專利名稱：：一個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟和品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法一個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟和品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用[
技術(shù)領(lǐng)域：
]本發(fā)明涉及香蕉谷氨酸脫羧酶基因(glutamatedecarboxylasegene,Ma(L4Z^)序列的獲得、表達(dá)分析和體外調(diào)控基因表達(dá)調(diào)節(jié)香蕉果實(shí)成熟和品質(zhì)。谷氨酸脫羧酶(Glutamatedecarboxylase,GAD)廣泛存在于原核和真核生物中，是一個(gè)胞內(nèi)酶，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，與磷酸吡哆醛輔因子結(jié)合催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA和C02。在植物中GAD的C末端具有一個(gè)特殊的與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合的區(qū)域，能夠與CaM結(jié)合增加酶活力(Chenetal.1994)。植物在應(yīng)對(duì)許多不同的刺激時(shí)，比如，機(jī)械損傷、冷刺激、熱刺激、組織缺氧、植物激素刺激等，GAD被細(xì)胞內(nèi)的H+或Ca^水平的增加而激活，GABA會(huì)大量積累。GABA積累在PH調(diào)控、N儲(chǔ)存、植物發(fā)育、果實(shí)成熟、植物防御等生理過(guò)程中起著重要作用(Bownetal.1997;Gallegoetal.1995)。GAD基因已經(jīng)在擬南芥、矮牽牛、水稻、番茄、煙草等植物中被克隆，結(jié)果表明該基因可能是多基因家族編碼的，并且普遍存在于植物各組織中，其表達(dá)變化在植物發(fā)育、外界刺激及果實(shí)成熟等不同的生理過(guò)程中呈現(xiàn)出表達(dá)差異。GAD基因的表達(dá)與果實(shí)成熟及乙烯生物合成也有關(guān)系，Kathiresan等(Kathiresan1997)研究了向日葵中GAD與乙烯產(chǎn)生的關(guān)系，外源GABA處理向日葵子葉12小時(shí)，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生率增加了14倍。其調(diào)控過(guò)程是，外源GABA促進(jìn)了內(nèi)源GABA的合成，從而促進(jìn)了ACC合成酶mRNA和ACC含量的積累，以及ACC氧化酶mRNA和體外ACC氧化酶活力的增加，并證明了GABA并不是乙烯生物合成的前體，即GABA可能并不是通過(guò)代謝途徑參與乙烯生物合成。推測(cè)外源GABA促進(jìn)內(nèi)源GABA合成的可能過(guò)程是GABA首先促進(jìn)了GAD基因的表達(dá)，增加了GAD酶活性，從而促進(jìn)了內(nèi)源GABA的合成。GABA促進(jìn)乙烯生物合成主要是通過(guò)誘導(dǎo)ACC合成酶轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)。Gallego等(Gallegoetal.1995)從番茄果實(shí)cDNA文庫(kù)中獲得一個(gè)GADcDNA全長(zhǎng)，組織特異性表達(dá)分析表明，該基因在根、莖、葉等組織中表達(dá)量非常低，在果實(shí)中表達(dá)量較高。果實(shí)釆后成熟不同階段表達(dá)分析表明該基因在正常成熟和rin突變3體中表達(dá)量都在采后果實(shí)第一次發(fā)生顏色變化時(shí)最高；正常成熟果實(shí)中該基因在表達(dá)量達(dá)到峰值后立即下降，而rin突變體中該基因表達(dá)一直維持在較高水平。我們(Jinetal.2008)利用cDNA微陣列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成啟動(dòng)時(shí)(采后10d)基因的差異表達(dá)，表明香蕉谷氨酸脫羧酶基因明顯上調(diào)表達(dá)，是16個(gè)上調(diào)表達(dá)基因中表達(dá)量最大的一個(gè)?？偨Y(jié)上述研究結(jié)果在乙烯生物合成及果實(shí)成熟過(guò)程中，GAD催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，GABA可能通過(guò)代謝途徑參與有機(jī)酸的降解，PH調(diào)控，N的代謝從而導(dǎo)致成熟相關(guān)的生理變化；GABA也可能作為信號(hào)分子調(diào)控果實(shí)成熟過(guò)程中乙烯生物合成。因此，GAD基因的開(kāi)發(fā)利用，將有助于更加深入了解香蕉果實(shí)采后成熟機(jī)理，建立更加安全廉價(jià)的果實(shí)采后保鮮新方法。為了深入研究香蕉果實(shí)采后成熟機(jī)理，建立安全廉價(jià)有效果實(shí)保鮮新技術(shù)，提高果實(shí)的商品價(jià)值，分離與果實(shí)成熟相關(guān)基因并鑒定它們的功能十分必要，通過(guò)對(duì)這類基因功能研究及調(diào)控，將對(duì)提高果實(shí)采后品質(zhì)，培育耐儲(chǔ)藏新品種具有重要意義。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為構(gòu)建香蕉果實(shí)采后O天、2天抑制縮減文庫(kù)，獲得一個(gè)與GAD基因同源性較高的差異表達(dá)谷氨酸脫羧酶同源的cDNA序列，RACE技術(shù)擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)序列(#sW/y)。熒光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯誘導(dǎo)成熟和1-MCP(l-methylcyclopropene)抑制成熟的條件下，ifeW"7在香蕉果實(shí)采后不同成熟階段的表達(dá)情況。通過(guò)體外誘導(dǎo)、抑制ifeWZV的表達(dá)，研究果實(shí)成熟特性及品質(zhì)。1.香蕉果實(shí)采后2天抑制差減文庫(kù)構(gòu)建及分析采用熱硼酸法法提取香蕉采后0天和2天果實(shí)總RNA，電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，質(zhì)量檢測(cè)完蓽后貯于-76。C備用。按照Clontech公司的PCR-SelectTMcDNASubstractionKit,Advantage2PCRKit產(chǎn)品使用說(shuō)明進(jìn)行縮減雜交。抑制縮減雜交產(chǎn)物經(jīng)與pGEM-TEasyVecter連接，轉(zhuǎn)化E.co"DH5a,構(gòu)建抑制差減文庫(kù)。獲得文庫(kù)獨(dú)立克隆測(cè)序、分析。2.香蕉谷氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列克隆根據(jù)SSH獲得的基因片段和NCBI的比對(duì)結(jié)果可知，該基因片段3'端已經(jīng)含有TAA終止密碼子。用PrimerPremier5設(shè)計(jì)一條5'-RACE引物，以本研究室構(gòu)建的香蕉果實(shí)cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增5'端序列。將擴(kuò)增序列與已有的3'端序列拼接獲得基因的全長(zhǎng)序列。3.熒光定量研究MaGADl與果實(shí)采后成熟的關(guān)系-采后香蕉果實(shí)分設(shè)乙烯處理、l-MCP處理和正常成熟3組，提取3組中不同成熟階段的果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，熒光定量研究3中不同處理?xiàng)l件下Ma04ZW表達(dá)與成熟的關(guān)系。4.MaGADl誘導(dǎo)劑Y-氨基丁酸(GABA)和抑制劑氨氧乙酸(AOAA)處理果實(shí)，研究體外調(diào)控基因表達(dá)對(duì)果實(shí)成熟和品質(zhì)的影響將采后的香蕉果實(shí)按照一定濃度用Y-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)分別處理，觀察處理果實(shí)成熟變化，測(cè)定果實(shí)成熟相關(guān)的生理指標(biāo)，分析通過(guò)采后體外調(diào)控Ma04/W的表達(dá)對(duì)果實(shí)成熟和品質(zhì)的影響。1.成功構(gòu)建香蕉果實(shí)采后0天和2天的抑制縮減文庫(kù)用差減PCR產(chǎn)物，以T/A克隆法構(gòu)建質(zhì)粒載體文庫(kù)，差減文庫(kù)包括312個(gè)白色克隆，克隆飽滿清晰。應(yīng)用PCR方法對(duì)差減文庫(kù)的312個(gè)克隆進(jìn)行篩選，獲得302個(gè)重組子，插入片段集中在300bp-50(Jbp之間，符合抑制縮減文庫(kù)的要求。2.成功克隆香蕉谷氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列對(duì)獲得的抑制縮減文庫(kù)中302個(gè)重組測(cè)序分析，有2個(gè)與其他生物子谷氨酸脫羧酶基因具有較高同源性，進(jìn)一步分析顯示這兩個(gè)香蕉谷氮酸脫羧酶基因片段屬于同一個(gè)基因。根據(jù)獲得的香蕉谷氨酸脫羧酶基因片段設(shè)計(jì)5'端PCR引物，克隆5'端序列，與原有序列拼接后利用生物信息學(xué)軟件分析，具有完整的閱讀框架，為一個(gè)完整基因命名為Mfl04i^，包含一個(gè)1500bp的完整開(kāi)放閱讀框(序列l(wèi))，編碼499個(gè)氨基酸殘基的多肽(序列2)。與水稻(NM—001068533)、大麥(AK248209)、擬南芥(NM—121739)和玉米(AY103733)有較高的一致性，分別為82%、80%、80%、78%。GenBank查找未見(jiàn)報(bào)道。3.M"04a/在香蕉果實(shí)采后被乙烯誘導(dǎo)表達(dá)，并可調(diào)節(jié)成熟乙烯生物合成在正常成熟和乙烯誘導(dǎo)成熟的條件下，Ma04Z)7在成熟乙烯生物合成啟動(dòng)時(shí)被顯著誘導(dǎo)，其表達(dá)量快速達(dá)到最大值，并誘導(dǎo)了隨后乙烯的大量增加使其達(dá)到峰值；在l-MCP抑制成熟條件下，內(nèi)源乙烯的釋放量和MaGXZ)/的相對(duì)表達(dá)量在香蕉采后儲(chǔ)藏時(shí)期一直維持在較低的水平(圖1)。所以，MflG^Di的表達(dá)既受乙烯誘導(dǎo)又促進(jìn)乙烯的生物合成，與香蕉果實(shí)采后乙烯生物合成及果實(shí)成熟密切相關(guān)。4.M"Oi07誘導(dǎo)劑和抑制劑顯著促進(jìn)和抑制該基因的表達(dá)，進(jìn)而影響果實(shí)的成熟過(guò)程和品質(zhì)研究結(jié)果證明，GABA和AOAA分別能誘導(dǎo)和抑制香蕉果實(shí)成熟，通過(guò)生理學(xué)分析顯示這種影響改變了果實(shí)顏色、硬度、芳香物質(zhì)、可溶性總糖和淀粉含5量等。證實(shí)對(duì)Ma04D7表達(dá)的調(diào)控可以調(diào)節(jié)果實(shí)品質(zhì)(圖2、圖3)。進(jìn)一步研究顯示，Ma04Z)7調(diào)控果實(shí)成熟是通過(guò)調(diào)控Ma4GW基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而Ma^CW是香蕉果實(shí)采后成熟過(guò)程中啟動(dòng)成熟乙烯生物合成的關(guān)鍵酶基因。因此，我們推測(cè)香蕉MaGXD7是香蕉果實(shí)采后成熟過(guò)程中成熟乙烯生物合成的上游調(diào)節(jié)者，它通過(guò)調(diào)控Ma4GS7的表達(dá)控制果實(shí)的成熟過(guò)程和品質(zhì)形成。圖1:1-MCP處理和乙烯處理?xiàng)l件下，利用熒光定量PCR分析MaGADl在香蕉釆后不同時(shí)期的表達(dá)。圖2:GABA和A0AA處理對(duì)香蕉果實(shí)采后成熟的影響圖3:GABA和AOAA處理對(duì)采后香蕉果實(shí)硬度、淀粉、可溶性總糖的影響。[具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明1、材料來(lái)源巴西香蕉(MJ^4Graw;Cavendish)果實(shí)，釆自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地。2、方法(1)香威果實(shí)采后2天抑制差減文庫(kù)構(gòu)建及分析參照Ching-YiWan和TheaA.Wilkins(1994)的熱硼酸法提取香蕉果實(shí)RNA。按照PCR-SelectcDNASubstractionKit,Advantage2PCRKit產(chǎn)品使用說(shuō)明進(jìn)行0天和2天果實(shí)RNA抑制縮減雜交。抑制縮減雜交產(chǎn)物經(jīng)與pGEM-TEasyVecter連接，轉(zhuǎn)化E.co7i'DH5a。采用PCR的方法對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，PCR鑒定采用試劑盒提供的引物NestedPCR引物1:5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，NestedPCR引物2R:5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，以待測(cè)質(zhì)粒為模板，在Biometra型PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94。C變性5.0分鐘；94。C45秒，68°C1.0分鐘，72°Cl.O分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72。C延伸7.0分鐘。然后取5.(HUPCR反應(yīng)液進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，5v/cm恒壓條件下電泳30分鐘后，于紫外燈下觀察重組子插入片段大小。將插入有目的片段的重組子測(cè)序、分析。(2)香蕉谷氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列克隆根據(jù)SSH獲得的基因片段和NCBI的比對(duì)結(jié)果可知，該基因片段3，端已經(jīng)已含有TAA終止密碼子。用PrimerPremier5設(shè)計(jì)一條5'-RACE引物5，-TATGCGAACCCGAAACTCCCAAAG-3，，交由上海生物工程有限公司合成。以我研究室構(gòu)建的香蕉果實(shí)cDNA文庫(kù)為模板，PCR另一個(gè)引物為cDNA文庫(kù)的接頭引物ptr5，5'-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3，；。在0.2mL離心管中依次加入eDNA文庫(kù)庫(kù)液l.OpL10XBuffer(含2.5mMMg2+)2.5pLdNTP(dA/G/C/TTP:10mMeach)0單ptr5，(10pM)l單BR1695'-RACE(10pM)l單Taq聚合酶(5u/pL)0.3^LddH20_18舉總體積25.0pL以下列PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng):<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果擴(kuò)增到一段1042bp,含有ATG起始密碼子。根據(jù)抑制縮減文庫(kù)中序列及5'-RACE所獲得的序列序列拼接后設(shè)計(jì)2條引物從香蕉果實(shí)cDNA文庫(kù)中克隆該基因cDNA全長(zhǎng)。PCR及測(cè)序結(jié)果顯示，該基因cDNAORF為1500bp。(3)熒光定量研究Mfl04Z)7與果實(shí)采后成熟的關(guān)系提取乙烯處理、1-MCP處理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA用作熒光定量PCR的模板。用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域分析軟件分析AfoOiW、M-""/W2個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)，確保所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增片段位于非保守區(qū);然后根據(jù)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)原則，用primerpremier5設(shè)計(jì)弓l物。MaGAD1上游引物5，-GTCGTCCCCAAGAAGAGCGTCAA-3，；MaGADl下游引物5，-ATCGCCAAACCATAACTAAACCACA-3，。Ma-actinl上游引物5'-CGAGGCTCAATCAAAGA濕3'Ma-actin1下游引物5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3'在Stratagene的Mx3000P儀器上進(jìn)行熒光定量PCR。在0.2mL的PCR反應(yīng)管中加入SYBRPremixExTaq(2X)(TAKARA)12.5pL、RoxreferenceDyeII(50X)(TAKARA)0.5pL、5pM的一對(duì)引物各0.75|uL，cDNA樣品lpL，然后用水補(bǔ)足至25pL。每個(gè)樣品既要用于擴(kuò)增目的基因又要擴(kuò)增內(nèi)參基因Ma-actinl，各個(gè)基因的擴(kuò)增都做三個(gè)重復(fù)。按照94"C預(yù)變性3min，94。C變性7s，55。C退火15s,72。C延伸20s，共40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增(四個(gè)基因的反應(yīng)程序是一致的)，并于每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后做94'C一55t:的融解曲線分析。熒光定量PCR結(jié)果證明，MaGADl表達(dá)受乙烯誘導(dǎo)、1-MCP抑制，在香蕉果實(shí)采后成熟過(guò)程中起著調(diào)控乙烯生物合成、果實(shí)成熟的作用。(4)Ma04/)/誘導(dǎo)劑GABA和抑制劑AOAA處理果實(shí)對(duì)成熟期和品質(zhì)的影響將采收的果實(shí)切割成單蕉指，用0.1%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒10min，同時(shí)把果實(shí)頂部的干花抹掉，放置一個(gè)晚上晾干，隨機(jī)選取成熟度較為一致的香蕉果實(shí)分成3個(gè)處理正常成熟、GABA處理、AOAA處理。每個(gè)處理選取30—40個(gè)果實(shí)，每3個(gè)果實(shí)裝進(jìn)一^保鮮盒中。正常成熟的果實(shí)置于22t:恒溫條件下成熟。觀察^同處理對(duì)香蕉果實(shí)采后成熟時(shí)期的影響，測(cè)定不同處理?xiàng)l件下香蕉果實(shí)硬度、可溶性總糖。果實(shí)淀粉含量。結(jié)果顯示GABA處理明顯能縮短達(dá)到每個(gè)成熟度的時(shí)間，促進(jìn)成熟；AOAA處理明顯能延長(zhǎng)達(dá)到每個(gè)成熟度的時(shí)間，延緩成熟。并通過(guò)調(diào)控采后香蕉果實(shí)成熟度、硬度、可溶性總糖和淀粉含量等生理變化調(diào)控果實(shí)成熟過(guò)程。SEQUENCELISTING<110>中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站金，志強(qiáng)徐，碧玉胡，偉劉，菊華張，建斌賈，彩紅ii,光蘭<120>—個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟和品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1500<212>DNA<213>香蕉(Musaacuminata)<220><221>'gene<222>(1)..(1500)<400>1atgactctctcggcggtagcatcggatgccgatgattcggtcgcttatacattcgcttcg60cgatscgttcgcgaggctcttccccggttcaggatsccggagcsgtcgstcccc33gg3t120gcggcgtaccagstcstcsscgacgsgctgatgctcgscggg33cccgcggttgaatctg180gcgtcgttcgtgscgscgtggstggsgccgaacaagaactacgtcgacatggacgagtacgt333t3tgstsgcccsccttttcsstgccgttggaaotgtgggttcctcagaagcaatctggcsgsac333己g333ggcsgsggsgasggcasiatgttcaggtttgctgggagaaatttgtgasgttgsa3g3gggat3ttatgtaatggsgastacgatstgtgttgctgccatcttggttaagcttctaaatgatctcctgacagaaatacatgtcgatgctgcaagtgggggattttgggacttfccggctccctcaggtgaagagcgtttatgctggagtsggttgggttgtctggattttccatattaattatcttggtgcagatggatctagtc3g3tc3ttgc3C3gtsct3cagaaat3tcstggsassctgtatgg3c3atacsgsgscattcgacattgtgtccaaggat33gg3csgcggc3￡LgteiC￡icggtcttcgscatcgttcdbgcgtaLC3ccatgcctgccgacatcagggaggacttcagtcggagtctggcgttg3cagacttggasaaccggtggacgasagagaacccggacggcggcggcgccgtcgtcgagatcgccagatactggaagcgattggtggsgtgcgstcgcctcatcatggcggccgtc240cccgtcaccsccgaLgctccsgsatcgctgc300ccaattggggaagacgaaacggctgttggs3603tgcttgc3ggacttgcsttc33g3gg333420ccttacgsc333cccssc3ttgttaccggt480gcaaggtattttgaagttgaactgasagaa540gatcctgccaaggcagtsgaaatggttgat600ggttc33ctctc3ctgg3g3gtttgssgst660aai333cc3agaaeictgggtgggaicacaccc720atagcgcctttcctctatcctgaactagag780ataaatgtcagcggccscasatatggcttg8403gg3ac333g3ggsttt3cctgaisgsgctt900caacctaccttcactctcaacttttctaaa960cagtttatacgcttgggctttgagggtttc1020gcc33ggtgttgssggcgggC3tcgsgggg1080gtgggtgtgccgctcgtggcattctcactc1140gtatcggagaccttgaggaggttcggatgg1200gcsgagcstgttgcggtgctccgcgtggtg1260gagcgcctcgtgacggacatcaagaaggtg1320gccacc3tg3tcscccaitgtcaaagccgag1380ccc3agaag3gcgtC33gcagacgcacgag1440gatcgtaiagssgaiccsgcggcgtttgctga150010<210>2<211>499<212>PRT<213>香蕉(Musaacuminata)<220><221>PRT<222>一l)..(499)<400>2MetThrLeuThrPheAlsProGluGin35GluLeuMet50ThrThrTrp65AsnLysAsnGinAsnArgGlyGluAsp115MalieMet130ArgLysAla145AlaAsnValGluLeuLysAlaLysAla一-195lieLeuGly210AsnAspLeu225lieHisValSerSer20SerL<euMetTyrCys100GluLeuGluGinAla5ArglieAspGluVal85ValThrAlaGluValTyrProGlyPro70AspAsnAlaGlyLys150ValCys165GluValLys180ValGluMetSerThrLeuAlaValLysAsn55GluMetMetValLeu135ProTrpLeuValThr215LysLeuThrGlu230AspAlaAlaSerSerArgAsp40ProCysAsplieGly120AlaTyrGluLysAsp200GlyAsnGlyAspGlu25AlaArgAspGluAla105ValPheAspLysGlu185GluGluGinGlyMa10AlaAla!LeuArgTyr90HisGlyL>ysLysPhe170GlyAsnPheGluPheAspLeuTyrAsnLeu75ProLeuThrArgAspProGin!Leu60lieValPheValLys140ProAsn155AlaArgTyrTyrThr工leSerArglie45AlaMetThrAsnGly125TrplieTyrValCys205ValGluAsp220ThrGlyTrp235lieAlaProValPhe30lieSerAlaThrAla110SerGinValPheMet190ValEysAspPheAla15ArgAsnPheAlaGlu95ProSerAsnThrTyrlieAspValVal80LeulieGluLysGly160GluVal175AspProAlaAlaLeuLeuThrPro240LeuTyrProGluLeuValSerGly275ValTrpArg290AsnTyrLeu305GlySerSerPheGluGlyValLeviLys355LysAspVal370LysTyrThr385lieValProLeuArgValLeuValThr435ThrLysAla450GlyGly>Gly465GlulieAlaGlyValCys245GluTrpAspPhe260HisLysTyrGlyAsnLysGluAsp295GlyAlaAspGin310GinlielieAla325PheArgAsnlie340AlaGlylieGluGlyValProValPheAsp390ThrArgLeu265LeuVal280LeuProProThrGinTyr250ProTyrGluPheTyr330AsnMetGlu345GlyThrGlu360LeuValAlaPhe375ValSerGluThrAlaTyr405Vallie420AsplieArgLysThrMetlieAlaValVal470ArgTyrTrp485MetProAlaGluAspPhe425LysValLeu440ThrHisVal455ProEysLysLysArgLeuAsp410SerThrLysSecVal490GinValLysAlaGluThr315GinCysThrSerLeu395AlaGlyVal285Leulie300LeuAsnPhelieMetAspPheAsp365LeuLys380Arg.ArgGluHisSerLeu255SerlieAsn270GlyTrpValPheHis工lePheSerLys320ArgLeuGly335AsnAlaLys350lieValSerAspSerGlyPheValArgSerLeuAla430AspLeuGluAsn445AlaGluGluAsn460ValLysGinThr475AspArgLysLysGlyTrp400AlaVal415GluArgArgTrpProAspHisGlu480ThrSer4951權(quán)利要求1.一個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟和品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，其特征在于具有序列表<400>1項(xiàng)下的序列。2.序列表<400>1項(xiàng)下的序列限定的蛋白質(zhì)，具有序列表<400>2項(xiàng)下的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄械陌被釟埢蛄薪?jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列表<400>2項(xiàng)下的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質(zhì)。3.y-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)處理香蕉采后果實(shí)，可誘導(dǎo)和抑制權(quán)利要求1中的序列所編碼基因表達(dá)，進(jìn)而影響果實(shí)成熟過(guò)程、果實(shí)的硬度、可溶性總糖和淀粉含量等的變化，有效調(diào)控果實(shí)采后成熟和品質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及一個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟和品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，公開(kāi)了一個(gè)與香蕉果實(shí)采后成熟過(guò)程有關(guān)的基因MaGAD1是下列核苷酸序列之一1)序列表中<400>1項(xiàng)下的DNA序列；2)與序列表中<400>1項(xiàng)下限定的蛋白質(zhì)，具有序列表中<400>2項(xiàng)下的氨基酸殘基序列或?qū)⑻摿械陌被釟埢蛄薪?jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列表中<400>2項(xiàng)下的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質(zhì)。該基因可被γ-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)分別誘導(dǎo)和抑制表達(dá)，從而調(diào)控采后香蕉果實(shí)成熟度、硬度、可溶性總糖和淀粉含量等的變化。該基因的應(yīng)用對(duì)于建立香蕉采后果實(shí)成熟調(diào)控新技術(shù)和培育優(yōu)良品種具有重要的理論及實(shí)際意義。文檔編號(hào)C12N15/60GK101643742SQ20091016493公開(kāi)日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年7月24日優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日公開(kāi)號(hào)200910164935.發(fā)明者劉菊華,張建斌,徐碧玉,偉胡,譚光蘭,賈彩紅,金志強(qiáng)申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所;農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站