專利名稱：：谷氨酸衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用酶反應(yīng)制備谷氨酸衍生物的方法。本發(fā)明還涉及用氨基酸之一的色氨酸作為出發(fā)原料，制備可用作甜味劑的莫納汀(乇大亍4^)的方法。
背景技術(shù)：
：下述結(jié)構(gòu)式(6)所示的4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基谷氨酸(即，3-(l-氨基-l，3-二羧基-3-羥基-丁烷-4-基)-巧l哚)(以下稱為"莫納汀")是南非的灌木Schlerochitomilicifolius的根含有的一種氨基酸，因?yàn)槠涮鹞稙檎崽堑臄?shù)百倍，所以是有望作為熱量特別低的甜味劑的化合物(參照特開昭64-25757號(hào)公報(bào))。4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基谷氨酸上述的莫納汀在2位和4位有不對(duì)稱碳原子，天然型莫納汀的立體異構(gòu)體為(2S，4S)型。此外，有關(guān)非天然型的立體異構(gòu)體，己證實(shí)存在3種通過合成制備的立體異構(gòu)體。而且，不僅是上述天然型的莫納汀，而且任何一種其他立體異構(gòu)體都具有高倍的甜度，其中的一種或多種的混合物都有望作為甜p木劑或甜味劑的成分(甜味料)而利用。至于莫納汀的制備方法，以前曾報(bào)導(dǎo)過5例。詳細(xì)如以下(1)-(5)的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)所述。(1)美國(guó)專利N0.5994559說明書(2)四面體快報(bào)(TetrahedronLetter),2001年，42巻39號(hào)，6793-6796頁(3)有機(jī)快報(bào)(OrganicLetter)，2000年，2巻19號(hào)，2967-2970頁(4)合成通訊(SyntheticCommunication)，1994年，24巻22號(hào)，3197-3211頁(5)合成通訊(SyntheticCommunication)，1993年，23巻、18號(hào)，2511-2526頁。但是，所有這些方法都需要多個(gè)步驟，而工業(yè)制備水平的合成莫納汀的方法至今尚未建立。因此，需要開發(fā)一種更簡(jiǎn)便，而且收率高的包括上迷莫納汀及其類似物的谷氨酸衍生物的工業(yè)制備方法。因此，本發(fā)明的目的是提供一種有效地制備期待作為甜味料成分的莫納汀及其類似物等的谷氨酸衍生物(包括其鹽的形式)的方法。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)上述的問題，經(jīng)過反復(fù)努力研究的結(jié)果，本發(fā)明者成功地實(shí)現(xiàn)了在對(duì)由下述通式(1)的取代oc-酮酸(通式(i)中，w及ie相互獨(dú)立，各自代表選自氫原子、碳原子數(shù)為1-8的烷基、碳原子數(shù)為1-8的烷氧基、碳原子數(shù)為2-9的羧烷基、碳原子數(shù)可至20的芳基、碳原子數(shù)可至20的芳烷基、含雜環(huán)的烴基、羥基的取代基。但是，W和R2中之一代表氫原子的場(chǎng)合，另一方不代表氫原子、甲基或乙基。此外，Ri和Fe中之一代表羥基的場(chǎng)合，另一方不代表氫原子或甲基。W含有芳香環(huán)或雜環(huán)的場(chǎng)合，該芳香環(huán)或雜環(huán)也可進(jìn)一步被卣原子、羥基、碳原子數(shù)可至3的烷基、碳原子數(shù)可至3的烷氧基和氨基所取代。)產(chǎn)生下述通式(2)(通式(2)中的R1及R2與通式(1)中的R1及R2的含意相同。)所示的谷氨酸衍生物的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，通過該反應(yīng)的進(jìn)行，生成上述通式(2)的谷氨酸衍生物(包括其鹽的形式)?；诖税l(fā)現(xiàn)，即完成了本發(fā)明。R2NH2根據(jù)本發(fā)明的谷氨酸衍生物制備方法，由下述式(7)所示的4-(吲咮-3-基甲基)-4-羥基-2-氣代戊二酸(以下稱為IHOG),利用酶反應(yīng)，能夠有效地制備下述式(6)所示的莫納汀。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基谷氨酸此外，本發(fā)明的發(fā)明者們利用本發(fā)明的谷氨酸衍生物的制備方法，開發(fā)了以氨基酸之一的色氨酸作為出發(fā)原料，具有下述反應(yīng)(D-③的新的莫納汀的制備方法。具有下述(D-③反應(yīng)的莫納汀的制備方法中，本發(fā)明的谷氨基衍生物的制備方法相當(dāng)于反應(yīng)③。由反應(yīng)①-③構(gòu)成的莫納汀的制備途徑如反應(yīng)式(8)所示。反應(yīng)1:在酶的存在下，由色氨酸合成吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)2:通過。引哚-3-丙酮酸與丙酮酸(或草酰乙酸)的醛醇縮合，合成前體酮酸(IHOG)反應(yīng)3:在酶的存在下，使IHOG的2位氨基化，合成莫納汀。0色氨酸丐1哚-3-丙酮酸莫納汀亦即，本發(fā)明如以下所述谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，在對(duì)由下述通式(1)的取代a-酮酸，COOH,COOHR9O(通式(1)中，R^及RZ相互獨(dú)立，各自代表選自氫原子、碳原子數(shù)為1-8的烷基、碳原子數(shù)為1-8的烷氧基、碳原子數(shù)為2-9的羧烷基、碳原子數(shù)可至20的芳基、碳原子數(shù)可至20的芳烷基、含雜環(huán)的烴基、羥基中的取代基。但是，W和R中之一代表氬原子的場(chǎng)合，另一方不代表氫原子、曱基或乙基。此外，R'和l^中之一代表羥基的場(chǎng)合，另一方不代表氫原子、曱基。R'含有芳香環(huán)或雜環(huán)的場(chǎng)合，該芳香環(huán)或雜環(huán)也可進(jìn)一步被卣原子、羥基、碳原子數(shù)可至3的烷基、碳原子數(shù)可至3的烷氧基和氨基所取代。)生成下述通式(2)所示的谷氨酸衍生物的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(通式(2)中的W及R與通式(1)中的R'及R"的含意相同。)通過該反應(yīng)的進(jìn)行，生成上述通式(2)的谷氨酸衍生物(包括其鹽的形式)。[1]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于上述的R'為苯甲基或3-吲哚基曱基，上述的112為羥基。[1]或[2]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的酶為脫氫酶或轉(zhuǎn)氨酶。[3]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的酶為轉(zhuǎn)氨酶，而且反應(yīng)系統(tǒng)中包含1種或多種的氨基酸作為氨基供體。[4]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的氨基酸選自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸。[3]-[5]所述的谷氨酸右f生物的制備方法，其特征在于，上述的酶為L(zhǎng)-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶。[3]-[5]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的酶為D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶。[7]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，反應(yīng)系統(tǒng)中含有具有對(duì)L-氨基酸轉(zhuǎn)換為D-氨基酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的活性的酶。[6]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶是來源于選自氣單胞菌屬、土壤桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、拜葉林克氏菌屬、埃希氏菌屬、變形菌屬和摩根氏菌屬的微生物的酶。[9]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的微生物選自嗜水氣單胞菌、根癌土壤桿菌、糞產(chǎn)堿菌、印度拜葉林克氏菌、大腸桿菌、雷氏普羅威登斯菌(Proteusrettgeri)以及摩氏摩根氏菌。[11][7]或[8]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶為來源于芽孢桿菌屬或類芽孢桿菌屬微生物的酶。[11]所述的谷氨酸右f生物的制備方法，其特征在于，上述的微生物選自球形芽孢桿菌、塵埃芽孢桿菌、浸麻芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、幼蟲類芽孢桿菌塵埃類芽孢桿菌亞種(Paenibacilluslarvaesubsp.pulvifaciens)以及浸麻類芽孑包桿菌。[1]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的酶為導(dǎo)入了D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的微生物所產(chǎn)生的酶。[13]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的微生物為大腸桿菌。[13]或[14]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因來源于球形芽孢桿菌或浸麻芽孢桿菌。谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，該方法至少包括下述[1]和[2]的步驟，在對(duì)由下述通式(3)所示的取代a-酮酸、(通式(3)中，R代表選自碳原子數(shù)為2-8的烷基、碳原子數(shù)為1-8的烷氧基、碳原子數(shù)為2-9的羧烷基、碳原子數(shù)可至20的芳基、碳原子數(shù)可至20的芳烷基、含雜環(huán)的烴基、羥基中的取代基。R含有芳香環(huán)或雜環(huán)的場(chǎng)合，該芳香環(huán)或雜環(huán)也可進(jìn)一步被囟原子、羥基、碳原子可至3的烷基、碳原子數(shù)可至3的烷氧基和氨基所取代。)和草酰乙酸或丙酮酸生成下述通式(4)所示的耳又,戈a-酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，(通式(4)中的R與通式(3)中的R含意相同。)通過該反應(yīng)的進(jìn)行，生成上迷通式(4)的:f又代oc-酮酸的步驟；[II]在對(duì)由上述通式(4)的取代的a-酮酸生成下述通式(5)(通式(5)中的R與通式(3)中的R含意相同。)所示的谷氨酸衍生物的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，通過該反應(yīng)的進(jìn)行，生成上述通式(5)的谷氨酸衍生物(包括其鹽的形式)的步驟。[16]所述的谷氨酸4汙生物的制備方法，其特征在于，上述的R為苯曱基或3-吲哚基曱基。[16]或[17]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，對(duì)上述步驟[1]的反應(yīng)進(jìn)^"催化的酶來源于選自假單胞菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、黃單胞菌屬的微生物。[18]所述的谷氨酸書于生物的制備方法，其特征在于，上述微生物為腐臭假單胞菌、暈斑假單胞菌'、解韌帶假單胞菌、歐文氏菌種、萊茵黃桿菌或柑橘黃單胞菌。[19]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，上述微生物為腐臭假單胞菌ATCC4683或暈斑假單胞菌AJ2791。[16]或[17]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征在于，對(duì)上述步驟[1]的反應(yīng)進(jìn)^f亍催化的酶為下述任何一種蛋白質(zhì)，U)具有序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(b)具有在序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)(c)具有序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(d)具有在序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)。[16]或[17]所述的谷氨酸衍生物的制備方法，其特征OHNH11在于，對(duì)上述步驟[1]中反應(yīng)進(jìn)行催化的酶來源于擴(kuò)增并表達(dá)編碼下述任何一種蛋白的基因的重組體，(a)具有序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(b)具有在序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)(c)具有序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(d)具有在序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)。莫納汀的制備方法，其特征在于該方法至少包括下述[A]-[C]的步驟，在對(duì)色氨酸轉(zhuǎn)化為吲"呆-3-丙酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，通過使色氨酸反應(yīng)，生成吲咮-3-丙酮酸的步驟在對(duì)由4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸生成莫納汀的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存.在下，通過使上述的4-(W哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸反應(yīng)，生成莫納汀的步驟。[23]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的步驟[A]是在對(duì)色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，通過使色氨酸反應(yīng)，得到吲哚-3-丙酮酸，做成反應(yīng)液，對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行脫氣處理、脫氧處理以及調(diào)節(jié)pH值至最高為2中的任何一種處理，收集p引咮-3-丙酮酸的步驟。[24]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的脫氣處理或脫氧處理是用惰性氣體置換上述反應(yīng)液中所含氣體的全部或一部分的方法。[25]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的惰性氣體是氮、氬和氦中的任一種。[24]-[26]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的pH調(diào)節(jié)是在上述反應(yīng)液中添加酸；還包括因pH調(diào)節(jié)的結(jié)果而使生成的吲哚-3-丙酮酸晶析，以及收集該晶體的步驟。[28][27]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的酸為碌L酸、鹽酸、硝酸和磷酸中的l壬何一種。[23]-[28]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述對(duì)步驟[A]的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶來源于具有氨基酸氧化酶活性和過氧化氫酶活性的微生物。[23]-[29]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述對(duì)步驟[A]的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶來源于無色桿菌屬、變形菌屬和摩根氐菌屬中的任何一個(gè)菌屬。[30]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述催化步驟[A]的反應(yīng)的酶來源于無色桿菌屬種AJ2425、雷氏普羅威登斯菌IFO13501、以及摩氏摩才艮氏菌IFO3168中的任何一種。[23]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的步驟[A]是將選自無色桿菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬、假單胞菌屬以及鏈孢霉屬的、具有轉(zhuǎn)化色氨酸為吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培養(yǎng)物作用于色氨酸，生成吲哚-3-丙酮酸，并收集該吲哚-3-丙酮酸的步驟。[23]-[32]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的步驟[B]在對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下進(jìn)行。[23]-[32]所述的莫納汀的制備方法，其特征在于，上述的步驟[B]用化學(xué)合成法進(jìn)行。具體實(shí)施例方式本發(fā)明者開發(fā)的谷氨酸衍生物的制備方法是，利用酶反應(yīng)，由下述通式(1)的取代oc-酮酸生成下述通式(2)的谷氨酸衍生物的方法，例如，是涉及利用催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶或產(chǎn)生該酶的微生物的作用，制備谷氨酸書f生物的方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(2)R2NH2此外，本發(fā)明者開發(fā)的以色氨酸為出發(fā)原料的莫納汀的制備方法具有下述反應(yīng)1-3。在具有下述反應(yīng)1-3的莫納汀的制備方法中，利用了作為反應(yīng)3的本發(fā)明的谷氨酸衍生物的制備方法，反應(yīng)1:在酶的存在下，由色氨酸合成口引哚-3-丙酮酸反應(yīng)2:通過吲咮-3-丙酮酸與丙酮酸(或草酰乙酸)的醛醇縮合,合成前體酮酸(IHOG)反應(yīng)3:在酶的存在下，IHOG的2位進(jìn)行氨基化，合成莫納汀。①，OH~^、》色氨酸"5|咮-3-丙酮酸OHOIHOG③O、"HO莫納汀(8)反應(yīng)l-3中，反應(yīng)1和3是用酶進(jìn)行的反應(yīng)，而對(duì)反應(yīng)2的實(shí)施方法無特定的限制，化學(xué)合成系統(tǒng)和酶系統(tǒng)都可以使用。本發(fā)明的莫納汀的制備方法不限于以色氨酸為出發(fā)物質(zhì)制備莫納汀的方法，上述反應(yīng)1-3中，可以將反應(yīng)3作為必要步驟包含在內(nèi)。亦即，以市售的吲哚-3-丙酮酸為出發(fā)物質(zhì)，通過反應(yīng)2和反應(yīng)3制備莫納汀的方法、以及以前體酮酸(IHOG)為出發(fā)物質(zhì)，通過反應(yīng)3制備莫納汀的方法等都包括在本發(fā)明內(nèi)。因此，下述(a)-(c)的方法全都符合本發(fā)明的莫納汀的制備方法。(a)反應(yīng)1+反應(yīng)2+反應(yīng)3(b)反應(yīng)2+反應(yīng)3H〕C〕oN:nNH14(C)只有反應(yīng)3此外，上述莫納汀的制備方法中的反應(yīng)2,不只是用于合成莫納汀的前體酮酸(IHOG),也可以用于制備在本發(fā)明的谷氨酸衍生物的制備方法中作為底物使用的取^a-酮酸。亦即，如下述式(10)所示，用由反應(yīng)2得到的通式(4)的取代oc-酮酸，通過反應(yīng)3制備通式(5)的谷氨酸衍生物的方法(反應(yīng)2+反應(yīng)3)也包4舌在本發(fā)明的谷氨酸衍生物的制備方法之內(nèi)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>以下，-接照反應(yīng)1反應(yīng)2反應(yīng)3的順序，參照附圖，對(duì)本發(fā)明詳細(xì)地進(jìn)行說明。[A]反應(yīng)1下述反應(yīng)式(11)中所示的反應(yīng)1是關(guān)于制備吲咮-3-丙酮酸的反應(yīng)。本發(fā)明中反應(yīng)1的特征在于，在對(duì)色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，通過^f吏色氨酸反應(yīng)，得到吲哚-3-丙酮酸，做成反應(yīng)液，對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)4于脫氣處理、脫氧處理以及調(diào)節(jié)pH值至最高為2中的任何一種處理，收集吲咮-3-丙酮酸。(1"色氨酸吲咮-3-丙酮酸現(xiàn)有的吲哚-3-丙酮酸的化學(xué)制備方法已知有GiovannaDeLuca等，以色氨酸為出發(fā)原料，在用于質(zhì)子受體脫氫的堿存在下，與吡咬醛反應(yīng)，得到收率為50-62%的吲哚-3-丙酮酸的方法(參照特表昭62-501912號(hào)公才艮、國(guó)際乂>布第87/00169號(hào)文本)。該方法中所必須的堿和吡啶醛非常昂貴，且收率低，結(jié)果造成制備成本非常高。另外，已知的方法還有，PolitiVincenzo等，用。引。朱和3-溴丙酮酸乙酯月虧(ethyl-3-bromopyruvateesteroxime)作為原料進(jìn)行縮合反應(yīng)后，再通過加酸水解，得到收率為64%的引哚-3-丙酮酸的方法(參照歐洲專利421946號(hào)公報(bào))。該方法中，必須要進(jìn)行用硅膠精制的步驟，收率低，原料價(jià)格也高，存在工業(yè)制備成本非常高的問題。另一方面，作為酶的制備方法，已知有使用轉(zhuǎn)氨酶的方法(參照下述式(12))。已報(bào)導(dǎo)的方法有使麥芽糖假絲酵母來源的L-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用于L-色氨酸(L-Trp)，由40mML-Trp和80mM2-酮戊二酸生成"引咮-3-丙酮酸，用離子交換樹脂等精制后得到收率為72%的產(chǎn)物的方法(參照BobeRuediger等，東德專利DD297190);使天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用于L-Trip和2-酮戊二酸，生成口引p呆-3-丙酮酸，用石油醚將該反應(yīng)液抽提后，通過用柱色譜分離，精制并收集。引。朵-3-丙酮酸的方法(參照MarioMatterazzi等，特開昭59-95894號(hào)公報(bào))。這些采用轉(zhuǎn)氨酶的方法收率低、除了L-Trp以外，還必須用2-酮戊二酸等用作氨基受體的酮酸作為原料，而且還生成與吲哚-3-丙酮酸等摩爾的相應(yīng)于氨基受體的氨基酸副產(chǎn)物。此外，為了提高收率，在反應(yīng)系統(tǒng)中投入了相對(duì)于L-Trp為過量的酮酸，所以反應(yīng)后有未反應(yīng)的酮酸存在。基于這些理由，為了從反應(yīng)液中收集目的產(chǎn)物吲咮-3-丙酮酸，必須要進(jìn)行采用離子交換樹脂等的精制步驟，從而使操作變得煩瑣、成本提高。此外，由L-Trp制備口引哚-3-丙酮酸的方法已知有用L-氨基酸氧化酶的方法。但是，利用L-氨基酸氧化酶進(jìn)行色氨酸的氧化反應(yīng)(參照下述反應(yīng)式(13))時(shí)，由于副產(chǎn)物過氧化氫將。引咮-3-丙酮酸分解為吲咮乙酸(參照下述反應(yīng)式(14)),所以提出了在反應(yīng)系統(tǒng)中添加過氧化氫酶將過氧化氫分解(參照下述反應(yīng)式(15))的方案(參照美國(guó)專利5002963號(hào)說明書；四面體快報(bào)，1987年28巻12號(hào)1277-1280頁)。o…(14)2H2。2-^2H20+02.(15)過氧化氫酶也就是說，該方法是使用將蛇毒來源的L-氨基酸氧化酶和牛肝臟來源的過氧化氫酶固定在載體上的固定化酶柱，使含L-Trp的溶液通過柱，進(jìn)行反應(yīng)，生成的。引哚-3-丙酮酸吸附在離子交換柱上，用曱醇洗脫后，干燥、收集。但是，采用本方法，由起始0.5g的L-Trp只能獲得0.2g的吲哚-3-丙酮酸，不僅收率低、僅為40%,而且酶的固定化、離子交換樹脂精制等步驟很煩雜，還需要回收、再利用未反應(yīng)的L-Trp的步驟，所以存在成本高的問題。另一方面，就微生物來源的L-氨基酸氧化酶而言，JohnA.Duerre等將雷氏普羅威登斯菌來源的L-氨基酸氧化酶粗精制后，利用檢測(cè)酶的消耗量的活性測(cè)定法，檢測(cè)L-Trp的氧化活性(參照J(rèn)ournalofBacteriology,1975年，121巻,No.2,656-663)。此外，古山等利用檢測(cè)酶的消耗量的活性測(cè)定法，證實(shí)了假單胞菌屬種P-501來源的L-苯基丙氨酸氧化酶也與LTrp作用(參照野田產(chǎn)研，KiyofumiMaruyama,JournalofBiochemistry,108,327-333,1990)。但是，這些報(bào)告中，都是通過測(cè)定酶反應(yīng)中的L-色氨酸的消耗量、氧的消耗量或過氧化氫的生成量來檢測(cè)氧化酶的活性，而不能直接測(cè)定吲哚-3-丙酮酸的量。這可能是由于通過氨基酸氧化酶反應(yīng)生成的過H20+02氨基酸氧化酶+H,07+NH3(13〉氧化氫將吲哚-3-丙酮酸分解為吲咪-乙酸的原因。另一方面，目前尚未有用微生物菌體或菌體處理物生成吲哚-3-丙酮的例子，因此，色氨酸如何通過微生物進(jìn)行代謝、生成什么樣的分解產(chǎn)物等都是未知的。此外，在生成的吲咮-3-丙酮酸的收集方法方面，上述相關(guān)技術(shù)中，采用轉(zhuǎn)氨酶的方法，以及用蛇毒來源的L-氨基酸氧化酶的方法其反應(yīng)收率低，副產(chǎn)物酮酸和未反應(yīng)的L-色氨酸混在反應(yīng)液中，所以必須通過色譜分離步驟來收集吲哚-3-丙酮酸，因此，存在操作繁鎖、成本高的問題。鑒于上述的狀況，本發(fā)明者為提供低價(jià)、簡(jiǎn)便的吲咮-3-丙酮酸制備方法而進(jìn)行了反復(fù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用具有氨基酸氧化酶和過氧化氬酶活性的微生物作用于色氨酸，即可生成p引哚-3-丙酮酸，并將其收集；并發(fā)現(xiàn)可以優(yōu)選在用惰性氣體對(duì)生成吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)液進(jìn)行置換、或通過調(diào)節(jié)pH—邊抑制目的物分解一邊生成吲哚-3-丙酮酸，并將其收集。本發(fā)明者在反復(fù)研究的過程中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并解決了吲。呆-3-丙酮酸除了由過氧化氫酶將其分解為p引咮乙酸以外，還受到溶液中的氧等的侵襲，生成結(jié)構(gòu)不明的分解物而使含有吲哚-3-丙酮酸的溶液著色的問題。亦即，本發(fā)明中，在對(duì)色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，通過使色氨酸反應(yīng)，得到。引哚-3-丙酮酸，做成反應(yīng)液，對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行脫氣處理、脫氧處理以及調(diào)節(jié)pH值至最高為2中的任何一種處理，收集p引咮-3-丙酮酸。。引哚-3-丙酮酸在溶液的狀態(tài)下進(jìn)行分解和著色，但通過上述的酸添加法，由于在收集生成的p引哚-3-丙酮酸的初期，巧l哚-3-丙酮酸產(chǎn)生結(jié)晶，與其它的精制、處理法相比，具有可抑制分解、著色的優(yōu)點(diǎn)。此外，在酸性條件下，通過直接結(jié)晶除去吲哚-3-丙酮酸的分解物吲哚乙酸也未必容易，如采用上述的惰性氣體置換，則具有抑制副產(chǎn)物p引咮乙酸生成的效果，因此，將上述在酸性條件下結(jié)晶和惰性氣體置換結(jié)合起來，通過收集高純度的。引哚-3-丙酮酸，表明其具有高的效果。另外，作為本發(fā)明的反應(yīng)1另一種方式，其特征是，將具有轉(zhuǎn)化色氨酸為吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培養(yǎng)物作用于色氨酸，生成。引哚-3-丙酮酸，并收集該。引哚-3-丙酮酸。18迄今為止，尚未見有關(guān)使具有轉(zhuǎn)化色氨酸為吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培養(yǎng)物作用于色氨酸，生成口引哚-3-丙酮酸，并收集該巧|咮-3-丙酮酸的報(bào)道。因此，上述的方法提供了新的有用的酶法制備卩引咪-3-丙酮酸的方法。下面，按下述順序?qū)Ρ景l(fā)明的反應(yīng)1的實(shí)施方式加以-說明(A-l)反應(yīng)1中^f吏用的酶(A-2)反應(yīng)1的反應(yīng)條件。(A-l)反應(yīng)1中使用的酶作為反應(yīng)1中使用的酶，只要是具有轉(zhuǎn)化色氨酸為。引哚-3-丙酮酸的活性的酶就可以使用而沒有特別的限定。優(yōu)選具有氨基酸氧化酶和過氧化氫酶活性的酶用作反應(yīng)1中4吏用的酶。反應(yīng)1中，所謂"具有氨基酸氧化酶活性"是催化下述反應(yīng)式(13)所示的反應(yīng)的活性。一般，L-氨基酸氧化酶催化由L-氨基酸生成對(duì)應(yīng)的酮酸，D-氨基酸氧化酶催化由D-氨基酸生成對(duì)應(yīng)的酮酸。亦即，本發(fā)明中，在以L-色氨酸為原料的場(chǎng)合，使用具有L-氨基酸氧化酶活性的微生物，在以D-色氨酸為原料的場(chǎng)合，使用具有D-氨基酸氧化酶活性的微生物。也可以由DL-色氨酸制備。使D-及L-氨基酸氧化酶作用于DL-色氨酸時(shí)，可以定量生成目.的吲咮-3-丙酮酸，此外使用D-或L-氨基酸氧化酶作用于DL-色氨酸則可以50%的收率生成目的。引哚-3-丙酮酸。此外，所謂"過氧化氬酶活性"是催化下述反應(yīng)式(15)所示的反應(yīng)的活性。H2。0,氨基酸氧化酶'OHH202("I3)2H202-*^2H20+02….(15)過氧化氫酶反應(yīng)1中具有氨基酸氧化酶活性的酶可以用以下各種方法的任何一種進(jìn)行選擇檢測(cè)由氨基酸的氧化活性引起的氧消耗量的測(cè)定法(參照例，JoumalofBacteriology121巻，No.2,656-663,1975),定量19測(cè)定通過反應(yīng)生成的過氧化氬的方法(參照例，M.Gabler等，EmzymeandMicrobialTechnology,27,605-611,2000)等各種公知的方法，以及本發(fā)明中后面所述的直接定量測(cè)定由色氨酸生成的吲哚-3-丙酮酸的方法。反應(yīng)1中具有過氧化氫酶活性的酶可以用以下各種乂>知的方法進(jìn)行選擇用在230nm-250nm的p及光度變化來測(cè)定過氧化氬酶反應(yīng)引起的過氧化氫減少的方法、用kMn04對(duì)反應(yīng)液中殘存的過氧化氫進(jìn)行定量的方法、用氣壓計(jì)測(cè)定反應(yīng)中生成的氧的方法等。例如，在M.Gabler等，EmzymeandMicrobialTechnology,27,605-611，2000中所述，通過過氧化氬酶的作用，J吏鄰聯(lián)茴香胺等電子供體氧化，并用光譜法定量測(cè)定殘留的過氧化氫的方法。上述這些方法都可以用來選擇具有過氧化氬酶活性的酶。此外，反應(yīng)1中卩吏用的酶也可以」接照后述的實(shí)施例1所述的方法，通過檢測(cè)其由色氨酸生成W哚-3-丙酮酸的活性進(jìn)行選擇?？僧a(chǎn)生反應(yīng)1中使用的酶的樣i生物可選自例如，無色桿菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬、假單胞菌屬、鏈孢霉屬。優(yōu)選該微生物為具有氨基酸氧化酶和過氧化氬酶活性的微生物，具體優(yōu)選的微生物的例子可舉出無色桿菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬等，其中無色桿菌屬種AJ2425、雷氏普羅威登斯菌IFO13501以及摩氏摩根氏菌IFO3168為優(yōu)選的微生物。另外說明，無色桿菌屬種AJ2425已按下述進(jìn)行保藏。無色桿菌屬種AJ2425株(a)保藏號(hào)FERMBP-8244(2002年11月22日由FERMP-l8786轉(zhuǎn)移至國(guó)際專利生物保藏機(jī)構(gòu)保藏)(b)保藏日2002年3月20日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城縣O<(jT'市東1丁目1番地1中央第6(郵編305-8566))此外，對(duì)于財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)保藏的微生物，可以通過日本大阪市淀川區(qū)十三本町2丁目17-85(郵編532-8686)的財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所出售或購(gòu)買。上述這些微生物也可以是從土壤、植物等自然界新分離的菌抹，或者也可以是通過導(dǎo)入誘變劑處理或重組技術(shù)等人工育種的菌林。對(duì)于產(chǎn)生反應(yīng)1中使用的酶的微生物的培養(yǎng)方法，通?？梢圆捎迷擃I(lǐng)域所用的培養(yǎng)基，即含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類、微量金屬鹽類、維生素等的培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。例如，上述微生物能利用的任何碳源都可以用作碳源，具體可以使用葡萄糖、蔗糖、糊精等糖類；山梨醇、乙醇、甘油等醇類；富馬酸、檸纟象酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸類及其鹽類；石蠟等烴或者它們的混合物。硫酸銨、氯化銨、尿素、酵母提取物、肉提取物、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物等或它們的混合物可以用作氮源。可舉出所含具體的培養(yǎng)基組成如下的培養(yǎng)基等葡萄糖1.0%，硫酸銨0.3%,粉末酵母提取物1,0%，胨1.0%,KH2P040.1%,K2HP040.3%,MgS04.7H200.05%,FeS047H2〇0.001%,MnS〇44H2。0.001%(pH7)。此外，培養(yǎng)基中添加L-氨基酸或D-氨基酸作為酶誘導(dǎo)劑，有時(shí)會(huì)得到高能力的轉(zhuǎn)化色氨酸為吲哚-3-丙酮酸的菌體。還有，為了提高底物進(jìn)入菌體內(nèi)部的滲透性，也可以利用TritonX、Tween等表面活性劑和甲苯、二甲苯等有機(jī)溶劑。對(duì)于培養(yǎng)溫度，通常在所用;[鼓生物的生長(zhǎng)范圍，例如約20-45°C左右，優(yōu)選在約25-37。C左右的溫度范圍下進(jìn)行。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH值為約3-10左右，更優(yōu)選調(diào)節(jié)至約4-8的范圍。通氣條件設(shè)定在適合于所用的微生物生長(zhǎng)的條件，但優(yōu)選好氣條件。培養(yǎng)時(shí)間通常為約12-120小時(shí)，優(yōu)選反應(yīng)約16-96'j、時(shí)。(A-2)反應(yīng)1的反應(yīng)條件反應(yīng)1的特征是，在酶的存在下，由色氨酸生成吲咮-3-丙酮酸，得到反應(yīng)液，對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行脫氣處理、脫氧處理以及調(diào)節(jié)pH值至最高為2中的任何一種處理，收集吲哚-3-丙酮酸。反應(yīng)1中，所謂"在酶的存在下"意味著在能夠?qū)⑸彼徂D(zhuǎn)換為吲哚-3-丙酮酸的狀態(tài)下，該酶存在于反應(yīng)系統(tǒng)中。也就是說，只要能夠?qū)⑸彼徂D(zhuǎn)換為吲哚-3-丙酮酸，該酶可以以任何形式存在于反應(yīng)系統(tǒng)中，例如，可以將單純的酶加入反應(yīng)系統(tǒng)中，也可以將具有該酶活性的微生物(產(chǎn)酶的菌，重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)、該微生物的培養(yǎng)物(液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)等)、培養(yǎng)基(培養(yǎng)物除去菌體后所得的培養(yǎng)基)、該培養(yǎng)物的處理物加入反應(yīng)系統(tǒng)中。使用微生物培養(yǎng)物的場(chǎng)合，可以在培養(yǎng)微生物的同時(shí)，使反應(yīng)1進(jìn)行；也可以用為了獲得酶而預(yù)先培養(yǎng)的培養(yǎng)物進(jìn)行反應(yīng)1。此外，這里所說的"處理"意味著為了取出菌體內(nèi)的酶而進(jìn)4亍的處理，仿j如有用超聲波、玻璃珠、French壓榨機(jī)、冷凍干燥處理，和用溶菌酶、有機(jī)溶劑、表面活性劑等處理。此外，經(jīng)過這些處理的處理物通過常規(guī)方法(液體色語、硫銨分級(jí)等)而制備得到的粗酶部分或精制的酶，只要其具有所要求的能力，也可以使用。在利用上述培養(yǎng)物或其處理物時(shí)，也可以進(jìn)一步將它們包埋在卡拉膠或聚丙烯酰胺內(nèi)，或者在聚醚砜或再生纖維素等的膜上固定化，然后使用。對(duì)于菌體或菌體處理物的使用量，只要在給定的反應(yīng)中，該量能發(fā)揮出達(dá)到目的效果的作用(有效量)即可，該有效量對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)號(hào)人員而言，通過簡(jiǎn)單的預(yù)備試驗(yàn)就可求得，例如，使用洗凈的濕菌體的場(chǎng)合，每100ml反應(yīng)液用1-40g。作為底物的色氨酸，其L-型、D-型、DL-型的任何一種都可以使用，但從容易獲得和價(jià)格方面考慮，采用L-型。色氨酸可在其不抑制目的反應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，一次性、間歇地、或連續(xù)地添加。添加的方法可以是在菌抹培養(yǎng)中直接添加；也可以在培養(yǎng)后將菌體分離，然后與該分離所得的菌體或其處理物'混合使用。添加時(shí)，底物以水溶液或漿狀的形式添加，但為了增加其溶解度，及促進(jìn)其分散，也可以和不影響反應(yīng)的有機(jī)溶劑或表面活性劑混合在一起添加。pH范圍優(yōu)選在pH3-10左右，更優(yōu)選在pH5-9左右；溫度范圍優(yōu)選為10-60。C左右，更優(yōu)選為20-4(TC左右；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0.5-120小時(shí)左右，更優(yōu)選為0.5-24小時(shí)左右。底物的濃度無特別限制，優(yōu)選采用約0.1%-10%左右的濃度。另外，培養(yǎng)液或反應(yīng)液中的殘存色氨酸、生成的。引咮-3-丙酮酸、或副產(chǎn)物吲哚乙酸的定量可以用眾所周知的高效液相色譜方法快速、方便地進(jìn)行測(cè)定。對(duì)積累了由此所得的吲哚-3-丙酮酸的培養(yǎng)液(反應(yīng)液)，通過進(jìn)行脫氣處理或脫氧處理，可以抑制吲哚-3-丙酮酸的分解。脫氣處理和脫氧處理的方法可舉出用惰性氣體，例如氮和氬等，置換該反應(yīng)液中含有的氣體(全部或部分)。這里所說的"脫氣處理"意。未著用惰性氣體對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行置換或者通過使用吸氣器或真空泵等^f吏反應(yīng)液處于減壓條件下等的操作，除去反應(yīng)液中存在的氧、過氧化氬等與吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)的成分，或降低其濃度的操作。此外，所謂的"脫氧處理"是除去反應(yīng)液中溶解的氧，或使其濃度降低的操作。除去溶液中的氧的方法具體的例子有用惰性氣體除去氧的方法，和在〗容液中添加脫氧劑的方法。通過用惰性氣體對(duì)該反應(yīng)液進(jìn)行置換，除去反應(yīng)液中殘存的氧，使反應(yīng)停止的同時(shí)，還能夠防止生成的吲哚-3-丙酮酸和殘存色氨酸的分解。這里所說的"惰性氣體"是指不與吲哚-3-丙酮酸直接或間接地反應(yīng)，并能減少與吲哚-3-丙酮酸或色氨酸反應(yīng)的氧或微量殘存的過氧化氫等成分的氣體。本發(fā)明中能使用的惰性氣體舉例來說有氮、氬、氦等。惰性氣體的置換可以在反應(yīng)結(jié)束后立刻進(jìn)行，用洗凈的菌體進(jìn)行反應(yīng)的場(chǎng)合，也可以在菌體分離后進(jìn)行。輸入惰性氣體的方法有用情性氣體置換氣相部分，降低氣相部分中氧濃度的方法、將惰性氣體導(dǎo)入溶液中，除去溶解的氧的方法等，對(duì)該輸入方法沒有特別的限定。氣相部分的氧濃度釆用5%或以下，優(yōu)選在3%或以下，更優(yōu)選1%或以下。溶液中的氧濃度要求在1ppm或以下，優(yōu)選在0.1ppm或以下，更優(yōu)選在0.01ppm或以下。此外，在反應(yīng)液中適當(dāng)添加已知有降低溶解氧濃度效果的亞硫酸鈉等已知物質(zhì)，也有可能停止反應(yīng)和抑制吲哚-3-丙酮酸的分解。亞石危酸離子可以用作本發(fā)明中的脫氧劑。作為亞石克酸離子的來源，可以采用亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸銨等鹽或亞硫酸、或者連二亞硫酸鹽。優(yōu)選亞硫酸離子或連二亞硫酸鹽的使用濃度在20ppm~1%,更優(yōu)選在100ppm~0.5%。上述的惰性氣體置換處理和;容液中添加脫氧劑的方法可以組合起來實(shí)施，也可以只實(shí)施其中的^f壬一種。通過反應(yīng)生成的吲p呆-3-丙酮S交可以用常^見方法從培養(yǎng)液或反應(yīng)液中收集使用。從培養(yǎng)液或反應(yīng)液中的收集是將該場(chǎng)合下該領(lǐng)域通常使用的公知技術(shù)，例如過濾、離心分離、真空濃縮、離子交換或吸附色譜、結(jié)晶等操作，根據(jù)需要適當(dāng)?shù)亟M合使用。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案是通過將該反應(yīng)液調(diào)節(jié)至酸性條件，使吲哚-3-丙酮酸結(jié)晶或沉淀，也可以從反應(yīng)終了的混合物中直接分離、收集吲哚-3-丙酮酸。對(duì)反應(yīng)液pH的調(diào)節(jié)，優(yōu)選將其pH值調(diào)至2或以下，更優(yōu)選調(diào)至l或以下為好。由于本發(fā)明能夠制備口引咮-3-丙酮酸的生成率高，而溶液中副產(chǎn)物酮酸和未反應(yīng)的L-色氨酸濃度低的反應(yīng)產(chǎn)物，因此，可以在酸性條件下，使。引哚-3-丙酮酸直接結(jié)晶析出，從而簡(jiǎn)化精制的步驟。本發(fā)明一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案是在反應(yīng)液中適當(dāng)添加硫酸、鹽酸等酸，使吲哚-3-丙酮酸可以直接結(jié)晶析出。由于該方法能夠制備W哚-3-丙酮酸的生成率高，而溶液中副產(chǎn)物酮酸和未反應(yīng)的L-色氨酸濃度低的反應(yīng)產(chǎn)物，因此，利用在酸性條件下，使。引哚-3-丙酮酸直接結(jié)晶析出，也可以簡(jiǎn)化精制步驟。在調(diào)節(jié)至酸性條件時(shí)，對(duì)使用的酸的種類沒有特別的限別，只要該方法具有使該反應(yīng)液變成酸性的效果即可。所使用的酸的例子有鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不妨礙本發(fā)明的實(shí)施的范圍內(nèi)，選擇適當(dāng)?shù)慕Y(jié)晶溫度、酸的用量、結(jié)晶時(shí)間、酸的添力口方法等。結(jié)晶溫度可優(yōu)選為約-20。C-10(rC,更優(yōu)選為約0。C-6(TC。酸的用量可以選擇為能將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至優(yōu)選為2或以下，更優(yōu)選為l或以下的量?？商砑?、使用的酸是，在添加該酸后，能使其溶液中的氫離子濃度達(dá)到約0.01-10mol/L，更優(yōu)選達(dá)到約0.1-1mol/L的酸。結(jié)晶時(shí)間可選擇為優(yōu)選約1-100小時(shí)，更優(yōu)選約l-24小時(shí)。[B]反應(yīng)2本發(fā)明的反應(yīng)2是由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成莫納汀的前體酮酸(IHOG)的反應(yīng)。但是，反應(yīng)2不僅可用于合成IHOG,還可以用于合成后述的反應(yīng)3中用作底物的取代a-酮酸。即，反應(yīng)2可以廣泛用于由下述通式(3)所示的取代a-酮酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>和草酰乙酸或丙酮酸，生成下述通式(4)所示的:f又代a-酮酸的反應(yīng)中。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>由反應(yīng)2得到的通式(.4)的耳又代a-酮酸可以用作后述反應(yīng)3中的底物。通式(3)、(4)中，R表示選自碳原子數(shù)為2-8的烷基、碳原子數(shù)為1-8的烷氧基、碳原子數(shù)為2-9的羧烷基、碳原子數(shù)可至20的芳基、碳原子數(shù)可至20的芳烷基、含有雜環(huán)的烴基、羥基中的取代基。R為含有芳香環(huán)或雜環(huán)的場(chǎng)合，該芳香環(huán)或雜環(huán)還可以進(jìn)一步被卣原子(碘原子，溴原子，氯原子，氟原子等)、羥基、碳原子數(shù)可至3的烷基、碳原子數(shù)可至3的烷氧基和氨基所取代。優(yōu)選R為苯基曱基或3-吲哚基曱基，特別優(yōu)選3-口引哚基甲基。也就是說，優(yōu)選通式(3)的耳又代a-酮酸為苯丙酮酸或e引咮-3-丙酮酸，特別優(yōu)選吲哚-3-丙酮酸。作為P引咮-3-丙酮酸，優(yōu)選用[A]反應(yīng)①項(xiàng)所述的方法制備的吲哚-3-丙酮酸，當(dāng)然，p引哚-3-丙酮酸的制備方法不限于這種方法。用吲咮-3-丙酮酸作為通式(3)的取代a-酮酸時(shí)，可以制備莫納汀制備的重要中間體IHOG(反應(yīng)式(16))。此外，用苯丙酮酸作為通式(3)的取代a-酮酸時(shí)，可以制備莫納汀的類似物4-苯甲基-4-羥基-谷氨酸(PHG)的中間體酮酸PHOG(4-苯曱基-4-羥基2-氧代戊二酸)(反應(yīng)式(17))。25對(duì)反應(yīng)2的實(shí)施方式無特別限定，化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)和酶反應(yīng)系統(tǒng)的任何一種都可使用。以下，對(duì)反應(yīng)2的實(shí)施方式分成化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)和酶系統(tǒng)，按下述順序加以說明。(B-l)化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)(B-2)酶系統(tǒng)(I)反應(yīng)2中使用的酶(1)編碼醛縮酶的DNA(2)醛縮酶的性質(zhì)(3)醛縮酶的制備方法(II)反應(yīng)2的反應(yīng)條件。(B-1)化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)利用以下所示的方法，或后逸的實(shí)施例2，很容易實(shí)施采用化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)2，當(dāng)然，不限定于這種方法。例如，使上述通式(3)所示的取代a-酮酸與草酰乙酸進(jìn)行交叉醛醇縮合反應(yīng)以及脫羧反應(yīng)，可以制備上述通式(4)所示的取代a-酮酸。上述醛醇縮合反應(yīng)所得的化合物成為在反應(yīng)系統(tǒng)中形成的重要中間體，但不必將該化合物分離即可進(jìn)入下一步的脫羧反應(yīng)。該搭醇縮合反應(yīng)的條件無特別困難，只需在無機(jī)堿或有機(jī)堿存在下，在適當(dāng)?shù)娜軇┲惺谷〈谋岷筒蒗Ｒ宜嵯嗷プ饔眉春苋菀走M(jìn)行。所用的溶劑無特別的限制，只要是對(duì)該反應(yīng)無活性的溶劑即可。對(duì)于反應(yīng)溫度、堿的用量、反應(yīng)時(shí)間、出發(fā)物質(zhì)的添加方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不妨礙本發(fā)明的實(shí)施的范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)剡x擇。優(yōu)選的溶劑包括水、曱醇、乙腈和二曱基曱酰胺等極性溶劑等。使用堿的場(chǎng)合，優(yōu)選的堿有無機(jī)堿，如氬氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鉤等堿金屬或堿土金屬的氫氧化物或碳酸化物；有機(jī)堿，如三乙胺等。反應(yīng)溫度可優(yōu)選采用約-20-10CrC，更優(yōu)選采用約0-60°C。醛醇縮合反應(yīng)縮合物的脫羧反應(yīng)可以通過自發(fā)的脫羧反應(yīng)而完成，但在反應(yīng)液中添加酸或金屬離子或兩者均添加，可以更有效地進(jìn)行脫羧反應(yīng)。在這種情況下使用的酸有鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、對(duì)甲笨磺酸、離子交換樹脂等固體酸；使用的金屬離子有鎳離子、銅離子和鐵離子等過渡金屬離子等。反應(yīng)溫度優(yōu)選為約-10-10(TC，更優(yōu)選為約0-60°C。(B-2)酶系統(tǒng)(1)反應(yīng)2中使用的酶反應(yīng)2中使用的酶只要能催化下述的反應(yīng)就可以使用而無特別的限定即，通式(3)所示的取代a-酮酸和草酰乙酸或丙酮酸通過醛醇縮合，合成上述通式(4)所示的取代cx-酮酸的反應(yīng)。也就是說，只要是催化該反應(yīng)的酶即可，微生物來源的酶、通過基因重組獲得的酶都可以使用。根據(jù)本發(fā)明者的研究，證實(shí)了假單胞菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、黃單胞菌屬中，有產(chǎn)生具有分解4-苯甲基-4-羥基-2-氧代戊二酸(PHOG)活性的酶的菌林。這些微生物產(chǎn)生的醛縮酶對(duì)分解1分子的PHOG，生成1分子的苯基丙酮酸和1分子的丙酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化，因此，本發(fā)明者們認(rèn)為，該醛縮酶能催化由p引哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反應(yīng)?；诖丝紤]，本發(fā)明者們?yōu)榱瞬榍逍碌娜┛s酶的存在，由該菌抹的培養(yǎng)菌體分離精制了醛縮酶，與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了該酶通過吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)的醛縮合，合成了IHOG。以前，曾報(bào)導(dǎo)過2例用作催4匕以2分子的a-酮酸(或取代oc-酮酸)為底物的醛醇縮合的微生物酶，即來源于假單胞菌屬細(xì)菌的4-羥基_4_曱基_2-氧代戊二酸醛縮酶，和存在于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等的4-羥基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛縮酶。前者的4-羥基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛縮酶催化由2分子丙酮酸生成4-羥基-4-曱基-2-氧代戊二酸(4-HMG)的反應(yīng)，以及催化由4-草酰檸蘋酸生成1分子草酰乙酸和1分子丙酮酸的反應(yīng)已有報(bào)導(dǎo)(參照KiyofumiMaruyama，JournalofBiochemistry,108,327-333,1990)。此外，已知后者的4-羥基-2-氧代戊二酸醛縮酶催化由1分子乙醛酸和1分子丙酮酸生成4-羥基-4-曱基-2-氧代戊二酸(4-HMG)的反應(yīng)。但是，尚未見有關(guān)任何這些菌^f朱的4-苯甲基-4-羥基-2-氧代戊二酸(PHOG)的分解活性、由。引哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成莫納汀的前體酮酸(IHOG)的活性的報(bào)告和見識(shí)，這些菌抹產(chǎn)生的醛縮酶是否能用于上述的莫納汀的合成路線中尚不清楚。亦即，在本發(fā)明者的發(fā)現(xiàn)之前，至今尚未見用微生物酶由p引咮-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前體酮酸(IHOG)的例子。此外，本發(fā)明者精制了腐臭假單胞菌ATCC4683來源的醛縮酶，確定了醛縮酶的氨基酸序列。進(jìn)一步合成了由醛縮酶的氨基酸序列推導(dǎo)的約30個(gè)堿基對(duì)的DNA分子，用此DNA分子通過PCR法，分離、獲得編碼該醛縮酶的DNA中的一部分。進(jìn)一步利用該DNA片段作為探針，從腐臭假單胞菌的染色體基因文庫成功地分離得到編碼腐臭假單胞菌來源的醛縮酶的全長(zhǎng)DNA。按上述方法特定的編碼醛縮酶的DNA如序列表的序列號(hào)1所示。此外，由序列表的序列號(hào)1的堿基序列編碼的醛縮酶氨基酸序列如序列表的序列號(hào)2和序列號(hào)3所示。序列表中的序列號(hào)2，是由序列表的序列號(hào)1所述的堿基序列中456-1118位堿基序列編碼的醛縮酶的氨基酸序列。此外，序列表的序列號(hào)3,是由序列表的序列號(hào)1所述的堿基序列中444-1118位堿基序列編碼的醛縮酶氨基酸序列。序列表的序列號(hào)2和3所述的任一種醛縮酶都有醛縮酶活性，催化由1分子p引哚-3-丙酮酸和1分子丙酮酸(或草酰乙酸)合成4-(p引哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反應(yīng)。()編碼醛縮酶的DNA具有序列表的序列號(hào)1的堿基序列的醛縮酶基因是由以上所述的腐臭假單胞菌ATCC4683株的染色體DNA分離的基因。序列表的序列號(hào)1的堿基序列，與已知的赭色假單胞菌細(xì)菌來源的4-羥基-4-曱基-2-氧代戊二酸醛縮酶(基因名proA)(參照MamyamaK.,等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(12),2701-2709,2001)在氛基酉i序歹'〗上，表現(xiàn)出有29%的同源性。另外說明，這里的同源性是用基因分析軟件"genetyxver.6"(GENETYX/A司)，按照初始設(shè)定的各種參數(shù)算出的值。以下說明由醛縮酶的產(chǎn)生菌獲得編碼醛縮酶的DNA的方法。首先，測(cè)定精制的醛縮酶的氨基酸序列。在這種情況下，可以用Edman法(Edman，P.，ActaChem.Scand.,4,227頁，1950年)測(cè)定氨基酸序列?；蛘呖梢杂肁ppliedBiosystems公司制備的測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列。本發(fā)明腐臭假單胞菌ATCC4683來源的醛縮酶用蛋白酶進(jìn)行限制性分解后，通過反相HPLC分離回收肽片段，確定其中的2個(gè)片段的內(nèi)部氨基酸序列，鑒定為序列表的序列號(hào)4和5所示的序列。才艮據(jù)已確定的氨基酸序列，可以推測(cè)出編碼該氨基酸序列的DNA堿基序列。推測(cè)DNA的堿基序列時(shí)，采用通用的密碼子。根據(jù)推測(cè)的堿基序列，合成約30個(gè)堿基對(duì)的DNA分子。該合成DNA分子的方法已在四面體快報(bào)，1981年，22,1859頁公開。或者，可以用AppliedBiosystems公司制備的合成儀合成該DNA分子。該DNA分子可以用作探針，從醛縮酶產(chǎn)生菌的染色體基因文庫中分離出編碼醛縮酶的全長(zhǎng)DNA。或者，可以用作引物，通過PCR法擴(kuò)增本發(fā)明的編碼醛縮酶的DNA。但是，因?yàn)橛肞CR法擴(kuò)增的DNA不包含編碼醛縮酶的全長(zhǎng)DNA，所以用PCR法擴(kuò)增的DNA作為纟笨針，從醛縮酶產(chǎn)生菌的染色體基因文庫中分離出編碼醛縮酶的全長(zhǎng)DNA。在White,T丄等，TrendsGenet.5,1989年，185頁中，描述了PCR法的操作。染色體DNA的制備方法、以及用DNA分子作為探針，從基因文庫中分離目的DNA分予的方法在MolecularCloning,2nddition，ColdSpringHarbor出版，1989年等中有描述。分離的編碼醛縮酶的DNA石威基序列的測(cè)定方法在APracticalguidetoMolecularCloning,JohnWiley&Sons,Inc.，1985年中描述。此外，也可以用Biosystem公司制備的DNA測(cè)序儀測(cè)定堿基序列。編碼腐臭假單胞菌ATCC4683來源的醛縮酶的DNA如序列表的序列號(hào)1所示。另外說明，編碼對(duì)由。引哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反應(yīng)進(jìn)行催化的醛縮酶的DNA不僅只是序列表的序列號(hào)1所示的DNA。也就是說，因?yàn)楫a(chǎn)生對(duì)由吲咮-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反應(yīng)進(jìn)行催化的醛縮酶的假單胞菌屬中，每個(gè)種和林的堿基序列都應(yīng)該存在差異。當(dāng)然，即使是由醛縮酶產(chǎn)生菌的染色體DNA分離的編碼醛縮酶的DNA加以人工變異后的DNA，在其編碼醛縮酶的情況下，也可以用于反應(yīng)2。人工變異常用的方法有Method.InEnzymol.，1987年，154頁所述的位點(diǎn)特異性誘變法。此外，在嚴(yán)格的條件下，與具有與序列表的序列號(hào)1所述堿基序列的互補(bǔ)序列的DNA雜交，并編碼具有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)的DNA也可以用于反應(yīng)2中。這里所說的"嚴(yán)格的條件"是指形成所謂特異的雜交，而不形成非特異雜交的條件。該條件很難明確地?cái)?shù)值化，但可舉例說明同源性高的DNA之間，例如具有50%或以上，較優(yōu)選80%或以上，更優(yōu)選卯％或以上，特別優(yōu)選95%或以上同源性的DNA之間，發(fā)生雜交，而比該同源性低的DNA之間不發(fā)生雜交的條件(這里所說的同源性，希望是比較序列之間排列成使其一致的堿基數(shù)為最大時(shí)進(jìn)行比較的計(jì)算值)；或相當(dāng)于在37。C、O.lxSSC、0.1。/。SDS的通常Southern雜交的洗滌條件下，優(yōu)選在6CTC、0.1xSSC、0.1%SDS下，更優(yōu)選在65。C、O.lxSSC、0.1%SDS的鹽濃度下雜交的條件。另外，所說的"醛縮酶活性"是指由。引咮-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的活性。但是，對(duì)于與序列表的序列號(hào)1所述pH9^條件下，保持具有序歹:表的序列號(hào)2或;所述的氨i酸序列的蛋白質(zhì)的10%或以上，優(yōu)選30%或以上，較優(yōu)選50%或以上，更優(yōu)選70%或以上的醛縮酶活性。還有，DNA所編碼的蛋白質(zhì)與序列表的序列號(hào)1所述的DNA編碼的醛縮酶實(shí)質(zhì)上相同時(shí)，該DNA也可以用于反應(yīng)2中。亦即，下述DNA都屬于本發(fā)明的DNA:(a)編碼由序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA(b)編碼具有在序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(c)編碼由序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA(d)編碼具有在序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。這里所述的"1個(gè)或數(shù)個(gè)"是指對(duì)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)、醛縮酶的活性無嚴(yán)重?fù)p壞的氨基酸殘基數(shù)的范圍，具體是l-50個(gè)，優(yōu)選l-30個(gè)，更優(yōu)選1-10個(gè)。此外，所述的"醛縮酶活性"的含意是，如以上所述，對(duì)由口引哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG進(jìn)行催化的活性。但是在序列表的200910163551.9序列號(hào)2所述的氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基l交序列的場(chǎng)合，希望在33°C、pH9的條件下，保持具有序列表的序列號(hào)2或3所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的10%或以上，優(yōu)選30%或以上，較優(yōu)選50%或以上，更優(yōu)選70%或以上的醛縮酶活性。(2)醛縮酶的性質(zhì)下面，對(duì)精制的腐臭假單胞菌ATCC4683菌抹來源的醛縮酶的性質(zhì)進(jìn)行說明。由上述的基因分離和分析清楚地表明，腐臭假單胞菌ATCC4683菌抹來源的醛縮酶具有序列表的序列號(hào)2或3所述的氨基酸序列。但是，具有在序列表的序列號(hào)2或3所述的氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)當(dāng)然也可以用于反應(yīng)2中。亦即，下述(a)-(d)的蛋白質(zhì)可以用作催化反應(yīng)2的酶。(a)由序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(b)具有在序列表的序列號(hào)2所述的氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)(c)由序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(d)具有在序列表的序列號(hào)3所述的氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛縮酶活性的蛋白質(zhì)。這里的"數(shù)個(gè)"和"醛縮酶活性"的定義與(1)編碼醛縮酶的DNA的一項(xiàng)中說明的定義相同。這些醛縮酶對(duì)由p引p呆-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)通過醛醇縮合，合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反應(yīng)進(jìn)行催化。通過高效液相色^普(HPLC),測(cè)定由。引p朱-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成的IHOG量，可以對(duì)上述醛縮酶的醛縮酶活性進(jìn)行測(cè)定。具體的方法是在含有100mM緩沖液，50mM卩引哚-3-丙酮酸，250mM丙酮酸，1mMMgCl2，l%(v/v)甲苯的反應(yīng)液中，添加搭縮酶，33。C下振蕩反應(yīng)4小時(shí)，用HPLC通過定量測(cè)定生成的IHOG，可以估計(jì)醛縮酶的活性。IHOG的定量，例如，可以通過利用GLSciences制備的"InertsilODS-2"(5jam,4.6x250mm)的HPLC分析定量。分析條件的例子如以下所示。移動(dòng)相40%(v/v)乙腈/5mM磷酸二氳四丁銨溶液流速1ml/min柱溫度40°C才會(huì)測(cè)UV210nm下面，對(duì)用上述方法測(cè)定的腐臭4i單胞菌來源的醛縮酶的酶化學(xué)性質(zhì)描述如下。腐臭假單胞菌來源的醛縮酶能催化由巧l咮-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反應(yīng)。至目前為止，已報(bào)道了兩例對(duì)以2分子的酮酸(或草酰乙酸)為底物的醛醇縮合進(jìn)行催化的微生物酶，即假單胞菌屬細(xì)菌來源的4-羥基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛縮酶，和大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等中存在的4-羥基-2-氧代戊二酸醛縮酶，就前者而言，完全未見關(guān)于其作用于PHOG或IHOG的報(bào)道，因此，沖艮本不清楚用此酶是否能合成PHOG(和IHOG)。另外，對(duì)后者來說，未見其有PHOG分解活性，因此，不可能用此酶合成PHOG(和IHOG)。也就是說，腐臭假單胞菌來源的醛縮酶與迄今為止所報(bào)道的醛縮酶不同，該醛縮酶的特征是能夠?qū)胚?3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)的醛醇縮合而合成IHOG的反應(yīng)進(jìn)行催化。腐臭假單胞菌來源的醛縮酶的最適pH在33'C下為約9左右。腐臭假單胞菌來源的醛縮酶的分子量用凝膠過濾法測(cè)定時(shí)約為146kDa,用SDS-PAGE法測(cè)定時(shí)約為25kDa，因此，推測(cè)本發(fā)明的醛縮酶是分子量約為25kDa的亞基的六聚體結(jié)構(gòu)。(3)醛縮酶的制備方法.以下對(duì)醛縮酶的制備方法進(jìn)卩亍說明。本發(fā)明的反應(yīng)2中所用的醛縮酶的制備方法有下述2種(i)將醛縮酶產(chǎn)生菌通過微生物培養(yǎng)，產(chǎn)生并積累醛縮酶的方法；(ii)利用重組DNA技術(shù)制備產(chǎn)生醛縮酶的轉(zhuǎn)化體，通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，產(chǎn)生并積累醛縮酶的方法。(i)通過微生物培養(yǎng)，產(chǎn)生并積累的方法將醛縮酶產(chǎn)生菌通過微生物^備養(yǎng)，產(chǎn)生并積累醛縮酶的方法中，作為醛縮酶來源的微生物有假單胞菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、黃單胞菌屬。假單胞菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、黃單胞菌屬中，只要該微生物能產(chǎn)生對(duì)由W哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前體酮酸(IHOG)的反應(yīng)進(jìn)行催化的醛縮酶，任何一種微生物都可用于本發(fā)明中，但優(yōu)選腐臭假單胞菌ATCC4683、暈斑假單胞菌AJ2791、解韌帶假單胞菌AJ1582、歐文氏菌屬種AJ2917、柑橘黃單胞菌AJ2797、萊茵黃桿菌AJ2468。其中特別優(yōu)選腐臭假單胞菌ATCC4683、暈斑假單胞菌AJ2791。這些微生物的保藏地點(diǎn)如以下所示。(1)暈斑假單胞菌AJ2791抹(a)受理號(hào)FERMBP-8246(2002年11月22日由FERMP-18881轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位)(b)受理日2002年6月10日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城縣O〈(f市東1丁目1番地1中央第6)(2)解韌帶假單胞菌AJ1582林(a)受理號(hào)FERMBP-8247(2002年11月22日由FERMP-18882轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位)(b)受理日2002年6月10日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(曰本茨城縣，〈yf市東i丁目i番地i中央第6)(3)歐文氏菌屬的種AJ2917斗朱(a)受理號(hào)FERMBP-8245(2002年11月22日由FERMP-18880轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位)(b)受理日2002年6月10日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)4支術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城縣，〈yr市東i丁目i番地i中央第6)(4)萊茵黃斥干菌AJ2468才朱(a)受理號(hào)FERMBP-1862(b)受理日1985年9月30日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏33中心(日本茨城縣，〈W市東1丁目1番地1中央第6)(5)柑橘黃單胞菌AJ2797材、(a)受理號(hào)FERMBP-8250(2002年11月27日由FERMP-4347轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位)(b)受理日1985年9月30日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城縣O〈〖f市東1丁目1番地1中央第6)醛縮酶的來源微生物的培養(yǎng)方式可以是液體培養(yǎng)，也可以是固體培養(yǎng)，有利于工業(yè)上使用的方式是深部通氣攪拌培養(yǎng)法。微生物培養(yǎng)中通常使用的碳源、氮源、無機(jī)鹽及其他微量營(yíng)養(yǎng)源可以用作培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)源。只要是所使用的菌林能利用的營(yíng)養(yǎng)源全都可以使用。通氣條件采用好氣條件。培養(yǎng)溫度可選擇在可使菌生長(zhǎng)并產(chǎn)生醛縮酶的范圍。因此，沒有嚴(yán)格的條件，通常為10-50。C,優(yōu)選30-40。C。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)其他培養(yǎng)條件而變化。例如，可以培養(yǎng)至醛縮酶產(chǎn)量為最高的時(shí)間，通常為5小時(shí)-7天，優(yōu)選約10小時(shí)-3天。培養(yǎng)后，將菌體離心分離(例如，10,000xg,IO分鐘)，收集菌。因?yàn)槿┛s酶的大部分存在于菌體中，所以通過將菌體破碎或溶菌，使醛縮酶可溶化。菌體的破碎可采用超聲波破碎、French壓機(jī)破碎、玻璃珠破碎等方法，另外，在溶菌的場(chǎng)合，采用卯白溶菌酶、肽酶處理，或?qū)⑦@些處理適當(dāng)組合的方法。精制醛縮酶產(chǎn)生菌來源的醛縮酶時(shí)，采用酶可溶液作為出發(fā)材料進(jìn)行精制，如果存在未石皮石f或未;容菌的殘?jiān)鼤r(shí)，將可溶液再次離心分離，除去沉淀的殘?jiān)?，有利于精制。醛縮酶的精制時(shí)，可以采用通常進(jìn)行酶的精制所用的所有常規(guī)方法，例如硫銨鹽析法、凝膠過濾色鐠法、離子交換色謙法、疏水性色譜法、羥基磷灰石色譜法等。結(jié)果，可以得到含比活性更高的醛縮酶的級(jí)分。(ii)用重組DNA技術(shù)的制備方法以下，對(duì)通過重組DNA一支術(shù)制備醛縮酶的方法進(jìn)^亍說明。已知，利用重組DNA技術(shù)制備酶、生理活性物質(zhì)等有用蛋白質(zhì)的例子有很多，通過利用重組DNA技術(shù)，可以大量制備天然微量存在的有用蛋質(zhì)。與載體連接的DNA只要可能表達(dá)醛縮酶，都可以使用。作為與載體DNA連接的醛縮酶基因的例子，可以使用(l)編碼醛縮酶的DNA—項(xiàng)中所說明的DNA等。用重組DNA技術(shù)大量制備蛋白質(zhì)的場(chǎng)合，優(yōu)選該蛋白質(zhì)聚集在產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體內(nèi)，形成蛋白質(zhì)的包函體(inclusionbody)。這種表達(dá)制備方法的優(yōu)點(diǎn)是保護(hù)目的蛋白不被菌體內(nèi)存在的蛋白酶消化，以及通過菌體破碎后進(jìn)行離心分離的操作，可以簡(jiǎn)單地精制目的蛋白。用蛋白質(zhì)變性劑使這樣所得的蛋白質(zhì)包函體可溶化，經(jīng)過以除去變性劑為主的活性再生操作后，轉(zhuǎn)換為正確折疊的生理活性蛋白質(zhì)。例如人白細(xì)胞介素-2的活性再生(特開昭61-257931)等很多例子。為了從蛋白質(zhì)包函體得到活性型的蛋白質(zhì)，必須要進(jìn)行可溶化、活性再生等一系列操作，與直接制備活性型蛋白質(zhì)相比，其操作變得更為復(fù)雜。但是，在菌體內(nèi)大量產(chǎn)生影響菌體生長(zhǎng)的蛋白時(shí)，通過在菌體內(nèi)積累無活性的蛋白質(zhì)包函體，可以抑制這種影響。大量制備包函體目的蛋白的方法，除了在強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下，使目的蛋白單獨(dú)表達(dá)的方法之外，還有作為與己知高表達(dá)蛋白的融合蛋白而表達(dá)的方法。使融合蛋白表達(dá)后，為了切出目的蛋白，也可以將限制性蛋白酶的識(shí)別序列安排在適當(dāng)?shù)奈恢?。用重組DNA技術(shù)大量制備蛋白質(zhì)的場(chǎng)合，細(xì)菌細(xì)胞、放線菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞>霉菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等可以用作轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。用作開發(fā)宿主-載體系統(tǒng)的細(xì)菌細(xì)胞有埃希氏菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌、棒桿菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌等，優(yōu)選使用大腸桿菌，因?yàn)楝F(xiàn)已掌握了很多有關(guān)用大腸桿菌大量制備蛋白質(zhì)的知識(shí)。以下，說明用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌制備醛縮酶的方法。通常在大腸桿菌中制備外源蛋白所用的啟動(dòng)子可以用作使編碼醛縮酶的DNA表達(dá)的啟動(dòng)子，例3口T7啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子等強(qiáng)啟動(dòng)子。為了將醛縮酶以融合蛋白包函體的形式制備，在醛縮酶基因的上游或下游，連接編碼其他蛋白的基因，優(yōu)選連接編碼親水性肽的基因，形成融合蛋白基因，這樣的編碼其他蛋白的基因只要是能增加融合蛋白的積累量、經(jīng)變性再生步驟后能提高融合蛋白的溶解性的基因都可以使用。例如T7基因10、P-半乳糖苷酶基因、脫氫葉酸還原酶基因、干擾素Y基因、白細(xì)胞介素-2基因、凝乳酶原基因等可作為侯選基因。這些基因和編碼醛縮酶的基因連結(jié)時(shí)，要使其密碼子讀碼框一致?？梢栽谶m當(dāng)?shù)南拗菩悦肝稽c(diǎn)連接，或利用適當(dāng)序列的合成DNA連接。此外，為了擴(kuò)大制備量，優(yōu)選在融合蛋白基因的下游連接作為終止子的轉(zhuǎn)錄終止序列。該終止子有T7終止子、fd噬菌體終止子、T4終止子、四環(huán)素抗性基因的終止子、大腸桿菌trpA基因的終止子等。優(yōu)選所謂多拷貝型的載體用作將編碼醛縮酶、或醛縮酶和其他蛋白質(zhì)的融合蛋白的基因?qū)氪竽c桿菌的載體，例如含有ColEl來源的復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒，如pUC系列的質(zhì)粒、pBR322系列的質(zhì)粒、或其衍生物。這里所說的"衍生物"是指通過堿基的置換、缺失、插入、添加或倒位等對(duì)質(zhì)粒加以改變后所得的物質(zhì)。另外，這里所說的改變是指用誘變劑、UV照射等的誘變處理，或也包括通過自然變異的改變。此外，為了篩選轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選該載體含有氨千青霉素抗性基因等標(biāo)記。這樣的質(zhì)粒有市售的具有強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體(pUC系列(寶酒造公司制備)、pPROK系歹(J(ClontechLaboratoriesInc.制備)、pKK233-2(ClontechLaboratoriesInc.制備)等)。將啟動(dòng)子、編碼醛縮酶或醛縮酶和其他蛋白的融合蛋白的基因、終止子依次連接的DNA片段與載體DNA連接，即得到重組DNA。用該重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌、培養(yǎng)該大腸桿菌，即可表達(dá)制備醛縮酶或醛縮酶和其他蛋白質(zhì)的融合蛋白。轉(zhuǎn)化的宿主可以采用外源基因的表達(dá)中常用的菌抹，特別優(yōu)選大腸桿菌JM109(DE3)抹、JM109抹。轉(zhuǎn)化的方法，以及轉(zhuǎn)化體的篩選方法在1989年MolecularCloning,2ndeditionColdSpringHarborpress中有描述。以融合蛋白的形式表達(dá)的場(chǎng)合，可以采用以血液凝固因子Xa、激肽釋放酶等醛縮酶內(nèi)不存在的序列為識(shí)別序列的限制性蛋白酶將醛縮酶切出。制備培養(yǎng)基可以采用M9-水解酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基說明書第34/76頁等培養(yǎng)大腸桿菌通常使用的培養(yǎng)基。此外，培養(yǎng)條件、制備誘導(dǎo)條件，根據(jù)所用的載體的標(biāo)記、啟動(dòng)子、宿主菌等的種類適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。醛縮酶或醛縮酶和其他蛋白的融合蛋白的回收有以下等方法。如果醛縮酶或其融合蛋白在菌體內(nèi)是可溶化的，菌體回收后，可將菌破碎或溶菌，然后用作粗酶液。根據(jù)需要，也可以進(jìn)一步通過常規(guī)的沉淀、過濾、柱色譜等技術(shù)精制醛縮酶或其融合蛋白。在這種場(chǎng)合下，也可以采用利用醛縮酶或其融合蛋白的抗體的精制方法。在形成蛋白質(zhì)包函體的場(chǎng)合，用變性劑可將其溶化。雖然可以與菌體蛋白質(zhì)一起溶化，但從后面的精制操作考慮，優(yōu)選將包函體取出，然后將其溶化。從菌體中回收包函體時(shí)，可以采用常規(guī)的已知方法進(jìn)行。例如，通過將菌體破壞、離心分離操作等回收包函體。使蛋白質(zhì)包函體溶化的變性劑有鹽酸胍(例如，6M,pH5-8)、尿素(例如，8M)等。通過透析將這些變性劑除去后，即再生為有活性的蛋白質(zhì)。透析中所用的透析溶液可以用Tris-鹽鄉(xiāng)差沖液或磷酸緩沖液等，濃度為20mM-0.5M,pH為5-8。再生步驟期間的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選控制在500嗎/ml或以下。為了抑制再生的酶本身發(fā)生交聯(lián)，透析溫度優(yōu)選在5'C或以下。此外，除去變性劑的方法除了上述的透析法以外，還有稀釋法、超濾法等。預(yù)期用任何一種都可以使酶再生。另外，該醛縮酶基因來源于假單胞菌屬細(xì)菌的場(chǎng)合，優(yōu)選的一個(gè)方案是以假單胞菌屬細(xì)菌作為宿主菌，表達(dá)產(chǎn)生醛縮酶。例如Shi-EnLu等報(bào)道的使用丁香假單胞菌的重組表達(dá)方法(FEMSMicrobiologyLetters,2002年,210,115-121頁)。此外，有Olsen,R.H.等才艮道的使用銅綠假單胞菌的重組表達(dá)方法(JournalofBacteriology,1982年，150,60-69頁)。還有，Grapner，S.等報(bào)道的使用施氏假單胞菌的重組表達(dá)方法(Biomol.Eng.，2000年，17,11-16頁)。但是，用作表達(dá)醛縮酶的宿主細(xì)胞WI單胞菌屬細(xì)菌不限于這些。關(guān)于將醛縮酶基因?qū)爰賳伟鷮偌?xì)菌的載體，可以使用含有在假單胞菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)有功能的復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒。例如，EzaKalyaeva等報(bào)道的含有銅綠假單胞菌屬細(xì)菌內(nèi)的功能復(fù)制子TFK的質(zhì)粒pKXH4.05。此外，也可以使用用于革蘭氏陰性菌轉(zhuǎn)化的所謂廣范圍宿主載體。這些載體中，已知RK404(Ditta，G.等，Plasmid，1985年，13,149-153頁)、RSF1010(Frey,J,等，Gene,1982年，24,289-296頁)等在假單胞菌屬細(xì)菌中也有功能。用序列表的序列號(hào)1所示的DNA作為編碼醛縮酶的DNA時(shí)，可產(chǎn)生具有序列號(hào)2或3所述氨基I臾序列的醛縮酶。(II)反應(yīng)2的反應(yīng)條件采用酶系統(tǒng)時(shí)，反應(yīng)2的反應(yīng)條件說明如下。催化反應(yīng)2的酶，只要是能夠?qū)νㄊ?3)所示的取代cc-酮酸和草酰乙酸或丙酮酸通過醛醇縮合，合成通式(4)所示的取代oc-酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶，就可以使用而無特別的限定。也就是說，只要是催化該反應(yīng)的酶，無論是微生物來源的酶或是通過基因重組技術(shù)得到的酶都可以使用。作為這樣的酶，優(yōu)選在(I)反應(yīng)2中使用的酶一項(xiàng)中說明的酪縮酶。在這種場(chǎng)合，以下兩種途徑獲得的酶都可以使用培養(yǎng)假單胞菌屬、歐文氏屬、黃桿菌屬、黃單月包菌屬中催化反應(yīng)2、生成醛縮酶的菌體所得到的醛縮酶；通過重組DNA技術(shù)，制備產(chǎn)生催化該反應(yīng)的酶的轉(zhuǎn)化體，然后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體而獲得的醛縮酶。反應(yīng)2中，所謂"在酶的存在下"意味著在能夠?qū)τ赏ㄊ?3)所示的fl代a-酮酸和草酰乙酸或丙酮酸合成通式(4)所示的耳又代a-酮酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的狀態(tài)下，酶存在于反應(yīng)系統(tǒng)中。例如，可以在反應(yīng)系統(tǒng)中加入單純的酶，也可以加入有酶活性的孩i生物(醛縮酶產(chǎn)生菌、用重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)、該;微生物的培養(yǎng)物(液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)等)、培養(yǎng)基(培養(yǎng)物除去菌體后的剩余物)、該培養(yǎng)物的處理物。用微生物的培養(yǎng)物的場(chǎng)合，可以在培養(yǎng)微生物時(shí)，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)2,也可以用預(yù)先培養(yǎng)而得到酶的培養(yǎng)物進(jìn)行反應(yīng)2。另外，這里所說的"處理"是指以取出菌體內(nèi)的酶為目的而進(jìn)行的處理，例如用超聲波、玻璃珠、French壓機(jī)、冷凍干燥處理和用溶菌酶、有機(jī)溶劑、表面活性劑等的處理。此外，經(jīng)過這些處理后的處理物，通過常規(guī)方法(液體色語、硫銨分級(jí)等)制備的粗酶級(jí)分和精制酶，只要具有所要求的能力，也可以使用。例如，使用醛縮酶產(chǎn)生菌或通過重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，制備通式(4)所示的取代a-酮酸時(shí)，可以在培養(yǎng)的同時(shí)，將底物直接加入38培養(yǎng)液中；也可以使用從培養(yǎng)液中分離出來的菌體、洗凈的菌體等。此外，也可以直接使用菌體經(jīng)破石f或溶菌后的菌體處理物、從該菌體處理物回收醛縮酶作為粗酶液使用、或進(jìn)一步將酶精制后使用。在利用上述培養(yǎng)物或其處理物時(shí)，還可以將其包埋在卡拉膠和聚丙烯酰胺中，或者固定在聚醚砜和再生纖維素等的膜上使用。在酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)2時(shí)，將含有上述通式(3)所示的取代a-酮酸、草酰乙酸或丙酮酸中的至少一種、以及催化反應(yīng)2的酶的反應(yīng)液調(diào)節(jié)至20-50。C的適合溫度、保持pH為6-12、靜置、振蕩、或攪拌30分鐘-5天即可。該反應(yīng)液中添加Mg2、Mn2+、Ni2+、Co"等二價(jià)陽離子也可以使反應(yīng)速度提高。從成本考慮，有時(shí)優(yōu)選使用Mg2+。在反應(yīng)液中添加這些二價(jià)陽離子時(shí)，在不抑制反應(yīng)的范圍內(nèi)，任何一種鹽都可以用，但優(yōu)選用MgCl2、MgS04、MnS04等。對(duì)于這些二價(jià)陽離子的添加濃度，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過簡(jiǎn)單的預(yù)備試驗(yàn)即可以決定，可以添加0.01mM-10mM，優(yōu)選0.1mM-5mM,更優(yōu)選0.5mM-2mM。以下是實(shí)施反應(yīng)2時(shí)，一個(gè)優(yōu)選的反應(yīng)條件的例子。在含100mM緩沖液、50mM吲咮-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mMMgCl2、10/0(v/v)甲苯的反應(yīng)液中，添加作為酶源的表達(dá)醛縮酶的大腸桿菌洗凈菌體，使其含量達(dá)到10%(w/v),33。C下振蕩反應(yīng)4小時(shí)后，得到4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)。生成的通式(4)的取代a-酮酸可以用已知的技術(shù)分離精制。例如，使其與離子交換樹脂接觸，吸附堿性氨基酸，洗脫后進(jìn)行結(jié)晶的方法；或洗脫后用活性碳等脫色、過濾，然后結(jié)晶的方法等。通過反應(yīng)2,由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)可以生成作為合成莫納汀的中間體的前體酮酸(IHOG)。[C]反應(yīng)3本發(fā)明的反應(yīng)3是關(guān)于制備莫納汀的反應(yīng)，并被優(yōu)選用于由前體酮酸(IHOG)合成莫納汀。但是，反應(yīng)3不僅可用于合成莫納汀，而且可廣泛用于由下述通式(1)的取代a-酮酸生成通式(2)的谷氨酉吏書f生物的反應(yīng)。其中，R'及]^相互獨(dú)立，各自代表選自氫原子、碳原子數(shù)為1-8的烷基、碳原子數(shù)為1-8的烷氧基、碳原子數(shù)為2-9的羧烷基、碳原子數(shù)可至20的芳基、碳原子數(shù)可至20的芳烷基、含雜環(huán)的烴基、羥基中的取代基。但是，R1和112之一代表氫原子的場(chǎng)合，另一方不代表氫原子、曱基或乙基。此外，R1和W之一代表羥基的場(chǎng)合，另一方不代表氫原子、曱基。該式中的R1取代基中含有的芳香環(huán)或雜環(huán)也可進(jìn)一步含有卣原子、羥基、碳原子可至3的烷基、碳原子可至3的烷氧基和氨基中的至少一種。其中，優(yōu)選R'選自碳原子數(shù)為2-4的烷基、碳原子數(shù)為2-4的羧烷基、苯甲基和3-吲哚甲基(苯環(huán)或吲哚環(huán)也可以還含有鹵原子.(碘原子、溴原子、氯原子、氟原子等)、羥基、碳原子數(shù)可至3的烷基、碳原子數(shù)可至3的烷氧基和氨基中的至少一種)，優(yōu)選f是羥基。更優(yōu)選W為苯曱基或3-吲哚曱基，R為羥基。W為苯甲基或3-吲哚曱基，112為羥基的場(chǎng)合，也就是說,在使用IHOG(4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸)作為通式(1)的取代a-酮酸的場(chǎng)合，得到通式(2)的谷氨酸衍生物莫納汀。此外，R'為苯曱基，f為羥基的場(chǎng)合，也就是說，在使用PHOG(4-苯曱基-4-羥基-2-氧代戊二酸)作為通式(1)的取代a-酮酸的場(chǎng)合，得到通式(2)的谷氨酸衍生物的莫納汀類似物4-苯甲基-4-羥基谷氨酸(PHG)。作為底物的通式(1)所示的取代oc-酮酸，優(yōu)選用在[B]反應(yīng)2一項(xiàng)中說明的方法所得的通式(4)的取代cx-酮酸。更優(yōu)選采用由按照[A]反應(yīng)1中說明的方法制備的吲哚-3-丙酮酸，通過[B]反應(yīng)2的方法制備的IHOG,但是，通式(1)所示的取代cx-酮酸的制備方法當(dāng)然不限于這些方法。反應(yīng)3利用對(duì)以取代a-酮酸為底物生成相應(yīng)氨基酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶反應(yīng)，例如，它涉及通過對(duì)氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行催化的蛋白質(zhì)的作用，或通過產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的微生物的作用，制備谷氨酸衍生物的方法。這里所說的"氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)"是指將酮化合物前體轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)的氨基化合物、氨基供體底物轉(zhuǎn)化為酮化合物的反應(yīng)。下面，按以下順序?qū)Ρ景l(fā)明反應(yīng)3的實(shí)施方式詳細(xì)地說明(C-l)反應(yīng)3中使用的酶(C-2)反應(yīng)3的反應(yīng)條件。(C-l)對(duì)生成氨基酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶反應(yīng)3中，對(duì)以取代cc-酮酸為底物生成相應(yīng)的氨基酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶例如有作為催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，有轉(zhuǎn)氨酶；還有作為催化酮酸還原的氨基化反應(yīng)的酶，有脫氬酶。反應(yīng)3中利用的轉(zhuǎn)氨酶只要是對(duì)由出發(fā)原料取代a-酮酸禾口氨基供體生成相應(yīng)的谷氨酸衍生物的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶即可。利用這樣的酶的作用，可以將上述通式(1)所示的取代a-酮酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的谷氨酸衍生物(上述通式(2)中所示)。在這種情況下，所用的氨基供體為含有氨基的化合物。例如，包括天然和非天然的L-氨基酸或D-氨基酸等氨基化合物。亦即，可以舉出以下例子谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、纈氨@吏、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸等氨基酸。反應(yīng)中添加1種氨基供體或多種氨基酸供體的混合物都可以。一般，L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶通過將L-氨基酸供體的氨基轉(zhuǎn)移至前體酮酸而生成目的L-氨基酸；D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶通過將D-氨基酸供體的氨基轉(zhuǎn)移至前體酮酸而生成目的D-氨基酸。利用這種酶的選"t奪性，也可以對(duì)應(yīng)該生成的谷氨酸衍生物的光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行選4爭(zhēng)。例如，在D-丙氨酸、D-谷氨酸、D-天冬氨酸等D-氨基酸存在下，通過D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用，可以由前體酮酸選4%性地生成D-谷氨酸4汙生物。如以上所述，作為本發(fā)明課題的谷氨酸衍生物之一的莫納汀，除了天然類型(2S，4S)之外，還存在3種光學(xué)異構(gòu)體，現(xiàn)已證實(shí)，任何一種的甜度都為蔗糖的數(shù)百倍至數(shù)千倍。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過用D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶作用于莫納汀的前體酮酸，可以立體選擇性地生成2R型的莫納汀。另外，通過L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用，可以選擇性地生成2S型的莫納汀。更優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，使用D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，可以選擇性地生成高甜度的2R型異構(gòu)體。D-氨基酸用作氨基供體時(shí)，在反應(yīng)液中添加相應(yīng)的L-氨基酸，通過使其與催化該氨基酸消旋化的酶共存，也可以作為D-氨基酸供體提供。這樣的消旋酶的優(yōu)選例有丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、天冬氨酸消旋酶、苯丙氨酸消旋酶等。在這種情況下，可以在D-谷氨酸衍生物生成過程中，在反應(yīng)液中添加L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、或上述L-氨基酸的消旋混合物。上述催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶可以通過培養(yǎng)產(chǎn)生該酶的微生物來制備。這樣的微生物例如有氣單胞菌屬、土壤桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、芽孢桿菌屬、拜葉林克氏菌屬、埃希氏菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬、類芽孢桿菌屬的微生物。這些微生物具體舉例如下。也就是說，具有由上述通式(1)中所述的取代a-酮酸生成上述通式(2)所述的谷氨酸衍生物活性的L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)生菌有以下例子。嗜水氣單胞菌IFO3820才艮癌土壤桿菌IFO3058糞產(chǎn)堿菌ATCC8750印度拜葉林克氏菌ATCC9037大腸桿菌ATCC12814雷氏普羅威登斯菌IFO13501摩氏摩根氏菌IF03848此外，D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌的例子列舉如下。球形芽孢桿菌ATCC10208塵埃芽孢桿菌AJ1327幼蟲類芽孢桿菌塵埃芽孢桿菌亞種ATCC13537浸麻芽孢桿菌AJ1617浸麻類芽孢桿菌ATCC8244遲緩芽孢桿菌AJ12699遲緩芽孢桿菌ATCC1084042另外，浸麻芽孢桿菌AJ1617已按下述進(jìn)行保藏。(a)受理號(hào)FERMBP-8243(2002年11月22日由FERMP-18653轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏單位)(b)受理日2001年12月13日(c)保藏地點(diǎn)獨(dú)立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城縣O<(f市東1丁目1番地1中央第6)這些微生物可以是由土壤、^i物等自然界新分離的菌抹，或者也可以是進(jìn)一步用誘變導(dǎo)入劑處理或重組DNA技術(shù)等人工育種的菌抹。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，也可以將目的基因整合到微生物細(xì)胞中，該目的基因編碼對(duì)氨基從取代a-酮酸轉(zhuǎn)移至谷氨酸衍生物的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶。另外，已^^利用重組DNA技術(shù)制備酶、生理活性物質(zhì)等有用蛋白質(zhì)的例子有4艮多，通過利用重組DNA技術(shù)，可以大量制備天然微量存在的有用蛋白質(zhì)。整合的基因可舉出L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因。舉例來說，球形芽孢桿菌和浸麻芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因可以導(dǎo)入微生物中。有關(guān)球形芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因，在歐洲專利公布0736604中，以及Tayor等在JournalofBacteriol，1998年，180巻，16號(hào)，4319頁中都有凈艮道。此外，作為浸麻芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因可以使用序列表序列號(hào)17所述的浸麻芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因DNA。使用序列表序列號(hào)17所述的浸麻芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因DNA的場(chǎng)合，得到序列表的序列號(hào)18所述的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶。另外，編碼該浸麻芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因及氨基酸序列是首先由本發(fā)明者們提出的。D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的來源不限于這些，只要是編碼生成目的D-谷氨酸衍生物的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的基因都可以使用。用重組DNA技術(shù)大量制備蛋白質(zhì)時(shí),可以使用細(xì)菌細(xì)胞、放線菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等作為轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。其中，在重組DNA操作方面已有實(shí)踐基礎(chǔ)的微生物是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、短狀桿菌屬、棒桿菌屬、鏈霉菌屬、以及大腸桿菌屬等。因?yàn)樵谟么竽c菌大量制備蛋白的技術(shù)方面，已掌握了很多知識(shí)，所以一般選用大腸菌，優(yōu)選大腸桿菌。可以用攜帶氨基轉(zhuǎn)移酶目的基因的質(zhì)粒、噬菌體等載體將該基因?qū)脒@些微生物中，也可以通過同源重組，將目的基因整合到該細(xì)胞的染色體上。優(yōu)選所謂的多拷貝型的質(zhì)粒載體，例如，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的載體有含有來源于ColEl的復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒，例如pUC系列的質(zhì)粒、pBR322系列的質(zhì)?；蚱溲苌铩ＭǔＴ诖竽c菌中制備蛋白所用的啟動(dòng)子可以用作這些載體中使氨基轉(zhuǎn)移酶目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子，例如T7啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子等強(qiáng)啟動(dòng)子。此外，為了擴(kuò)大制備量，優(yōu)選在蛋白質(zhì)基因的下游連接作為終止子的轉(zhuǎn)錄終止序列。該終止子有T7終止子、fd噬菌體終止子、T4終止子、四環(huán)素抗性基因的終止子、大腸菌trpA基因的終止子等。此外，為了篩選轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選該載體含有氨千青霉素抗性基因等標(biāo)記。這樣的質(zhì)粒例如有pUC系列(寶酒造公司制備)、pPROK系列(ClontechLaboratoriesInc.制備)、pKK233-2(ClontechLaboratoriesInc.制備)等市售的具有強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體。對(duì)于產(chǎn)生反應(yīng)3中使用的酶的微生物的培養(yǎng)方法，可以采用通常該領(lǐng)域所用的培養(yǎng)基，即含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類、微量金屬鹽類、維生素等的培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。此外，根據(jù)微生物的種類或培養(yǎng)條件，也可以在培養(yǎng)基中添加約0.1-1.0g/dl左右的氨基酸等氨基化合物，提高氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性。培養(yǎng)基因重組細(xì)胞的場(chǎng)合，可以適當(dāng)添加與載體選才奪標(biāo)記對(duì)應(yīng)的氨芐青霉素、卡那霉素、新霉素、氯霉素等藥劑。此外，根據(jù)載體所攜帶的啟動(dòng)子，添加適量的誘導(dǎo)劑也可以提高該重組基因的表達(dá)量。舉例來說，在lac啟動(dòng)子的下游連接目的基因構(gòu)建載體時(shí)，可以適當(dāng)添加終濃度為0.1mM-5mM的異丙基l-石克代-p-D-吡喃半乳糖苦(IPTG),或者也可以適當(dāng)添加終濃度為0.1-5g/dl、優(yōu)選0.5g/dl-2g/dl的半乳糖，以代替IPTG。對(duì)于用作上述培養(yǎng)基成分的具體物質(zhì)，例如碳源，只要是所用的微生物能利用的碳源則沒有限制，例如，可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、醋酸等，或它們的混合物。硫酸銨、氯化銨、尿素、酵母提取物、肉提取物、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物等，或它們的混合物可以用作氮源。具體的培養(yǎng)基組成舉例如下富馬酸0.5g/dl，酵母提取44物1g/dl,胨1g/dl，碌u酸銨0.3g/dl,K2HP040.3g/dl，KH2P040.1g/dl，F(xiàn)eS04.7H2〇1mg/dl,以及MnS04.4H201mg/dl(pH7.0)。對(duì)于培養(yǎng)溫度，通常在所用微生物的生長(zhǎng)范圍，即在10-45。C下進(jìn)行，優(yōu)選20°C-40°C。更優(yōu)選在25-37。C的范圍。另夕卜，培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為2-12，較優(yōu)選為3-10，更優(yōu)選調(diào)節(jié)至4-8的范圍。通氣條件設(shè)定在適合于所用的微生物生長(zhǎng)的條件，優(yōu)選好氣條<牛。反應(yīng)時(shí)間通常為約12-120小時(shí)，優(yōu)選反應(yīng)約24-96小時(shí)左右。(C-2)反應(yīng)3的反應(yīng)條件反應(yīng)3的特征是在酶的存在下，由通式(1)所示的取代a-酮酸生成式(2)的谷氨酸衍生物。反應(yīng)3中，所謂"在酶的存在下"意味著在能夠由通式(1)所示的取代a-酮酸生成通式(2)所示的谷氨酸衍生物的狀態(tài)下，使酶存在于反應(yīng)系統(tǒng)中。換句話說，只要能將通式(1)所示的取代a-酮酸轉(zhuǎn)換為通式(2)所示的谷氨酸4汙生物，則可以-使酶以〗壬何形式存在于反應(yīng)系統(tǒng)中。例如，可以在瓦應(yīng)系統(tǒng)中加入單純的酶，也可以加入有該酶活性的樣么生物(產(chǎn)生酶的菌、用重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)、該微生物的培養(yǎng)物(液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)等)、培養(yǎng)基(培養(yǎng)物除去菌體后的剩余物)、該培養(yǎng)物的處理物。用微生物的培養(yǎng)物的場(chǎng)合，可以在培養(yǎng)微生物時(shí)，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)3,也可以用為得到酶而預(yù)先培養(yǎng)的培養(yǎng)物進(jìn)行反應(yīng)3。另外，這里所說的"處理"是指以取出菌體內(nèi)的酶為目的而進(jìn)行的處理，例如用超聲波、玻璃珠、French壓機(jī)、冷凍干燥處理和用溶菌酶、有機(jī)i容劑、表面活性劑等的處理。此外，經(jīng)過這些處理后的處理物，通過常規(guī)方法(液體色譜、硫銨分級(jí)等)制備的粗酶級(jí)分和精制酶，只要具有所要求的能力，也可以使用。在利用上述培養(yǎng)物或其處理物時(shí)，還可以將其包埋在卡拉膠或聚丙烯酰胺中，或者固定在聚醚砜或再生纖維素的膜上使用。反應(yīng)3中，作為底物的取代a-酮酸包括上述通式(1)所示的取代oc-酮酸。反應(yīng)系統(tǒng)中，也可以含有輔酶、表面活性劑、有機(jī)溶劑等促進(jìn)反應(yīng)的物質(zhì)。例如，為了提高底物進(jìn)入菌體內(nèi)部的滲透性，也可以使用TritonX、Tween等表面活性劑和曱苯、二曱苯等有機(jī)溶劑。此外，也可以在培養(yǎng)基中添加5-磷酸吡。多醛等輔酶類物質(zhì)。在產(chǎn)酶的培養(yǎng)和反應(yīng)3分開i也依次進(jìn)行的場(chǎng)合，后者反應(yīng)3的步驟不必在好氣的環(huán)境下進(jìn)行，而可在進(jìn)一步通過氮?dú)獾闹脫Q、氬氣的置換、加入亞硫酸鈉等除去反應(yīng)'液中溶解氧的系統(tǒng)中，在嫌氣的環(huán)境下進(jìn)行。對(duì)于反應(yīng)溫度，通常在所用酶具有活性的范圍內(nèi)，即優(yōu)選在10-5(TC下進(jìn)行，較優(yōu)選20°C-40°C。更優(yōu)選在25-37°C的范圍進(jìn)行。反應(yīng)的pH值通常為2-12,優(yōu)選為6-11，更優(yōu)選調(diào)節(jié)至7-9的范圍。反應(yīng)時(shí)間通常為約1-120小時(shí)左右，優(yōu)選反應(yīng)約l-72小時(shí)左右，更優(yōu)選反應(yīng)約1-24小時(shí)左右。另外，培養(yǎng)液或反應(yīng)液中的谷氨酸衍生物或取代oc-酮酸的定量，可以用眾所周知的方法快速測(cè)定。即，筒單地，可以用采用Merck/〉司制備的"Silicagel60F254"等的薄層色譜法；要獲得更高的分析精度，可以通過利用GLSciences制備的"InertsilODS-80A"或Daicel化學(xué)工業(yè)公司制備的"CROWNPAKCR(+)，，等光學(xué)離析柱的高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)定。這樣，培養(yǎng)液或反應(yīng)液中積累的谷氨酸衍生物可以通過常規(guī)方法收集，然后使用。在這種情況下，從培養(yǎng)液或反應(yīng)液中收集的方法可根據(jù)需要，將該領(lǐng)域中通常使用的眾所周知的技術(shù)，例如過濾、離心分離、真空濃縮、離子交換色鐠法、吸附色譜法、結(jié)晶等操作適當(dāng)?shù)亟M合使用。另外，目的谷氨酸衍生物能以游離態(tài)的形式得到，但根據(jù)需要，也能以鹽的形式獲得。鹽的形式包括與堿的鹽。例如，可舉出氳氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣等無機(jī)^咸，銨、各種胺等有機(jī)^堿。實(shí)施例以下舉出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作更具體的說明，但本發(fā)明不只限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1實(shí)施例1涉及本發(fā)明的反應(yīng)①。實(shí)施例1中的L-色氨酸、p引味-3-丙酮酸及巧1咮醋酸的定量用高壓液相色誥法(柱InertsilODS-2(4.6x250mm),柱溫度40°C,洗脫液0.1MKH2P04-H3P04(pH=2.80)/CH3CN=l/9-5/5，流速l.Oml/min,檢測(cè)UV210nm)進(jìn)行。(1-1)通過氨基酸氧化酶活性菌的菌體反應(yīng)，由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸將50ml含有酵母才是取物1g/dl、聚胨1g/dl、(NH4)2S040.3g/dl、K2HP040.3g/dl、KH2P040.1g/dl、MgS047H200.05g/dl、FeS047H201mg/dl、MnS〇4.4H201mg/dl的培養(yǎng)基(pH7.0)裝入500ml坂口氏燒并瓦中，ll(TC滅菌lO分鐘。分別取一鉑金環(huán)將預(yù)先在肉汁瓊脂培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)24小時(shí)的無色桿菌種AJ2425、雷氏普羅威登斯菌IFO13501或摩氏摩根氏菌IF03168的菌體，接種入上述培養(yǎng)基中，3(TC振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，通過離心分離，收集培養(yǎng)物中的菌體，分別用50ml的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.6)冼凈，再通過離心分離制備洗凈菌體。將上述的這些濕菌體按濕菌體重量為1%(w/v)的量加入含有1g/dlL-色氨酸、20mMTris-HC1緩沖液(pH8.0)的反應(yīng)液中。取lml該反應(yīng)液移至5ml試管中，30。C振蕩1小時(shí)，使其反應(yīng)。反應(yīng)終了后，測(cè)定吲哚-3-丙酮酸(IPA)的生成量、L-色氨酸(L-Trp)的殘留量以及吲哚醋酸(IAA)副產(chǎn)物的生成量(參照表l)。表l由L-色氨酸生成巧l哚-3-丙酮酸的生成量L一TrpIPA1AA菌體(g/dl)(g/dl)(g/dl)無色桿菌種AJ24250.020.970.03雷氏普羅威登斯菌IFO1350100.980.03摩氏摩根氏菌IFO316800.990.02結(jié)果，在實(shí)施了洗凈菌體反應(yīng)的任何一組實(shí)驗(yàn)中都積累了0.97-99g/dl的吲哚-3-丙酮酸，由1g/dl的]^_色氨酸差不多定量地生成(3引哚-3-丙酮酸。(1-2)通過對(duì)摩氏摩根氏菌IFO3168的洗凈菌體反應(yīng)液的氮?dú)庵脫Q處理和鹽酸結(jié)晶，收集吲咮-3-丙酮酸(a)摩氏摩根氏菌IFO3168的洗凈菌體反應(yīng)液的制備用與(1-1)同樣的方法制備摩氏摩根氏菌IF03168的洗凈菌體。準(zhǔn)備6個(gè)裝入50ml含有1g/dlL-色氨酸、20mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)的反應(yīng)液的坂口氏燒瓶，按濕菌體重量為1%(w/v)的量，分別添加制備好的濕菌體，3CTC振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，通過離心分離除去菌體，得到約290ml反應(yīng)液。(b)通過對(duì)反應(yīng)液的氮?dú)庵脫Q和酸結(jié)晶回收巧l哚-3-丙酮酸取74mlU)所得的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至茄型燒瓶中，進(jìn)行氮?dú)庵脫Q。加入鹽酸，將該反應(yīng)液的pH調(diào)至2或以下。74ml該反應(yīng)液中，添加15ml6N的鹽酸(鹽酸的終濃度約為1N)，2(TC下進(jìn)行攪拌。通過該操作析出結(jié)晶。24小時(shí)后，將此混合物過濾，用15ml的水洗凈結(jié)晶。將這樣所得的濕結(jié)晶在40。C下減壓干燥，得到684mgP引咮-3-丙酮酸(相對(duì)于起始的色氨酸，收率為79.5%)。該。引咮-3-丙酮酸為黃白色結(jié)晶，根據(jù)高壓液相色鐠法(HPLC)分析，其含量為97.2wt0/。。(c)通過反應(yīng)液的酸結(jié)晶，回收巧l咮-3-丙酮酸取66ml(a)所得的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至茄型燒瓶中，加入13ml6N的鹽酸，將該反應(yīng)液的pH調(diào)至2或以下，2(TC下進(jìn)行攪拌。通過該操作析出結(jié)晶。24小時(shí)后，將此混合物過濾，用13ml的水洗凈結(jié)晶。將這樣所得的濕結(jié)晶在4CTC下減壓干燥，得到538mg。引哚-3-丙酮酸(相對(duì)于起始的色氨酸，收率為58.2%)。該P(yáng)引咮-3-丙酮酸為褐色結(jié)晶，根據(jù)高壓液相色i普法(HPLC)分析，其含量為80.5wt%。(d)所得的吲哚-3-丙酮酸的比較比較由(b)及(c)所得的吲咮-3-丙酮酸(IPA)結(jié)晶的性質(zhì)(參照表2)。由該比較結(jié)果可知，很明顯，進(jìn)行氮?dú)庵脫Q的組(b)其結(jié)晶中的IPA含量多，作為副產(chǎn)物的吲咪醋酸(IAA)不純物的含量減少，而且，在實(shí)施氮?dú)庵脫Q的組，還抑制了結(jié)晶的著色。將各實(shí)驗(yàn)組的結(jié)晶稀釋至10mg/dl，測(cè)定其在450nm及400nm的透射比時(shí)，氮?dú)庵脫Q組的透射比減少，即證實(shí)抑制了通過分解而引起的著色。表2IPA的結(jié)晶性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>由以上的結(jié)果可知，由色氨酸可以有效、簡(jiǎn)便地制備p引哚-3-丙酮酸。實(shí)施例2實(shí)施例2是用化學(xué)合成系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)2的例子。(2-1)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)的合成在64.45ml溶解了18.91g氫氧化鉀(286.5mmol,含量為85wt0/0)的水中，加入7.50g吲哚-3-丙酮酉臾(35.8mmol,含量為97.0重量％)和14.18g草酰乙酸(107.4mmol)，使其溶解。該混合'溶液在35。C下攪拌24小時(shí)。再加入40.0ml的3N鹽酸中和(pH=7.0)，得到153.5g反應(yīng)中和液。該反應(yīng)中和液中含有5.55gIHOG,收率為53.3%(相對(duì)于p引咮-3-丙酮酸)。在該反應(yīng)中和液中加入水至168ml,將其通過用合成吸附劑(三菱化學(xué)公司制備的DIAION-SP207)840ml充填的樹脂柱(直徑4.8cm)。進(jìn)一步使純水以23.5ml/min的流速通過該柱，收集1.73-2.55(L/L-R),得到含有3.04g高純度IHOG的水溶液，收率為54.7%(相對(duì)于加到樹脂上的量)。(NMR(核磁共振))測(cè)定'H-NMR(400MHz，D20):3.03(d，lH,J二14.6Hz)，3.11(d，lH，J=14.6Hz)，3.21(d,lH,J=18.1Hz)，3.40(d,lH，J二18.1Hz)，7.06-7.15(m，3H),7.39(d，lH,JN7.8Hz),7,66(d,lH，J=7.8Hz)。13C-NMR(100MHz，D20):35.43，47.91,77.28,109.49，112.05,119.44，119.67,121.91,125.42,128.41,136.21,169.78，81.43,203.58(2-2)4-苯基曱基-4-羥基-2-氧代戊二酸(PHOG)的合成在25ml溶解了13.8g氫氧化鉀(純度85%)的水中，力口入5.0g苯丙酮酸(30.5mmol)、12.1g草酰乙酸(91.4mmol)，室溫下反應(yīng)72小時(shí)。用濃鹽酸將反應(yīng)液的pH調(diào)節(jié)至2.2，用醋酸乙酯抽提。用飽和食鹽水將有機(jī)層洗凈、并加入無水硫酸鎂干燥后，進(jìn)行濃縮，得到殘?jiān)?。該殘?jiān)么姿嵋阴ズ蜁醣窟M(jìn)行重結(jié)晶，得到PHOG結(jié)晶2.8g(11.3mmol)。(NMR測(cè)定)'H-麗R(D20)5:2.48(d，J=14.4Hz,0,18H)，2.60(d,J二14.4Hz，0.18H),2,85-3.30(m,3.64H),7.17-7.36(m，5H)(分子量測(cè)定)ESI-MS計(jì)算值C12H1206=252.23，分析值251.22(MKT)實(shí)施例3實(shí)施例3是用酶系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)2的例子。另外說明，實(shí)施例3中，用作底物的IHOG和PHOG按實(shí)施例2中所述方法合成。(3-1)PHOG醛縮酶活性菌的收集收集以4-苯基曱基-4-羥基-2-氧代戊二酸(PHOG)為底物的醛縮酶活性菌。在肉汁平板培養(yǎng)基(榮研化學(xué)公司制備)上接種被測(cè)微生物(細(xì)菌、酵母)，30。C下培養(yǎng)24小時(shí)。將此培養(yǎng)物接種于含有甘油0.5g/dl、富馬酸0.5g/dl、酵母^是取物0.3g/dl、月東0.2g/dl、石克酸銨0.3g/dl、K2HP040.3g/dl、KH2P040.1g/dl、MgS〇4,7H200.05g/dl、鄰苯二曱酸鈉0.25g/dl、瓊脂粉2g/dl(pH6.5)的平板培養(yǎng)基上，30。C下培養(yǎng)24小時(shí)。將所得的菌體按濕菌體重量約為l%(w/v)的量接種于含有l(wèi)OOmMTris-HCl(pH8.0)、50mMPHOG、1mMMgCl2、5mM磷酸鉀溶液(KPi)、l%(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，30。C下反應(yīng)24小時(shí)。該反應(yīng)液中的游離丙酮酸濃度用乳酸脫氬酶(LDH)通過酶法進(jìn)行定量。在200Ml含有100mMTris-HCl(pH8.0)、1.5mMNADH、5mMMgCl2、25U/mlLDH的反應(yīng)液中，加入10pl樣品，30'C下溫育10分鐘。測(cè)定反應(yīng)后的340mM的吸光度，由NADH的減少量對(duì)測(cè)定樣品中的丙酮酸量進(jìn)行定量。此外，生成的苯丙酮酸量通過<吏用GLSciences公司制備的InertsilODS-2"(5ym，4.6x250mm)的HPLC分析進(jìn)4亍定量。分析的條^f牛3p以下f斤示。流動(dòng)相20%(v/v)乙腈/0.05%(v/v)三氟乙酸水溶液流速1ml/min柱溫度4(TC才全測(cè)UV210nm按照上述條件，PHOG在保留時(shí)間約為9.8分鐘時(shí)洗脫出來，苯丙酮酸在保留時(shí)間約為12分鐘時(shí)凈皮洗脫，各自分級(jí)并可進(jìn)行定量。添加;故測(cè)菌體的組中由PHOG生成的丙酮酸或苯丙酮酸量，與對(duì)照組(未添加菌體組)的生成量之差值定義為由醛縮酶所生成的量。結(jié)果，可得出表3所示菌抹的以PHOG為底物的醛縮酶活性。表3PHOG醛縮酶活性菌林的篩選結(jié)果菌抹丙酮酸(邁M)苯丙酮酸(mM)腐臭假單胞菌ATCC468334,935.0暈斑假單胞菌AJ279133.633.9解韌帶假單胞菌AJ15821.12.9歐文氏菌種AJ29170.83.0萊茵黃桿菌AJ24683.06.1柑橘黃單胞菌AJ27971.03.2選擇腐臭4i單胞菌ATCC4683,研究由苯丙酮酸與草酰乙酸或丙酮酸的合成PHOG的反應(yīng)。在含有100mMTris-HCl(pH8.0)、50mM苯丙酮酸、lmMMgCl2、5mMKPi、100mM草酰乙酸或丙酮酸、1%(w/w)曱苯的反應(yīng)液中，按終濃度為約1%(w/v)的量，接種腐臭假單胞菌ATCC4683(AJ2212)菌體，30。C反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC定量測(cè)定生成的PHOG的量。由笨丙酮酸與草酰乙酸或丙酮酸生成PHOG的量如表4所示。表4由苯丙酮酸與草酰乙酸或丙酮酸生成PHOG的量草酰乙酸組丙酮酸組菌體添加組14.3(mM)9.3(mM)對(duì)照(添加Mg)組8.6〗.7對(duì)照(不添加Mg)組痕量未測(cè)由表4可見，菌體添加組的PHOG生成量增加，苯丙酮酸+草酰乙酸和苯丙酮酸+丙酮酸中的i"壬何一種組合都通過該醛縮酶的作用生成PHOG。(3-2)腐臭假單胞菌ATCC4683抹來源的IHOG醛縮酶的精制從腐臭假單胞菌ATCC4683才朱的可溶性級(jí)分精制IHOG醛縮酶按以下所述進(jìn)4f。醛縮酶活性的測(cè)定是"l安以下條件，測(cè)定其以PHOG為底物的醛醇分解活性。反應(yīng)條件50mMTris-HCl(pH8.0)、2mMPHOG、0.2mMNADH、0.2mMKPi、lmMMgCl2、16U/ml乳酸脫氫酶、3ju)酶/600ju1反應(yīng)液，3(TC下測(cè)定340nm的吸光度。l.可溶性部分的制備取一鉑金環(huán)的在肉汁平板培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)24小時(shí)的腐臭假單胞菌ATCC4683菌體，接種于含有50ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基(0.5g/dl甘油，0.5g/dl富馬酸，0.5g/dl硫酸銨，0.3g/diK2HP04,0.1g/dlKH2P04,0.05g/dlMgS04'7H20，0.3g/dl酵母才是取物，0.2g/dl胨，0.25g/di鄰苯二甲酸鈉，0.005%AntifoamA(Sigma公司制備)，用KOH調(diào)節(jié)至pH為6.5)的500ml坂口氏燒瓶中，3(TC振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。在40個(gè)含有50ml制備酶的培養(yǎng)基的500ml坂口氏燒瓶中，每個(gè)接種入0.5ml上述培養(yǎng)液，3(TC振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。通過離心分離，從所得的培養(yǎng)液收集菌體，懸浮于緩沖液A(20mMTris-HC1(pH7.6))中洗凈后，再次離心分離收集菌體。所得的菌體懸于200ml緩沖液A中，4。C下超聲波破碎30分鐘。破碎液經(jīng)離心分離(x8000rpm,10分鐘x2次)除去菌體殘?jiān)?，再次離心分離(x50000rpm,30分4中)，所得的上清即為可溶性部分。2.陰離子交4灸色譜Q-SepharoseFF將80ml上述可溶性部分加到用緩沖液A平衡的陰離子交換色譜柱Q-SepharoseFF26/10(Pharcia公司制備，CV=20ml)上，使其吸附在載體上。用緩沖液A洗出不吸附在載體上的蛋白質(zhì)(非吸附蛋白質(zhì))后，用0M-0.7M線性濃度梯度的KC1(總體積140ml)洗脫吸附的蛋白質(zhì)。4全測(cè)各洗脫級(jí)分的PHOG醛縮酶活性時(shí)，在相當(dāng)于約0.5M的級(jí)分檢測(cè)到PHOG醛縮酶活性的峰。同樣的色諳步驟重復(fù)進(jìn)行2次。3.疏水性色鐠PhenylS印pharoseHPHR16/10將檢測(cè)到有醛縮酶活性的溶液在VC下對(duì)緩沖液B(50mMTris-HCl(pH7.6),1M碌^酸銨，pH7.6)透沖斤一夜，用0.45ym的過濾器過濾。將所得的濾液加到用緩沖液B平衡的疏水性色譜柱PhenylSepharose(Pharcia公司制備，CV=20ml)上，通過該才喿作使其吸附在載體上。用緩沖液B洗出不吸附在載體上的非吸附蛋白質(zhì)后，用1M-0M線性濃度梯度的硫酸銨洗脫醛縮酶。檢測(cè)各洗脫級(jí)分的PHOG醛縮酶活性時(shí)，在硫酸銨濃度為大約0.2M的洗脫位置觀察到有縮醛酶活性。4.凝膠過濾色譜Sephadex200HP16/60分別收集含縮醛酶的級(jí)分，^j"緩沖液A透析，用0.45;am的過濾器過濾。將所得的濾液用超濾膜centriprep10濃縮。將所得的濃縮液加到用緩沖液C(20mMTris-HCl(pH7.6)，0.1MKCl)平衡的凝膠過濾柱S印hadex200HP16/60(Pharcia公司制備)上，以1ml/min的流速洗脫。通過該操作洗脫出66-71ml的縮醛酶級(jí)分。根據(jù)活性峰的洗脫位置，估計(jì)該醛縮酶的分子量為約146kDa。5.陰離子交換色i昝MonoQHR5/5用0.45Mm的過濾器過濾所得的級(jí)分。將由此所得的濾液加到用緩沖液A平衡的陰離子交換色i普柱MonoQHR5/5(Pharcia公司制備)上。通過該操作，使醛縮酶吸附到載體上。用緩沖液A將非吸附蛋白質(zhì)洗出后，用0mM-700mM線性濃度梯度的KC1進(jìn)行蛋白質(zhì)的洗脫(總體積24ml)。檢測(cè)各洗脫級(jí)分的醛縮酶活性，在KCl濃度約為0.4M的洗脫位置觀察到醛縮酶活性。6.鞋基磷灰石色譜CHT-II將所得的級(jí)分對(duì)緩沖液D(lOmM磷酸鉀緩沖液(pH7.0))在4。C下透析一夜，然后用0.45jam的過濾器過濾。將由此所得的濾液加到用緩沖液D平衡的羥基磷灰石色譜柱CHT-II(BioRed公司制備)上。通過該操作，使醛縮酶不吸附在載體上，從而可以與吸附的蛋白質(zhì)分離。將上述色譜操作精制的級(jí)分用作SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)的測(cè)試樣時(shí)，在相當(dāng)于約25kDa的位置檢測(cè)到大致上為單一的條帶，因?yàn)橥ㄟ^凝膠過濾色譜所推測(cè)的分子量為約146kDa,所以推定該醛縮酶形成了6聚體。表5所示為該酶的精制表。表5腐臭假單胞菌ATCC4683來源的IHOG醛縮酶的精制表蛋白質(zhì)比活純化倍數(shù)總活性收率(師〉(U/mg)(u)可溶部分37500.0"1511000-sepharoseHP26/105，00.0604.430.559.BPhenyls叩haroseHP16/1021.20.8936619.037.2"433418.6517.0monoQHR5/50.4910.898005.3310.4羥基磷灰石CHT-II0.02528.702H00.71(3-3)IHOG醛縮酶的內(nèi)部氨基酸序列的測(cè)定將1份約2(ig的精制醛縮酶進(jìn)行SDS-PAGE,然后用色氨酸處理SDS-PAGE的凝膠中的試樣(pH8.5,35°C，20小時(shí))，用反相HPLC分離肽片段。確定分離的片段中，2個(gè)分別為20個(gè)殘基、12個(gè)殘基的氨基酸序列(序列號(hào)4、5)如下。表6測(cè)定的內(nèi)部氨基酸序列。序列號(hào)4SLLDAF0睛TPHISDMLGR序列號(hào)5AEIATGALDQSW54(3-4)腐臭假單胞菌ATCC4683來源的IHOG醛縮酶基因的克隆1.染色體DNA的制備腐臭假單胞菌ATCC4683林在50ml肉汁培養(yǎng)基中30。C下培養(yǎng)一夜(預(yù)培養(yǎng))。取5ml該培養(yǎng)液作為種菌，在50ml的肉汁培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期之后，取50ml培養(yǎng)液進(jìn)行離心操作(12000xg,4°C,15分鐘)，收集菌體。用該菌體按常規(guī)方法制備染色體DNA。2.通過PCR得到內(nèi)部序列根據(jù)測(cè)定的IHOG醛縮酶的內(nèi)部氨基酸序列，合成以下的混合引物(序列號(hào)6、7)。表7由內(nèi)部氨基酸序列設(shè)計(jì)、合成的混合引物<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>用制備的混合引物，以腐臭々i單胞菌ATCC4683的染色體DNA'為模板，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)用PCRThermalPERSONEL(TaKaRa公司制備)進(jìn)行，按下述條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。94°C30秒55°C30秒72°Cl分鐘將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，觀察到約500bp的片段擴(kuò)增。將該DNA片段克隆到pUC18上，測(cè)定堿基序列，根據(jù)所得的DNA片段推測(cè)的氨基酸序列與IHOG醛縮酶的內(nèi)部氨基酸序列一致，證實(shí)了已獲得目的醛縮酶基因。3.通過菌落雜交獲得全長(zhǎng)基因用PCR擴(kuò)增的DNA片^史，通過Southern分析和菌落雜交獲得全長(zhǎng)基因。使用DIGHighPrimer(RocheDiagnostics公司制備)制備DNA探針，按說明書在37。C下溫育過夜(O/N),進(jìn)行探針的標(biāo)記。Southern分析是將1jug染色體DNA用各種限制性酶完全消化，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳后，印跡到尼龍膜上，然后按以下的操作步驟進(jìn)行用DIGEasyHyb(RocheDiagnostics公司制備)進(jìn)行雜交，50。C下雜交1小時(shí)后加入探針，使其雜交過夜。用DIG核苷酸檢測(cè)試劑盒(DIGNucleotideDetectionKit)檢測(cè)條帶。其結(jié)果，-險(xiǎn)測(cè)出以該P(yáng)CR片段為探針的約4kbp的強(qiáng)雜交Pstl片段。然后通過菌落雜交獲得該P(yáng)stl片段。將20|ug染色體DNA用Pstl處理后在瓊脂糖凝膠上電泳，回收約4kbp大小的片段。將此片段與pUC18連接，用大腸桿菌JM109制備文庫。菌落轉(zhuǎn)移至尼龍膜濾器(Hybon-N,Pharmacia公司制備)上，進(jìn)行堿變性、中和、固定化處理，用DIGEasyHyb進(jìn)行雜交。將濾器浸入緩沖液中，42。C下預(yù)雜交l小時(shí)。隨后加入制備好的探針，42。C下雜交16小時(shí)。用SSC洗凈后，用DIG核苦酸檢測(cè)試劑盒(RocheDiagnostics公司制備)檢測(cè)和探針雜交的菌落。結(jié)果，得到與探針強(qiáng)雜交的克隆。測(cè)定由得到的克隆回收的質(zhì)粒DNA的堿基序列，表明其具有序列號(hào)l所示的堿基序列。找出678bp含有對(duì)應(yīng)于確定的內(nèi)部氨基序列的堿基序列(序列號(hào)1的第507-第566位堿基，以及第1046-第1082位堿基)的讀碼框，獲得了全長(zhǎng)的目的醛縮酶。4.IHOG醛縮酶在大腸桿菌中的表達(dá)(之一)用BamHI/Hindm消化用表8所示的引物(序列號(hào)8和9)由腐臭假單胞菌ATCC4683染色體DNA擴(kuò)增的片段，插入pUC18的BamHI/Hindlll位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pUCALD。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，使轉(zhuǎn)化體在含有50Mg/ml氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C下振蕩培養(yǎng)一晝夜(預(yù)培養(yǎng))。取該預(yù)培養(yǎng)液按1%的量接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37。C下進(jìn)行正式培養(yǎng)。培養(yǎng)開始約2小時(shí)后，添加IPTG至終濃度為1mM，再培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體、洗凈，懸浮于1ml20mM的Tris-HCl(pH7.6)中，用Multi-BeadShocker(安井器械公司制備)將菌體破石f。破碎液在15000rpm下離心分離10分鐘，所得的上清用作粗酶液。表8引物序列號(hào)8ALD-5'Bam(5'-GCCGGATCCACAAGGGTTGAGTCATTCATGG-3')序列號(hào)9ALD-3'Hind(5'-CCGAAGCTTTGAGTTCGCCAGGCCAGCC-3')用此粗酶液以PHOG為底物，測(cè)定其醛縮酶活性時(shí)，導(dǎo)入pUC18的大腸桿菌(對(duì)照)未檢測(cè)出PHOG醛縮酶活性，而導(dǎo)入pUCADL的菌抹測(cè)得其PHOG活性為0.81U/mg蛋白。由此表明，該基因編碼目的醛縮酶。(3-5)用醛縮酶表達(dá)抹由p引哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(。引哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)用(3-4)中制備的表達(dá)醛縮酶的大腸桿菌洗凈菌體作為酶源，由吲咮-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸(IHOG)。IHOG的定量通過使用GLSciences公司制備的"InertsilODS畫2"(5iam,4.6x250mm)的HPLC分析進(jìn)行。分析條件如下流動(dòng)相40Q/。(v/v)乙腈/5mM磷酸二氫四丁銨溶液流速1ml/min柱溫度40°C檢測(cè)UV210nm在含有100mM緩沖液(Tris-HCI8.0，9.0，或甘氨酸-NaOH10.0),50mMP引哚-3-丙酮酸，250mM丙酮酸，1mMMgCl2,l%(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，加入表達(dá)醛縮酶的大腸桿菌洗凈菌體至含量為10%(w/v),33。C振蕩反應(yīng)4小時(shí)。4夸反應(yīng)液適當(dāng)?shù)叵♂?，定量測(cè)定生成的IHOG。表9用醛縮酶生成的IHOG的量PH醛縮酶IHOG(mM)8+9.28—0.429+12.19—1.610+10.710—5.4結(jié)果，添加表達(dá)醛縮酶的大腸桿菌的組其IHOG生成量增加，利用該醛縮酶可以生成IHOG。(3-6)IHOG在大腸桿菌中的大量表達(dá)(之二)1.攜帶t卬啟動(dòng)子和rrnB終止子的質(zhì)粒pTrp4的構(gòu)建用表10所示的寡核苷酸為引物，通過PCR(序列號(hào)10和11的組合)，擴(kuò)增大腸桿菌W3110染色體DNA上的trp操縱子的啟動(dòng)子區(qū)目的基因區(qū)域，得到的DNA片段與pGEM-Teasy載體(Promaga公司制備)連接。用該連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，從氨千青霉素抗性抹中，選擇含有trip啟動(dòng)子的插入方向與lac啟動(dòng)子相反的目的質(zhì)粒的菌4朱。然后用Eco0109I/EcoRI處理上述質(zhì)粒，將得到含有trp啟動(dòng)子的DNA片段與pUC19(TaKara公司制備)的Eco01091/EcoRI處理物連接。用該連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,從氨千青霉素抗性抹中，選擇含有目的質(zhì)粒的菌株，質(zhì)粒命名為pTrpl。隨后，用mndlll/HincII處理pKK223-3(AmershamPhamacia公司制備)，將所得含有rmB終止子的DNA片段與pTrpl的Hindlll/PvuII處理物連接。用該連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,從氨千青霉素抗性抹中，選擇含有目的質(zhì)粒的菌林，質(zhì)粒命名為pTrp2。接著，以pTrp2為模板、表10所示的寡核苦酸為引物，通過PCR(序列號(hào)10和12的組合)擴(kuò)增trp啟動(dòng)子區(qū)。用Eco01091/NdeI處理所得的DNA片段，然后與pTrp2的Eco01091/NdeI處理物連4妄。用該連4矣溶液轉(zhuǎn)化大腸4干菌JM109,從氨芐青霉素抗性抹中，選擇含有目的質(zhì)粒的菌抹，該質(zhì)粒命名為58pTrp4。表10序列號(hào)IO5'側(cè)GTATGAGGAGGCCGTAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATGEco01091序列號(hào)ll3'側(cè)TTCGGGGATTCCATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTGC序列號(hào)123'側(cè)GGGGGGGGCATATGCGACCTCCTTATTACGTGAACTTGNdel2.醛縮酶表達(dá)質(zhì)粒ptrpALDl、ptrpALD2的構(gòu)建和在大腸桿菌中的表達(dá)用Ndel/Hindlll消化用表11所示的引物(序列號(hào)9和13)由腐臭假單胞菌ATCC4683染色體DNA擴(kuò)增的片段，插入pTrp4的Ndel/HindlII位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒ptrpALDl。該質(zhì)粒以序列號(hào)l所述的堿基序列中第444位的ATG作為翻i爭(zhēng)起始密碼子，表達(dá)序列號(hào)3所述的氨基酸序列構(gòu)成的醛縮酶基因。此外，用Ndel/Hindlll消化用引物(序列號(hào)9和14)由腐臭假單胞菌ATCC4683染色體DNA擴(kuò)增的片段，插入pTrp4的Ndel/HindlII位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒ptrpALD2。該質(zhì)粒以序列號(hào)1所述的堿基序列中第456位的ATG作為翻譯起始密碼子，表達(dá)序列號(hào)2所述的氨基酸序列構(gòu)成的醛縮酶基因。將構(gòu)建的每種表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，4吏轉(zhuǎn)化體在含50pg/ml氨卡青霉素的LB培養(yǎng)基中37。C下振蕩培養(yǎng)一晝夜(預(yù)培養(yǎng))。將預(yù)培養(yǎng)液按1%的量接種于50ml的LB培養(yǎng)基中，在37。C下進(jìn)行正式培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后約2小時(shí)，添加IPTG至終濃度為lmM,再培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體、洗凈，懸浮于lml的20mMTris-HCHpH7.6)中，用Multi-BeadShocker(安井器械公司制備)將菌體破碎。破碎液在15000rpm下離心分離10分鐘，所得的上清用作粗酶液。表11引物序列號(hào)9ALD-3'Hind(5'--CCGAAGCTTTCAGTTCGCCAGGCCAGCC-3')序列號(hào)13ALD-5'Nde-1(5'-GGTTCAGTCACATATGGAGGTCGCTATGTC-3')序列號(hào)14ALD-5'Nde-2(5'-ATGGAGG丁CCATTAGTCATTGCGCGGTTCACGC-3')用該粗酶液測(cè)定其以PHOG為底物的醛縮酶活性時(shí)，導(dǎo)入pTrp4的大腸桿菌(對(duì)照)未檢測(cè)出PHOG醛縮酶活性，而導(dǎo)入ptrpADLl的菌林檢測(cè)出其PHOG醛縮酶活性為16.1U/mg蛋白；導(dǎo)入ptrpADL2的菌抹檢測(cè)出其PHOG醛縮酶活性為36.0U/mg蛋白。由此可知，由序列號(hào)2或3所述的氨基酸序列形成的醛縮酶都具有醛縮酶活性。實(shí)施例4實(shí)施例4涉及本發(fā)明的反應(yīng)3。另外，實(shí)施例4中，莫納汀及4-苯曱基-4-羥基谷氨酸(PHG)的定量通過使用GLSciences公司制備的"InertsilODS-80A"(5Mm,6x150mm)的高效液相色語進(jìn)行。分析條件如下流動(dòng)相12%(v/v)乙腈/0.05%(v/v)三氟乙酸水溶液；流速1.5ml/min;柱溫度30°C;以及4全測(cè)UV210nm。在上述分析條件下，(2S，4S)-莫納汀和(2R，4R)-莫納汀、可以在12.1分的保留時(shí)間、(2S,4R)-莫納汀和(2R，4S)-莫納汀可以在9.7分的保留時(shí)間、(2S,4S)-PHG和(2R,4R)-PHG可以在7.2分的保留時(shí)間、(2S，4R)-PHG和(2R,4S)-PHG可以在6.0分的保留時(shí)間分別進(jìn)行定量。此外，根據(jù)需要，也可通過利用Dakel化學(xué)工業(yè)公司制備的光學(xué)離析柱"CROWNPAKCR(+)"(4.6x150mm)的高效液相色譜進(jìn)行分析。分析條件如以下所示。(莫納汀的場(chǎng)合)流動(dòng)相過氯酸水溶液(pH1.5)/10%(v/v)曱醇；流速0.5ml/min;柱溫度30°C;以及斗全測(cè)UV210nm在上述條件下，莫納汀光學(xué)異枸體按(2R,4S)、(2R，4R)、(2S，4R)和(2S，4S)的順序，可以分別在42分、57分、64分、和125分的保留時(shí)間進(jìn)行定量。(PHG的場(chǎng)合)流動(dòng)相過氯酸水溶液(pH1.5);流速1ml/min;柱溫度30°C;以及檢測(cè)UV210應(yīng)在上述條件下，PHG的光學(xué)異構(gòu)體按(2R，4S)、(2R,4R)、(2S,4R)、和(2S，4S)的順序，可以分別在20分、28分、31分、和46分的保留時(shí)間進(jìn)行定量。(4-1)用L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶制備(2S，4S)-莫納汀將下述表12所述的微生物接種于肉汁平板培養(yǎng)基(榮研化學(xué)公司制備)上，30°C培養(yǎng)24小時(shí)后，將菌體取出，按5重量％濕菌體的量接種于1ml含有100mMTris-HCl(pH7.6)、30mMIHOG、100mML-谷氨酸一鈉、lmM5'-磷酸吡,醛，以及0.5(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，3(TC溫育16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后定量測(cè)定生成的莫納汀量。結(jié)果如表12所示，由IHOG可以生成(2S,4S)-莫納汀。表12菌抹生成的莫納汀(mM)嗜水氣單胞菌IFO38201.2根癌土壤桿菌IFO30581.9糞產(chǎn)堿菌ATCC87501.6印度拜葉林克氏菌ATCC90370.2大腸桿菌ATCC128140.6雷氏普羅威登斯菌IFO135010.7摩氏摩根氏菌IFO38481.261(4-2)用L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶制備(2S,4S)-PHG將下述表13所述的微生物接種于肉汁平板培養(yǎng)基(榮研化學(xué)公司制備)上，3(TC培養(yǎng)24小時(shí)后，取出菌體，將其按5重量％濕菌體的量接種于1ml含有100mMTris-HCHpH7.6)、30mMPHOG、100MmL-谷氨酸一鈉或L-天冬氨酸一鈉、1mM5'-磷酸吡。多醛，以及0.5(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，30。C溫育16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后定量測(cè)定生成的PHG量。結(jié)果如表13所示，由PHOG可以生成(2S，4S)-PHG。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>(4-3)用L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶制備(2S,4S)-PHG將下述表14所述的微生物接種于肉汁平板培養(yǎng)基(榮研化學(xué)公司制備)上，3CTC培養(yǎng)24小時(shí)。然后在每個(gè)500ml坂口氏燒瓶中分裝了50ml培養(yǎng)基，在ll(TC滅菌IO分鐘的液體培養(yǎng)基中，接種1柏金環(huán)該培養(yǎng)的菌體，在30。C下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，前述培養(yǎng)基含有富馬酸0.5g/dl，酵母提取物lg/dl，胨1g/dl，硫酸銨0.3g/dl，K2HP040.3g/dl,KH2P〇40.1g/dl，F(xiàn)eS047H201mg/dl,以及MnS044H201mg/dl(pH7)。取lml培養(yǎng)液離心分離，所得的菌體用20mMTris-HCl(pH7.6)洗凈、收集菌體后，將該菌體懸浮于1ml含有100mMTris-HCl(pH7.6)、50mMPHOG、100mML-谷氨酸一鈉、1mM5'-磷酸吡。多醛，以及0.5(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，然后轉(zhuǎn)移至10ml的試管內(nèi)，在30。C下振蕩反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后定量測(cè)定生成的PHG量。結(jié)果如表14所示，由PHOG可以生成(2S，4S)-PHG。表14菌抹生成的PHG(mM)嗜水氣單胞菌IFO382016.4糞產(chǎn)堿菌ATCC875012.3雷氏普羅威登斯菌IFO1350117.5摩氏摩根氏菌IFO384817.2(4-4)用D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶制備2R-PHG將下述表15所述的微生物接種于肉汁平板培養(yǎng)基(榮研化學(xué)公司制備)上，3(TC培養(yǎng)24小時(shí)。由此取出菌體，將其按5重量％濕菌體的量^妄種于lml含有100MmTris-HCl(pH7.6)、50mMPHOG、100mMD-谷氨酸、100mMD-丙氨酸、1mM5'-磷酸吡。多酪，以及0.5(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，3(TC溫育16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后定量測(cè)定生成的PHG量。結(jié)果如表15所示，由PHOG可以生成(2R,4S)-PHG和(2R,4R)-PHG。63表15生成的PHG(mM)菌抹(2R,4R)(2R,4S)球形芽孢桿菌ATCC1020816.616.5塵埃芽孢桿菌AJ13272.82.6幼蟲類芽孢桿菌塵埃芽孢桿菌亞種ATCC135373.02.8浸麻芽孢桿菌AJ1617*7,17.0浸麻類芽孢桿菌ATCC82446.56.5遲緩芽孢桿菌AJ126994,64.6遲緩芽孢桿菌ATCC108404.24.3*FERMP—18653(4-5)表達(dá)球形芽孢桿菌來源的DAT(以下稱為BSDAT)的大腸桿菌的制備和用洗凈菌體反應(yīng)制備2R-PHGl.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了使球形芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因(以下簡(jiǎn)稱為"bsdat")在大腸桿菌中表達(dá)，按以下所述，構(gòu)建在pUC18的lac啟動(dòng)子下游連接bsdat基因的質(zhì)粒pUCBSDAT。首先，以球形芽孢桿菌ATCC10208抹的染色體DNA為模板，下述表16所示的寡核苦酸為引物，通過PCR擴(kuò)增該基因。由此擴(kuò)增得到相當(dāng)于歐洲專利公布0736604文本中，序列號(hào)2所述的bsdat堿基序列中的第8-第1278位堿基的DNA片段。該片段用BamHI、Pstl處理，并與pUC18的BamHI、Pstl的切斷物連接后，導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從氨千青霉素抗性;昧中選擇攜帶目的質(zhì)粒的菌抹，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pUCBSDAT。表16序列號(hào)155'一CCGGGATTCG丁TAATGCAAACG丁TAGCTG序列號(hào)165'-GGCGTGGAG丁TAGGCATTAATTGAAATTGG2.表達(dá)BSDAT的大腸桿菌的制備將攜帶pUCBSDAT的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體在含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1g/dlbacto胰酶解胨，0.5g/dl酵母提取物，1g/dlNaCl)中，37。C下進(jìn)行16小時(shí)的種子培養(yǎng)。取1ml該種子培養(yǎng)液加入裝有50mlLB培養(yǎng)基的500ml坂口氏燒瓶中，37。C下進(jìn)行正式培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后2.5小時(shí)，添加異丙基-l-硫代-p-D」比喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM,再培養(yǎng)4小時(shí)。由所得的培養(yǎng)液收集菌體、洗凈，制備成表達(dá)BSDAT的大腸桿菌。3.用表達(dá)BSDAT的大腸桿菌的洗凈菌體反應(yīng)將上述2制備的菌體按5重量％濕菌體的量接種于1ml含有100mMTris-HCl(pH7.6)、50mMPHOG、100mM氨基酸供體(D-Glu，D-Ala，L-Glu,L-Ala)、ImM5，--粦酸吡哆醛以及0.5(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，然后轉(zhuǎn)移至10ml的試管內(nèi)，在3(TC下振蕩反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后定量測(cè)定生成的PHG量。結(jié)果如表17所示，由PHOG可以生成(2R,4R)、(2R,4S)、以及(2S,4S)-PHG。表17通過用表達(dá)BSDAT的大腸桿菌洗凈菌體反應(yīng)生成的PHG(mM)添加的氨基酸供體生成的PHGD-GluD-AlaL-GluL-Ala(2R,4R)20.725.1N.D.15.4(2R,4S)17.517.022.77.0(2S,4S)痕量痕量22.7痕量(4-6)表達(dá)浸麻芽孢桿菌AJ1617來源DAT(以下稱為BMDAT)200910163551.9說明書第63/76頁的大腸桿菌的制備和用洗凈菌體反應(yīng)制備2R-莫納汀1.染色體DNA的制備用50ml的肉汁培養(yǎng)基在3CTC下將浸麻芽孢桿菌AJ1617抹培養(yǎng)一夜(預(yù)培養(yǎng))。取5ml該培養(yǎng)液作為種子菌，用50ml的肉汁培養(yǎng)基進(jìn)行正式培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期后，將50ml培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離操作(12000xg，4°C，15分4中)，收集菌體。用該菌體按常規(guī)方法制備染色體DNA。2.由基因文庫分離浸麻芽孢桿菌來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因(以下稱為bmdat)首先，在30)ig浸麻芽孢桿菌AJ1617抹的染色體DNA中加入1U限制性酶EcoRI，37。C下使其反應(yīng)3小時(shí)部分消化。然后由該DNA通過瓊脂糖凝膠電泳回收3-6kbp的片段。將此片段與1jug質(zhì)粒pUC118的EcoRI酶切產(chǎn)物(BAP處理后、寶酒造公司制備)連接，制成轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的基因文庫。將其在含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基(1%胰酶解胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，2%瓊脂，pH7.0)上涂板，形成菌落。將形成的菌落在含有氨節(jié)青霉素和異丁基-l-硫代-(3-D-p比喃半乳糖香(IPTG)0.1mM的LB液體培養(yǎng)基中，37。C下培養(yǎng)一夜，然后離心、收集菌體，即獲得菌體。將所得的菌體接種于含有100mMTris-HCl(pH8.0)、50mM丙酮酸鈉、100mMD-谷氨酸、lmM5'-磷酸吡哆醛、l%(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，30。C下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將5ju1由反應(yīng)液離心分離所得的上清加入含有200ial丙酮酸定量反應(yīng)液(100mMTris-HCl(pH7.6)，1.5mMNADH,5mMMgCl2,16U/ml乳酸脫氬酶(OrientalYeast公司制備))的96孔板中，3CTC下反應(yīng)IO分鐘后，用平板讀數(shù)器(SPECTRAMAX1卯，MolecularDevice公司制備)測(cè)定340nm的吸光度。加入終濃度為0.2mM-1mM的丙酮酸鈉進(jìn)行與上迷同樣的反應(yīng)，以此為標(biāo)準(zhǔn)，定量測(cè)定丙酮酸的減少量，檢測(cè)D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。通過DAT活性克隆的篩選，收集具有DAT活性的克隆。由此轉(zhuǎn)化體制備含有bmdat的質(zhì)粒，命名為pUCBMDAT。用EcoRI處理pUCBMDAT質(zhì)粒，然后進(jìn)4亍瓊脂糖凝月交電泳，估計(jì)插入片^殳的長(zhǎng)度為約3.3kbp。3.插入片段的堿基序列根據(jù)用雙脫氧法測(cè)定的質(zhì)粒pUCBMDAT插入片段的堿基序列，得到對(duì)應(yīng)于序列表的序列號(hào)17所示序列中第630-第1481位堿基的約850bp的讀碼框。該讀碼框與已知序列的同源性檢索表明，與球形芽孢桿菌ATCC1020S抹來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因在氨基酸序列上的同源性為91%,與芽孢桿菌屬種YM-1來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因在氨基酸序列上的同源性為66%，與地衣芽孢桿菌ATCC10716抹來源的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因在氨基酸序列上的同源性為42%。由此結(jié)果清楚表明，該讀碼框編碼D-氨基酸專爭(zhēng)氨酶基因。另外，這里所說的同源性是用基因分析軟件"genetyxver.6(GENETYX公司)"，按初始設(shè)定的各種參數(shù)計(jì)算的值。4.表達(dá)BMDAT的大腸桿菌的制備將攜帶pUCBMDAT的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體在含有0.1mg/ml氨千青霉素的LB培養(yǎng)基(1g/dlbacto胰酶解胨，0.5g/dl酵母提取物，1g/dlNaCl)中，在37。C下，進(jìn)行16小時(shí)的種子培養(yǎng)。取1ml該種子培養(yǎng)液加入裝有50mlLB培養(yǎng)基的500ml坂口氏燒瓶中，37。C下進(jìn)行正式培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后2.5小時(shí)，添加異丙基-l-硫代-P-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，再培養(yǎng)4小時(shí)。由所得的培養(yǎng)液收集菌體、洗凈，制備成表達(dá)BSDAT的大腸桿菌。5.用表達(dá)BSDAT的大腸桿菌的洗凈菌體反應(yīng)將上述4制備的菌體按5重量％濕菌體的量懸浮于1ml含有100mMTris-HCl(pH8.0)、50mMIHOG、200mMD-丙氨酸、1mM5'-磷酸吡,醛以及0.5(v/v)曱苯的反應(yīng)液中，然后轉(zhuǎn)移至10ml的試管內(nèi)，在33。C下振蕩反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后定量測(cè)定生成的2R-莫納汀的量。結(jié)果，可以產(chǎn)生22mM的2R-莫納汀。工業(yè)上應(yīng)用的可能性根據(jù)本發(fā)明，有關(guān)本發(fā)明的谷氨酸衍生物的制備方法能夠利用酶反應(yīng)，有效地制備包括有望用作甜味劑的莫納汀的上述特定的谷氨酸衍生物，所以在工業(yè)上非常有用。此外，有關(guān)本發(fā)明的莫納汀的制備方法，利用了有關(guān)本發(fā)明的谷氨酸衍生物的制備方法，能夠由氨基酸之一的色氨酸為出發(fā)原料，利67用酶反應(yīng)，有效地制備莫納汀，因此，在工業(yè)上，尤其是在食品領(lǐng)域非常有用。〈110〉味之素株式會(huì)社<120〉谷氨酸衍生物的制備方法<i30>PAMA-14278<140><141〉<150〉JP2001-396471<151〉2001-12-27<150〉JP2002-095760<151〉2002-03-29<160>18<170〉PatentlnVer.2.1<210〉1<211>1296<212>DNA〈213〉腐臭假單胞齒<220〉<221〉發(fā)明者杉山雅一；波部乙比占船越直；綱野裕古；河原滋；竹本正<220><221〉CDS<222>(456)..(1118)<223〉A(chǔ)LD1<220〉<221>CDS<222〉(444)..(1118)<223〉A(chǔ)LD2<400>1gtacaxcgtcctgactcagggcgcgctcggagaatgacgtcggggtcacgtacgatcaaactgtccggtgtcggcatcagctacctgcctgggtcgggctactagtcatcgaaaccgagctacaccgcgccgatcgtcttcagggcctcagctgtgattt.cagccgcatggtgtggtaaccacgggttgatctatgagcgctgtttgccc60gcaactacctgatcgcccagtgggcctgac120cgccaagtgtctctcgccattggtggacca180ctgcgctgcctcccatccaatacatcgccg240gcgtcgaggttgcacgtctggcagctcgtt300acaggcgctggatacg.agaaaaaaagcgat360gtattttcatagataaatatcgctaatagtgccaag'cgacctttcttactatgaacgcat420agcccacaagggttcagtcattcatggaggtcgetatgteattgcccggttea473MetGluValAlaMetSerLeuProGlySer1510cgcatetacccttctccgccccaggcaccacgcteactgctggacgcg521ArglieTyrProSerProProGinAlaProA廠gSerLeuLeuAspAla152025tttcagaacgtagtgacgccg'catateagtgataacetcgggcgtcac569PheGinAsnValVa]ThrProHislieSerAspAsnLeuGlyArgHis303540ateggtlieGlygeceggAlaArg45gggGlyctgLeuacgThrcgctatTyr50AsncacHisThrggcGlyLys55ctggtgLeuVal617ggcaccGlyThr60gecctgAlaLeuacgThrgtgVal卿Lys￡LCtThr65cgccccProggcGlyAspAsn70etcLeutacateTyrlie665tacaaagcactgacgctg'ategaacccggacacgtgctggtgategac713TyrLysAlaLeuThrLeulieGluProGlyHisValLeuVallieAsp75808590getcagAlaGinggtgscGlyAspAlaaccThr9533CAsngcgAlaVallieggtgagGlyGlu100ctgLeuatelieaagetcLysLeu105761teicgcgcagcaacgtggctgtgtcggcttcgtcgtcgacggcgecate809TyrAlaGinGinArgGlyCysValGlyPheValVal八spGlyAlalie110115120cgcgat八rgAspgtcgecValAla125agtSertttPhegaaGlugatAspacgThr130cctProtgct￡ltCysTyrgecAlacgtArg135agegtgSerVal857gtgestValHis140tgcggtCysGlycccProtacTyrassLys3gcSer145GlyProggggaaGlyGluatelie150犯tAsngtcccgValPro905gtgteaateggcgggatgateateaatccgggcgacateattgtcggt953ValSerlieGlyGlyMetlielieAsnProGlyAsplielieValGly155160165170gscg兆AspGlugstgggAspGlyctgLeu175gttgecttcVal/ViaPhetegSercccProgaccatgecAspHisAla180卿GluC3ggtgGinVal1851001ttggtcaaggcgcgagagcatgacgcgcatgaacagcaggtcaaagec1049LeuValLysAlaArgGluHisAspAlaHisGluGinGinValLysAla190195200gaaategecactggcg'ccGlulieAlaThrGlyAla2053tcg3tcsgteatggctggscsaagtgctglieAspGinSerTrpLeuAspLysValLeu2102151097gaaaaggetggcctggcgaacGluLysAlaGlyLeuAlaAsn220225tgaaaaacactgtgtaatcgccttgctgca1148gcgacattgctgtcggacag'gatgatxtgacgcttcagttaegegttettgggtgcaccg1208cgccacgtcaggaagtggctgctgccgcatgcaggtgacatgtcatgtaccatggcagca1268geaegtgacatgcacgatgtgetxaege1296<210〉2<2〗1〉225<212〉PRT<213〉腐臭假單胞菌<400〉2MetGlu1ProProThrLys65lieAsnCysGluLys145lieAlaHislieGinHisArg50ThrGluAlaValAsp130SerliePheAspAsp210ValAlaMetSer5AlaProArgSer20lieSerAspAsn35TyrAsnHisThrArgProGlyAsp70LeuProGlySerArglieTyrProSerPro1015LeuLeuAspAlaPheGinAsnValValThr2530LeuGlyArg.HislieGlyAlaArgGlyLeu4045GlyLysLeuValGlyThrAlaLeuThrVal5560AsnLeuTyrlieTyrLysAlaLeuThrLeu75AspAlaGin90LeuTyrAla105AlalieArgAspTyrlieLys80ProGlyHisValLeuVal85VallieGlyGluLeulie100GlyPheValValAspGly115120ThrProCysTyrAlaArgSerValValHis135GlyProGlyGlulieAsnGlyAspAlaThr95GinGinArgGly110ValAlaSerPhe125CysGlyProTyr140ValProValSerlieGlyGlyMet150AsnProGlyAsplie165SerProAspHisAla180AlaHisGluGinGin195GinSerTrpLeuAsp155lieValGlyAspGlu170GluGinValLeuVal185ValLysAlaGlulie200LysValLeuGluLys160AspGlyLeuVal175LysAlaArgGlu190AlaThrGlyAla205AlaGlyLeuAla21522071Asn225<210>3<211〉221<212〉PRT<213〉腐臭假單胞菌<400〉3MetSer1ArgSerAspAsnHisThr50GlyAsp65HisValGlyGluValVa].CysTyr130GlyGlu145GlyAspAspHisGluGinTrpLeu210LeuProGlySer5LeuLeuAspAla20LeuGlyArgHis35GlyLysLeuValAsnLeuTyrlieArglieTyrProSerProProGinAla10PheGinAsnValValThrProHislie2530lieGlyAlaArgGlyUuThrArgTyr4045GlyThrAlaLeuThrValLysThrArg5560TyrLysAlaLeuThrLeulieGluPro7075LeuVallieAspAlaGinGlyAspAlaThrAsnAlaVal8590LeulieLysLeuTyrAlaGinGin.ArgGlyCysValGly100105110AspGlyAlalieArgAspValAlaSerPheGluAspThr115120125AlaArgSerValValHisCysGlyProTyrLysSerGly135140lieAsnVal.ProValSerlieGlyGlyMetlielieAsn155GluAspGlyLeuVal170ValLysAlaArgGlu185lieAlaThrGlyAla200LysAlaGlyLeuAla150lielieValGlyAsp165AlaGluGinValLeu180GinValLysAlaGlu195AspLysValLeuGluPro15SerAsnProGly80lie95PheProProPro160Pro175HisAspAlaHis190lieAspGinSer205AsnAlaPheSer215220<210〉4<211〉20<212〉PRT<213〉腐臭假單胞菌<400〉4SerLeuLeuAspAlaPheGinAsnValValThrProHislieSerAsp151015AsnLeuGlyArg20<210>5<211〉12<212>PRT<213〉腐臭假單胞菌<400>5AlaGlulieAlaThrGlyAlaLeuAspGinSerTrp1510<210>6<211〉22<212〉腿〈213〉人工序列<220〉<223>人工序列混合引物l的描述<400>6ttycaraaygtsgtsacsccsc22<210〉7<211>29<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉人工序列混合引物2的描述<■>7tgrtcratngcnccsgtngcratytcngc29<210〉8<211〉31<212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列ALD-5'Bam的描述<400〉8gccggatccacaagggttcag.tcattcatgg31<210〉9<211>28<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列ALD-5'Hind的描述<■〉9ccgaagctttcagttcgccaggccagcc<210>10<211>40<212>DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列混合引物的描述<400>10gtatcacgaggccctagctgtggtgtcatggtcggtgatc40<210>11<211〉40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列混合引物的描述<210〉12<211〉38<212〉腿<213>人工序列<220〉<223>人工序列混合引物的描述<400>12ggggggggcatatgcgacctccttattacgtgaacttg38<210〉13<211〉30<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉人工序列ALD-5'Ndel的描述<400>ttcgg.11'ggattccatatgataccctttttacgtgaacttgc74ggttcagtcacatatggaggtcgctatgtc30〈210〉14<211〉33<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列ALD-5'Nde2的描述<400〉14atggaggtccattagtcattgcccggttcacgc33<210>15<211〉29<212〉腿<213〉人工序列<220〉〈223>人工序列BMDAT1的描述<400〉15ccgggattcgttaatccaaacgttagctg29<210.〉16<211〉30<212〉廳<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列BMDAT2的描述<400>16ggcctgcagttaggcattaattgaaattgg30<210〉17<211〉1709<212>DNA<213〉浸麻芽孢桿菌<220〉<221〉CDS<222〉(630)..(1481)<棚〉17tacatcaggtagcgccatg'catgacagaaaggga1xatgagcgttatctgctgcgtttac60aacagagtgacgactgagtcagagcaattgtcgactttatcgcagaggtttttatcagga120tcattatgccatcagcttgagttgcaattcgaggatgccatgtctggtcagacaacatta180aatccaggcattgttagctatgatgtcagtaaaggtggcagtttagtgattagtatgcgc240tattctgtgtcctatccattcgatgaaaaattacggaggctcaacgtttagttgtaaaaa300gaggattttcattagatattcaagacgactccaag'ccccattatgtcagtgaagatgatc360catttatccaaacattagcggctatttatagacgtcaatcaggagatacagaaacaccgt420tattatctacaggtggtggaacgtatgcacgtgtgctgaaaaaaggcgtggcctttggca480tgctattccctggggagcaggatgtggcgcatcgggcggatgagtttgtagtgattgaaa540atcttgtaaaagcagcggctatttatgcggaagcaattgttgagcttgcgggaaaaaaat600aax3taa^g3cgaaaBgg3t:g'aacgg肌aatggcatatteattatggaatgat653MetAlaTyr'SerLeuTrpAsnAsp15caaattgttgaagaaggatctattgcaateteaccagaagacagaggtGinlieValGluGluGlySerlieAlalieSerProGluAspArgGly101520701tatcagTyrGin25tttggtPheGlygacAspggtattGlylie30TyrGlugtaatl:aaaVallieLys35g'ttValta_tTyrAsngg已Gly74940aatatgAsnMettttacaPhe丁hrAlaGingagGlu45C3CHislie柳cgtAspArg50ttcPhetatTyrAlaageSergecAla55797g犯fLa^GluLysattcgclieArg60cttLeugttValateliecctProtatTyrThrLys65g已tAspgttValttaLeuC3CHis70a兆Lys845ttaetaLeuLeucatgagHisGlu75etaLeulieGlu卿Lys肌tAsn80aatetaAsnLeugaaGluThrGly85catHisVal893tattttTyrPhe90caaateGinlieactThrcgtArggggGlygetAla95aatAsnteacgtSerArgaatAsncaxHis100gttValttcPheccgPro941gatgcaAspAla105agtattSerliecctProgetAla110gtattaValLeuactThrggaaatGlyAsngtaaaaValLys115gcgAlaggtGlygaaGlu989120cgtgcatatgaaaactttgaaa肌ggtgtt3犯gecsettttgttArgAlaTyrGluAsnPheGluLysGlyValLysAlaThrPheVal76gagGlu1037125130135gatattAspliecgttggttgArgTrpLeu140cgtArgCysgacattaaaAsplieLys145tctSerLeuaacttgcttAsnLeuLeu150ggtGly1085gcagtaAl已Valttagcaa已a(bǔ)LeuAlaLys155caaGing肌GlugetgcgAlaAla160gagGluLysGlytgttatCysTyr165GluAla1133sixttalie匕eu170catcg'cggaHisArgGlygatAspateliegtgVal175Thrg犯GluCysSerteaSer80getAlaaatgttVal1181tacggaTyrGly]85attaaagatlieLysAspGly190d肌LyscttLeutatTyraxelThrcatHisccaPro195getAlaAsn肌tAsnttcPhe1229200atettaaatggtattacacgtcaagtcattttaaaatgtgcggaagaalieLeuAsnGlylieThrArgGinVallieLeuLysCysAlaGluGlu2052102151277at.tlieAsnttaccagtaLeuProV已l220ateliegaaGlug叫GluccaProatgMet2253CgThraaaLysgetAlagatAspLeu230etaLeu1325acaatgThrMetga^tstcAspGlulie235liegtgValtegSertctSer240gtatctSertctSerg3gGlugttacgValThr245CC3Pro1373gtcattVallie250gatgtggscAspValAspggcGlyAsncaaa11Ginlie255gggGlygetAlagg'aGlygttcccggtValProGly260gaaGlu1421tggactTrpThr265cgtcaattaArgGinLeucagGin270caateatttgaagcgaaattaccacttteaGinSerPheGluAlaLysLeuProLeuSer2751469280atgaataccaaataaaagaaccttgtagagaactatctgtatggatagttctMetAsnThrLys1521ctttatttatgggtgtaatgttgggtctcgtcatgtaaaataaaaaggatagtagaataa1581tcttacagattgaaatttgtagagcaatgtcgatgtsatgaatacataagaatgeataga1641ctctttttaxaaaggggatcgagaaaaaagagaactaaagagatggtaagtaagaatgga1701gtgacctt1709<210〉18<211〉284〈212〉PRT<213>浸麻芽孢桿菌<400〉18MetAlaTyrSerLeuTrp15AsnAspGinlieValGluGluGlySerlie1015AlalieSerProGluAspArgGlyTyrGinPheGlyAspGlylieTyr202530GluVallieLysValTyrAsnGlyAsnMetPheThrAlaGinGluHis354045工leAspArgPheTyrAlaSerAlaGluLyslieArgLeuValliePro505560TyrThrLysAspValLeuHisLysLeuLeuHisGluLeulieGluLys657075AsnAsnLeuGluThrGlyHisValTyrPheGinlieThrArgGlyAla80859095AsnSerArgAsnHisValPheProAspAlaSerlieProAlaValLeu100105110ThrGlyAsnValLysAlaGlyGluArgAlaTyrGluAsnPheGluLys115120125GlyValLysAlaThrPheValGluAsplieArgTrpLeuArgCysAsp130135140lieLysSerLeuAsnLeuLeuGlyAlaValLeuAlaLysGinGluAla145150155160AlaGluLysGlyCysTyrGluAlalieLeuHisArgGlyAsplieVal165170175ThrGluCysSerSerAlaAsnValTyrGlylieLysAspGlyLysLeu180185190-TyrThrHisProAlaAsnAsnPhelieLeuAsnGlylieThrArgGin195200205VallieLeuL,ysCysAlaGluGlulieAsnLeuProVallieGluGlu210215220ProMetThrLysAlaAspLeuLeuThrMetAspGlulielieValSer225230235240SerValSerSerGluValThrProVallieAspValAspGlyAsnGin245250255lieGlyAlaGlyValProGlyGluTrpThrArgGinLeuGinGinSer260265270PheGluAlaLysLeuProLeuSerMetAsnThrLys275280權(quán)利要求1.生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸的方法，所述方法至少包括下述步驟(1)和(2)(1)在催化將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸的酶存在下，使色氨酸反應(yīng)，產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸的步驟；和(2)在酸性條件下，對(duì)所得溶液進(jìn)行脫氣處理或脫氧處理的步驟。2.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至2或以下提供所述酸性條件。3.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸的方法，其中所述脫氣處理或脫氧處理是用惰性氣體置^類所述反應(yīng)液中所含氣體的全部或一部分的方法。4.權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)吲"朱-3-丙酮酸的方法，其中所述惰性氣體選自氮、氬和氦。5.權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸的方法，其中所述pH調(diào)節(jié)是在所述反應(yīng)液中添加酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中所述酸選自硫酸、鹽酸、硝酸和4,酸。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸的方法，其中所述酶衍生自具有氨基酸氧化酶活性和過氧化氫酶活性的微生物。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸的方法，其中所述酶衍生自選自土壤桿菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬、假單胞菌屬、鏈孢霉屬的微生物。8.權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)吲。呆-3-丙酮酸的方法，其中所述酶衍生自土壤桿菌屬、變形菌屬和摩根氏菌屬中的任何一種。9.生產(chǎn)4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，所述方法至少包括下述步驟(A)和(B):(A)在催化將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸的酶存在下，使色氨酸反應(yīng)，產(chǎn)生吲味-3-丙酮酸的步驟；和(2)由吲哚-3-丙酮酸和草酰乙酸或丙酮酸產(chǎn)生4-(巧j哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的步驟。10.權(quán)利要求9的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中步驟(A)還包括在酸性條件下，對(duì)所得溶液進(jìn)行脫氣處理或脫氧處理的步驟。11.權(quán)利要求9的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中通過將pH調(diào)節(jié)至2或以下提供所述酸性條件。12.權(quán)利要求10的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述脫氣處理或fL氧處理是用惰性氣體置換所述反應(yīng)液中所含氣體的全部或一部分的方法。13.權(quán)利要求12的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述惰性氣體選自氮、氬和氦。14.權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述酶衍生自具有氨基酸氧化酶活性和過氧化氬酶活性的微生物。15.權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述酶衍生自選自土壤桿菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬、假單胞菌屬、鏈孢霉屬的微生物。16.權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基曱基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述酶衍生自土壤桿菌屬、變形菌屬和摩根氏菌屬中的任何一種。17.權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)的生產(chǎn)4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述步驟(B)在對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下進(jìn)行。18.權(quán)利要求9-17中任一項(xiàng)的生產(chǎn)4-(。引咮-3-基甲基)-4-羥基-2-氧代戊二酸的方法，其中所述步驟(B)用化學(xué)合成法進(jìn)行。全文摘要有效地制備可望用作甜味劑成分如莫納汀等谷氨酸衍生物(包括其鹽的形式)的方法，該方法包括在對(duì)由通式(1)的取代α-酮酸生成通式(2)；所示的谷氨酸衍生物的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶存在下，進(jìn)行該反應(yīng)。文檔編號(hào)C12P17/10GK101671707SQ20091016355公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2002年12月9日優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日發(fā)明者杉山雅一,河原滋,渡部乙比吉,竹本正,網(wǎng)野裕右,船越直申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社