lái)自腦心肌炎病毒的IRES(Mizuguchi等，(2000)Mol.Ther.1:376-82)。IRES是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的RNA中真核核糖體可結(jié)合并啟動(dòng)翻譯的結(jié)構(gòu)的DNA中的編碼元件。IRES能夠從單個(gè)RNA分子產(chǎn)生兩種或更多種蛋白質(zhì)(第一種蛋白質(zhì)是5'-端封端結(jié)構(gòu)處結(jié)合RNA的核糖體的翻譯得到的，(Martinez-Salas(1999)同上)?；蛘?，其他實(shí)施方式包括將編碼GPR84、CD36和Gqi9的核酸分子串聯(lián)引入一個(gè)表達(dá)載體中，其中各個(gè)蛋白質(zhì)的編碼序列具有其各自的調(diào)節(jié)序列。這樣，本發(fā)明的具體實(shí)施方式包括順序含有以下序列的核酸分子啟動(dòng)子CD36編碼序列一多聚腺苷酸信號(hào)一啟動(dòng)子2—Gqi9編碼序列一多聚腺苷酸信號(hào)一啟動(dòng)子3—GPR84編碼序列一多聚腺苷酸信號(hào)，其中啟動(dòng)子w可相同或不同，或者誘導(dǎo)型或組成型。將表達(dá)載體，用于共表達(dá)GPR84、CD36或Gqi9蛋白的單獨(dú)的表達(dá)載體，或者含有編碼GPR84、CD36和Gqi9蛋白的核酸的一個(gè)表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞基因組中或引入胞質(zhì)或細(xì)胞核中，通過(guò)科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)領(lǐng)域所公知的各種常規(guī)技術(shù)進(jìn)行表達(dá)。例如參見(jiàn)，Roberts,(1987)Nature328:731;和Sambrook編，(1989)同上)。來(lái)自生物試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備生產(chǎn)商的產(chǎn)品信息也提供了關(guān)于已知的生物方法的信息。載體可從天然來(lái)源分離，從諸如ATCC或GENBANK文庫(kù)等來(lái)源獲得，或者通過(guò)合成或重組方法制備。本發(fā)明的核酸可以在細(xì)胞中穩(wěn)定或短暫維持的表達(dá)盒或載體(包括質(zhì)粒和病毒)中表達(dá)(例如游離型表達(dá)系統(tǒng))。可將選擇標(biāo)記物引入表達(dá)盒和載體中，以賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標(biāo)記物可編碼游離型維持與復(fù)制，從而不再要求整合到宿主基因組中。例如，標(biāo)記物可編碼抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素)或除草劑抗性(如，氯磺隆(chlorosulfiiron))以實(shí)現(xiàn)用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞的選擇(參見(jiàn)例如，Blondelat誦Rouault(1997)，Gene190:315-317;Aubrecht(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:992-997)。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括用于共表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞。據(jù)稱本發(fā)明的蛋白質(zhì)"共表達(dá)"，因?yàn)橛镁幋aGPR84、CD36或Gqi9蛋白的核酸轉(zhuǎn)染時(shí)，宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯GPR84、CD36或Gqi9蛋白。"宿主細(xì)胞"表示包含表達(dá)載體并且支持表達(dá)載體的復(fù)制或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母，昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培養(yǎng)的細(xì)胞、外植體和體內(nèi)細(xì)胞。如上所述，宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。可使用將本發(fā)明表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞的任何公知的方法。這些方法包括利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、凝聚胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、顯微注射、等離子體載體，病毒載體以及用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外來(lái)遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞的任何其他公知方法(參見(jiàn)例如，Sambrook等，同上)。將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞之后，在有利于本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。共表達(dá)來(lái)自一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體的GPR84、CD36或Gqi9蛋白的本發(fā)明的宿主細(xì)胞可用于分析脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和感應(yīng)飲食脂質(zhì)以及鑒別調(diào)節(jié)GPR84活性的試劑的方法中。因此，本發(fā)明也提供了篩選GPR84活性調(diào)節(jié)劑的方法，例如活化劑、抑制劑、刺激劑、增強(qiáng)劑、激動(dòng)劑和拮抗劑。這些GPR84活性的調(diào)節(jié)劑可用于味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥理學(xué)、化學(xué)和遺傳調(diào)節(jié)。這些篩選方法可用于鑒別味細(xì)胞活性的高親和力激動(dòng)劑和拮抗劑。這些調(diào)節(jié)性化合物可以在食品和藥品工業(yè)15中用于定制味道，例如調(diào)節(jié)食品的味道。GPR84活性的"抑制劑"、"活化劑"和"調(diào)節(jié)劑"可互換使用，表示用本發(fā)明試驗(yàn)鑒別的抑制性、活化性或調(diào)節(jié)性分子。抑制劑是例如結(jié)合，部分或完全阻斷刺激、降低、防止、延遲活化、滅活、脫敏或下調(diào)GPR84活性的化合物，例如拮抗劑?；罨瘎┦抢缃Y(jié)合、刺激、提高、打開(kāi)、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活化、致敏、或上調(diào)GPR84活性的化合物，例如激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑也包括例如改變受體與結(jié)合活化劑或抑制劑、G蛋白或激酶的胞外蛋白間相互作用的化合物。抑制劑或活化劑的試驗(yàn)包括例如，在細(xì)胞或細(xì)胞膜中表達(dá)GPR84、CD36和G^，施加假定的調(diào)節(jié)劑化合物，然后測(cè)定對(duì)味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能性影響。將對(duì)潛在的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑的試驗(yàn)結(jié)果與沒(méi)有抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以檢査GPR84活性的調(diào)節(jié)程度。將對(duì)照樣品(未用調(diào)節(jié)劑處理)的相對(duì)GPR84活性值設(shè)定為100%。當(dāng)GPR84活性值相對(duì)于對(duì)照約為80%，任選地50%或25-0%時(shí)，實(shí)現(xiàn)GPR84的抑制。當(dāng)GPR84活性值相對(duì)于對(duì)照為110%，任選地150%，任選地200-500%，或1000-3000%時(shí)，實(shí)現(xiàn)GPR84的活化。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)和表征味覺(jué)調(diào)節(jié)的試驗(yàn)，其中使用GPR84作為報(bào)告分子以確定調(diào)節(jié)劑對(duì)脂肪酸味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能性影響。試驗(yàn)內(nèi)容中調(diào)節(jié)GPR84活性的測(cè)試化合物的"功能性影響"包括間接或直接地受到受體影響，例如功能、物理和化學(xué)影響的任何參數(shù)的確認(rèn)。包括配體結(jié)合、離子流的改變、膜電位、電流量、轉(zhuǎn)錄、G蛋白結(jié)合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體-配體相互作用、第二信使?jié)舛?例如，cAMP、cGMP、lP3或胞內(nèi)Ca")。試驗(yàn)內(nèi)容中"確定功能性影響"表示在GPR84的影響，例如功能、物理和化學(xué)影響下，間接或直接地增加或降低參數(shù)的化合物的試驗(yàn)。這些功能性影響可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)行測(cè)定，例如分光光度特征的改變(例如熒光、吸收度、折射率)、流體動(dòng)力學(xué)特征(例如，形狀)、色譜特征或溶解度特性；膜片鉗；壓敏染料；全細(xì)胞電流；放射性同位素通量；誘導(dǎo)型標(biāo)記物；配體結(jié)合試驗(yàn)；電壓、膜地位和導(dǎo)電性改變；離子流試驗(yàn)；胞內(nèi)第二信使如cAMP、CGMP和肌醇三磷酸(IP3)的改變；胞內(nèi)鈣水平的改變；等等。味覺(jué)受體結(jié)合促味劑并啟動(dòng)化學(xué)刺激向電信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)?；罨蛞种频腉蛋白質(zhì)將改變目標(biāo)酶、通道和其他效應(yīng)蛋白的性質(zhì)。一些例子是視覺(jué)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白導(dǎo)致的CGMP磷酸二酯酶的活化，刺激性G蛋白導(dǎo)致的腺苷酸環(huán)化酶的活化，Gq和其他關(guān)聯(lián)G蛋白導(dǎo)致的磷脂酶C的活性，以及Gi和其他G蛋白導(dǎo)致的各種通道的調(diào)節(jié)。也可由磷脂酶C導(dǎo)致的二酰甘油和IP3的產(chǎn)生，IP3導(dǎo)致的鈣運(yùn)動(dòng)來(lái)檢查下游結(jié)果。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)宿主細(xì)胞中FURA-2-依賴性熒光監(jiān)測(cè)胞內(nèi)鈣的變化來(lái)檢測(cè)GPR84的活化?；罨腉PCR受體成為將受體C端尾部(以及可能的其他位點(diǎn))磷酸化的激酶的底物。因此，活化劑可促進(jìn)"P從Y標(biāo)記的GTP轉(zhuǎn)移到受體，可用閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行分析。C端尾部的磷酸化將促進(jìn)抑制蛋白(arrestin)樣蛋白質(zhì)的結(jié)合并干擾與G蛋白質(zhì)的結(jié)合。激酶/抑制蛋白途徑在許多GPCR受體的脫敏過(guò)程中起關(guān)鍵作用。例如，調(diào)節(jié)味覺(jué)受體持續(xù)時(shí)間的化合物保持活性可用作延長(zhǎng)所需味道或切斷令人不快味道的方式。GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般綜述以及分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法可參見(jiàn)例如，《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)，第237和238巻(1994)和第96巻(1983);Bourne等，(1991)Nature10:349:117-27;Bourne等，(1990)Nature348:125-32;Pitcher等，(1998)Annu.Rev.Biochem.67:653-92。如上所述，可進(jìn)行離子流分析以確定化合物是否能夠調(diào)節(jié)GPR84活性。離子流的變化可通過(guò)測(cè)定表達(dá)GPR84蛋白的細(xì)胞或膜的離子極化(即電位)來(lái)評(píng)價(jià)。測(cè)定細(xì)胞極化變化的一種方式是用壓片鉗和膜片鉗技術(shù)測(cè)量電流變化(從而測(cè)量極化的改變)(參見(jiàn)例如，Ackerman等，(1997)NewEngl.JMed.30336:1575-1595)。采用表征方法可方便地測(cè)定全細(xì)胞電流。其他已知的試驗(yàn)包括放射性標(biāo)記的離子流試驗(yàn)和利用壓敏染料的熒光試驗(yàn)(參見(jiàn)例如，Vestergarrd-Bogind等，(1988)J.MembraneBiol.88:67-75;Gonzales&Tsien(1997)Chem.Biol.4:269-277;Daniel等，(1991)J.Pharmacol.Meth.25:185-193;Holevinsky等，(1994)J.MembraneBiology137:59-70)。一般來(lái)說(shuō)，待測(cè)化合物的濃度在從1pM到100mM的范圍內(nèi)。測(cè)試化合物對(duì)GPR84功能的影響可通過(guò)檢查上述任一種參數(shù)來(lái)測(cè)定。影響GPCR活性的任何合適的生理學(xué)變化可用于評(píng)價(jià)測(cè)試化合物對(duì)GPR84的影響。用完整細(xì)胞或動(dòng)物測(cè)定功能結(jié)果時(shí)，也可測(cè)量諸如遞質(zhì)釋放、激素釋放、已知和未表征遺傳標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄變化(northem印跡)、細(xì)胞代謝改變(例如細(xì)胞生長(zhǎng)或pH變化)、胞內(nèi)第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的變化等各種影響。GPCR的優(yōu)選試驗(yàn)包括負(fù)載離子或壓敏染料以報(bào)告受體活性的細(xì)胞。測(cè)定這種受體活性的試驗(yàn)也可采用其他G蛋白偶聯(lián)受體的己知激動(dòng)劑和拮抗劑作為陰性或陽(yáng)性對(duì)照以評(píng)價(jià)測(cè)試化合物的活性。在鑒別調(diào)節(jié)性化合物(例如激動(dòng)劑、拮抗劑)的試驗(yàn)中，使用離子敏感或膜電壓熒光指示劑分別檢測(cè)胞質(zhì)中離子水平或膜電壓的變化?？墒褂玫碾x子敏感指示劑和電壓探針包括在分子探針(MolecularProbes)1997目錄中列出的那些。其他試驗(yàn)包括測(cè)定受體活性，當(dāng)受體活化時(shí)，通過(guò)激活或抑制諸如腺苷酸環(huán)化酶之類的酶，可導(dǎo)致胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸如cAMP或cGMP的水平發(fā)生變化。存在環(huán)狀核苷酸門(mén)控離子通道，例如桿狀感光細(xì)胞通道和嗅神經(jīng)元通道，cAMP或cGMP結(jié)合后陽(yáng)離子可滲透(例如參見(jiàn)，Altenhofan等，(1991)Proc.NatlAced.Sci.USA88:9868-9872和Dhallan等，(1990)Nature347:184-187)。試驗(yàn)中，當(dāng)受體活化導(dǎo)致環(huán)狀核苷酸水平降低時(shí)，優(yōu)選使細(xì)胞暴露于能夠增加胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸水平的試齊U，例如福斯高林(forskolin)，然后在細(xì)胞中加入受體活化化合物。該類試驗(yàn)中的細(xì)胞可以是用環(huán)狀核苷酸包圍的(cyclicnucleotide-crated)離子通道編碼DNA、GPCR磷酸酶和受體(例如，某些谷氨酸鹽受體、蕈毒堿乙酰膽堿受體、多巴胺受體、5-羥色胺受體等)編碼DNA共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞制備的，所述受體激活后可導(dǎo)致胞質(zhì)中環(huán)狀核苷酸水平改變。此外，熒光標(biāo)記的脂肪酸經(jīng)CD36的攝取可用作活性標(biāo)志。該試驗(yàn)可從分子裝置公司(MolecularDevices)(加利福尼亞州桑尼維爾(Sunnyvale，CA))等來(lái)源商業(yè)獲得，與FLIPR—起使用。也可使用表達(dá)GPR84的非人動(dòng)物進(jìn)行受體分析。這種表達(dá)可用于確定測(cè)試化合物在體內(nèi)是否能夠特異性結(jié)合哺乳動(dòng)物味覺(jué)跨膜受體多肽，該過(guò)程包括使測(cè)試化合物與用本發(fā)明核酸分子穩(wěn)定或短暫轉(zhuǎn)染的非人動(dòng)物相接觸，并通過(guò)測(cè)試化合物與受體多肽的特異性結(jié)合來(lái)確定動(dòng)物對(duì)測(cè)試化合物是否有反應(yīng)。用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染或感染的動(dòng)物尤其適用于鑒別和表征能夠結(jié)合特定或一組受體的促味劑/配體的試驗(yàn)。這些表達(dá)人化學(xué)感應(yīng)受體序列的載體感染的動(dòng)物可用于促味劑的體內(nèi)篩選及其對(duì)細(xì)胞生理學(xué)(例如對(duì)味覺(jué)神經(jīng)元)、對(duì)CNS或?qū)π袨榈挠绊?。感?表達(dá)核酸和載體的方法是本領(lǐng)域公知的。通過(guò)許多方式可測(cè)定各種單細(xì)胞、器官或整個(gè)動(dòng)物的參數(shù)。通過(guò)遞送感染試劑，例如腺病毒表達(dá)載體，本發(fā)明核酸分子例如可以在動(dòng)物味覺(jué)組織中表達(dá)。檢測(cè)為GPR84調(diào)節(jié)劑的化合物可以是任何小分子化學(xué)物質(zhì)或生物實(shí)體，例如蛋白質(zhì)、核酸或脂質(zhì)。通常，測(cè)試化合物是小化學(xué)分子和肽。本發(fā)明的試驗(yàn)中基本上任何化學(xué)物質(zhì)都可用作潛在的調(diào)節(jié)劑或配體，雖然常常使用溶于水性或有機(jī)(尤其是基于DMASO的)溶液的化合物。將設(shè)計(jì)試驗(yàn)成篩選大型化學(xué)物質(zhì)文庫(kù)，該過(guò)程包括自動(dòng)進(jìn)行試驗(yàn)步驟并由任何方便來(lái)源向試驗(yàn)提供化合物，通常平行進(jìn)行(例如，在機(jī)器試驗(yàn)中在微量滴定板上采取微量滴定模式)。應(yīng)理解，存在許多化合物的供應(yīng)商，包括西格瑪公司(Sigma)使蘇里州圣路易斯(St,Louis，MO))，阿爾德里奇公司(Aldrich)(密蘇里州圣路易斯)，西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-AldrichX密蘇里州圣路易斯)，F(xiàn)CBA公司(FlukaChemika-BiochemicaAnalytika)(瑞士布咨(Buchs，Switzerland))等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，高通量篩選方法包括提供含有大量潛在治療化合物(潛在調(diào)節(jié)劑或配體化合物)的組合化學(xué)或肽文庫(kù)。然后在如上所述的一種或多種試驗(yàn)中篩選這些文庫(kù)，以鑒別那些具有所需特征性活性的文庫(kù)成員(具體的化學(xué)類型或亞類)。所鑒別的化合物可用作常規(guī)的"先導(dǎo)化合物"或者其本身可用作潛在的或?qū)嶋H的治療劑。根據(jù)本發(fā)明鑒別的GPR84調(diào)節(jié)劑可用于任何食品、糖果、藥物組合物或其成分中，從而以所需方式調(diào)節(jié)產(chǎn)品、組合物、成分的味道。19權(quán)利要求1.一種編碼CD36、Gqi9和G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)蛋白的分離的核酸分子。2.包含如權(quán)利要求1所述的核酸分子的表達(dá)載體。3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述CD36、Gqi9和GPR84的表達(dá)為誘導(dǎo)型。4.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述'CD36、Gqj9和GPR84的表達(dá)為組成型。5.—種共表達(dá)CD36、Gqi9和GPR84蛋白的分離的重組宿主細(xì)胞。6.—種鑒別GPR84調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括使如權(quán)利要求5所述的重組宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物相接觸，并測(cè)定所述測(cè)試化合物對(duì)GPR84活性的功能性影響，從而鑒別GPR84的調(diào)節(jié)劑。7.通過(guò)權(quán)利要求6所述方法鑒別的GPR84的調(diào)節(jié)劑。全文摘要本發(fā)明提供了編碼CD36、G_qi9和G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)蛋白的分離的核酸以及共表達(dá)CD36、G_qi9和GPR84蛋白的載體和重組宿主細(xì)胞在鑒別GPR84活性調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/12GK101654676SQ20091016117公開(kāi)日2010年2月24日申請(qǐng)日期2009年8月3日優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日發(fā)明者H·王,J·M·蒙特茲,S·A·格拉維納申請(qǐng)人:國(guó)際香料和香精公司