專利名稱：：一種改進(jìn)的卷煙煙氣體外染毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種巻煙煙氣的體外染毒方法，即采用巻煙煙氣氣相部分(GVP)和粒相部分(TPM)相結(jié)合的方式進(jìn)行體外染毒，使受試對象(細(xì)胞或細(xì)菌)的染毒環(huán)境更接近于實(shí)際的巻煙煙氣暴露情況。
背景技術(shù)：
：在巻煙添加劑的毒理學(xué)評價方面，國外的一些研究機(jī)構(gòu)和公司已經(jīng)開展了大量的研究工作。Clements等人進(jìn)行了巻煙添加劑體外毒理學(xué)評價的研究，研究側(cè)重于巻煙添加劑體外毒理學(xué)評價的研究設(shè)計，根據(jù)遺傳毒理測試的標(biāo)準(zhǔn)方法，細(xì)菌突變-Amestest,哺乳類細(xì)胞突變-小鼠淋巴瘤分析和培養(yǎng)的人類細(xì)胞或中國倉鼠細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)變異分析，體外微核分析-利用復(fù)制指數(shù)作為毒性指標(biāo)，細(xì)胞毒性分析-NeutralRedtest,并針對煙氣粒相部分的特點(diǎn)進(jìn)行了特殊的試驗(yàn)設(shè)計。英美煙草公司Massey等人研究了煙草添加劑對煙氣化學(xué)及毒性的影響，對于煙草添加劑，采用以下4種試驗(yàn)l)直接高溫?zé)峤猓治霎a(chǎn)物；2)添加入香煙，觀察對煙氣化學(xué)的影響-"霍夫曼名單"列出的有害成分；3)體外生物活性測定；4)吸入毒性測定。PHILIPMORRIS公司對巻煙添加劑評價的一般原則是關(guān)于煙氣的化學(xué)分析，基于兩大團(tuán)體即美國消費(fèi)者保護(hù)委員會(霍夫曼名單)和國際癌癥研究協(xié)會(IARC)的推薦，分析約50種煙氣組分。使用三種測試煙氣遺傳毒性的試驗(yàn)(Ames試驗(yàn)、小鼠淋巴肉瘤細(xì)胞株致突變試驗(yàn)、.大鼠紅細(xì)胞微核試驗(yàn))，比較了無添加成分的對照巻煙和添加了不同量成分的受試巻煙的毒理學(xué)效應(yīng)。國內(nèi)一些科研單位開展了一些煙草煙氣體外毒性測試的研究和煙草煙氣的動物體內(nèi)試驗(yàn)。但是，這些研究多是基于巻煙煙氣粒相部分(TPM)染毒方式進(jìn)行的，只能反映出TPM的生物學(xué)效應(yīng)。而巻煙煙氣不僅含有巻煙煙氣粒相部分，同時還含3有大量的有害氣相組分，僅采用TPM染毒方式是不能全面真實(shí)地評價巻煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)。與本發(fā)明相近的發(fā)明專利為CN101393190《巻煙主流煙氣細(xì)胞毒性測定方法》，將培養(yǎng)好的細(xì)胞直接置入經(jīng)過潔凈空氣稀釋的巻煙主流煙氣中進(jìn)行暴露，然后通過中性紅染色，根據(jù)細(xì)胞攝入中性紅的情況，利用可讀多孔培養(yǎng)板分光光度計進(jìn)行吸光度值測定，與潔凈空氣暴露對照樣品比較，進(jìn)而判斷巻煙主流煙氣毒性。其特征是將細(xì)胞直接暴露于巻煙主流煙氣，雖然是巻煙煙氣直接暴露，但是接觸細(xì)胞的巻煙煙氣氣相部分仍然是溶于水的一部分氣相物質(zhì)，并且與細(xì)胞接觸的巻煙煙氣濃度不容易控制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是針對以上不足而進(jìn)行了改進(jìn)。通過一定途徑來收集巻煙煙氣氣相部分(GVP)，采用GVP結(jié)合TPM進(jìn)行體外染毒的方法，可以全面真實(shí)的反映巻煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明在以往TPM染毒方式的基礎(chǔ)上，增加了巻煙煙氣氣相部分的染毒,使體外染毒方法更接近于實(shí)際的巻煙煙氣暴露情況。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明改進(jìn)的巻煙煙氣體外染毒方法，采用巻煙煙氣氣相部分(GVP)與巻煙煙氣粒相部分(TPM)混合后進(jìn)行體外染毒試驗(yàn)，來評價巻煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)，具體方法如下a、煙氣粒相部分與氣相部分收集通過吸煙機(jī)與劍橋?yàn)V片及氣體吸收瓶相串連的方式分別收集煙氣粒相部分和煙氣氣相部分，吸收瓶內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，并將吸收瓶置于含冰塊的杜瓦瓶內(nèi)，保證緩沖液在整個收集過程中低于4°C;b、粒相部分與氣相部分混合將劍橋片收集的TPM采用DMS0進(jìn)行萃取，萃取濃度為10mg/ml，向吸收瓶中加入與萃取TPM所用DMS0體積相同的磷酸鹽緩沖液，然后將TPM與GVP按1:1配比；c、體外染毒將l:1的配比的TPM+GVP稀釋到不同濃度梯度，通過體外染毒的方法來進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、微核試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)。本發(fā)明的特點(diǎn)在于通過吸收瓶來收集巻煙煙氣氣相部分，采用GVP結(jié)合TPM進(jìn)行體外染毒的方式，可以全面真實(shí)的反映巻煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)，在以往TPM染毒方式的基礎(chǔ)上，增加了巻煙煙氣氣相部分的染毒，使體外染毒方法更接近于實(shí)際的巻煙煙氣暴露情況。另外而本發(fā)明中將粒相與氣相分別收集，染毒濃度易控，并且收集方法容易操作。圖1為本發(fā)明的具體流程示意圖。圖2為本發(fā)明收集煙氣粒相部分和氣相部分的設(shè)備儀器連接示意圖。圖2中l(wèi)為Borgwaldt(T游潛^:錄J轉(zhuǎn)盤吸煙機(jī)；2為收集TPM的劍橋?yàn)V片，3為GVP吸收瓶，4為杜瓦瓶冰浴，5為空氣泵，6為煙氣管路。具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)例做進(jìn)一步描述實(shí)例l對參比巻煙2R4F進(jìn)行體外染毒。按照本發(fā)明所述方法，連接吸收瓶與吸煙機(jī)，抽吸20支巻煙之后，用DMS0將TPM萃取到10mg/mL，然后往吸收瓶加入與DMSO等體積無轉(zhuǎn)鎂磷酸鹽緩沖液，使?jié)舛葹榈攘康?0mg/mL，將TPM與GVP1:l配比。選用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，分別用TPM、GVP、TPM+GVP來迸行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，染毒后，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注*"EC50"是50%effectiveeoncentration半數(shù)有效濃度結(jié)果顯示，GVP確實(shí)有生物學(xué)效應(yīng)，并且TPM+GVP的生物學(xué)作用強(qiáng)于TPM和GVP單獨(dú)的作用。實(shí)例2對某一國產(chǎn)烤煙型品牌巻煙進(jìn)行體外染毒。按照本發(fā)明所述方法，按照所述方法，連接吸收瓶與吸煙機(jī)，抽吸20支巻煙之后，用DMSO將TPM萃取到10mg/mL，然后往吸收瓶加入與DMSO等體積無鈣鎂磷酸鹽緩沖液，使?jié)舛葹榈攘康?0mg/mL，將TPM與GVP1:1配比。將TPM+GVP濃度配制為25、50、100、125、250、500ug/mL。陽性對照為無活化系統(tǒng)時TA98陽性對照為40ng/mL硝基笏，TA100陽性對照為10"g/mL;有活化系統(tǒng)時TA98、TA100陽性對照為20ug/mL蒽胺。陰性對照為溶劑對照。然后，吸取配制好的0.lmL受試物與0.lmL菌液混勻，在37'C條件下，預(yù)培養(yǎng)30min;需活化的另加入0.5mL59&S9混合液。之后，取已融化并在45。C水浴中保溫的頂層培養(yǎng)基一管(2mL)，加入0.2mL受試物菌液混合液，活化的加入0.7mL受試物、菌液及S9混合液，迅速混勻，倒入底層平板培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動平板使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平方固化，37。C培養(yǎng)48h;計數(shù)各平板回突變菌落數(shù)。6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示，TPM+GVP致突變能力強(qiáng)于TPM。實(shí)例3選用參比巻煙2R4F，進(jìn)行體外染毒。按照本發(fā)明所述方法，連接吸收瓶與吸煙機(jī)，抽吸20支巻煙之后，用DMSO將TPM萃取到10mg/mL，然后往吸收瓶加入與DMSO等體積無鈣鎂磷酸鹽緩沖液，使?jié)舛葹榈攘康?0mg/mL,將TPM與GVP1:l配比。然后進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，培養(yǎng)CH0至濃度達(dá)到lX105個細(xì)胞/niL，將細(xì)胞懸液按5mL/瓶接種于50mL的培養(yǎng)瓶。過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。用細(xì)胞培養(yǎng)基將萃取液稀釋，TPM和TPM+GVP溶液配制為不同劑量50ug/mL、75ng/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL。細(xì)胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)液，加入受試物(TPM和TPM+GVP)，每個劑量接種兩個培養(yǎng)瓶，并設(shè)立陰性對照和陽性對照。需要活化時，培養(yǎng)瓶加入4.625mL培養(yǎng)基，0.275mLS9混合液。培養(yǎng)27h。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞消化，進(jìn)行玻片涂片，用固定液(冰醋酸甲醇為l:3)對細(xì)胞進(jìn)行固定。然后用吖啶橙染劑染色5min，沖洗染色劑，晾干玻片。每個培養(yǎng)瓶細(xì)胞計數(shù)1000個含微核的細(xì)胞數(shù)，即每個劑量計數(shù)2000個細(xì)胞的微核發(fā)生率。結(jié)果如下組別劑量活化系統(tǒng)正常細(xì)胞微核細(xì)微核細(xì)(wg/mU數(shù)(個)胞數(shù)(個)胞率(%)陰性對照0-S91990105絲裂霉素c0.05-S91966341750-S9198812675-S9199284TPM100-S91988126150-S919722814200-S91962381950-S9198713775-S919881268<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>TPM+GVP的微核發(fā)生率高于TPM，TPM+GVP對染色體的損傷能力高于TPM。權(quán)利要求1、一種改進(jìn)的卷煙煙氣體外染毒方法，其特征在于采用卷煙煙氣氣相部分(GVP)與卷煙煙氣粒相部分(TPM)混合后進(jìn)行體外染毒試驗(yàn)，來評價卷煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)，具體方法如下a、煙氣粒相部分與氣相部分收集通過吸煙機(jī)與劍橋?yàn)V片及氣體吸收瓶相串連的方式分別收集煙氣粒相部分和煙氣氣相部分，吸收瓶內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，并將吸收瓶置于含冰塊的杜瓦瓶內(nèi)，保證緩沖液在整個收集過程中低于4℃；b、粒相部分與氣相部分混合將劍橋片收集的TPM采用DMSO進(jìn)行萃取，萃取濃度為10mg/ml，向吸收瓶中加入與萃取TPM所用DMSO體積相同的磷酸鹽緩沖液，然后將TPM與GVP按1∶1配比；c、體外染毒將1∶1的配比的TPM+GVP稀釋到不同濃度梯度，通過體外染毒的方法來進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、微核試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)。全文摘要一種改進(jìn)的卷煙煙氣體外染毒方法，采用卷煙煙氣氣相部分(GVP)與粒相部分(TPM)混合后進(jìn)行體外染毒試驗(yàn)，來評價卷煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)，具體方法如下a、煙氣粒相部分與氣相部分收集，b、粒相部分與氣相部分混合，c、體外染毒將1∶1的配比的TPM+GVP稀釋到不同濃度梯度，通過體外染毒的方法來進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、微核試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)。本發(fā)明的特點(diǎn)在于通過吸收瓶來收集卷煙煙氣氣相部分，采用GVP結(jié)合TPM進(jìn)行體外染毒的方式，可以全面真實(shí)的反映卷煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)，在以往TPM染毒方式的基礎(chǔ)上，增加了卷煙煙氣氣相部分的染毒，使體外染毒方法更接近于實(shí)際的卷煙煙氣暴露情況。且染毒濃度易控，操作簡單。文檔編號C12Q1/02GK101671733SQ20091017225公開日2010年3月17日申請日期2009年9月24日優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日發(fā)明者劉惠民,尚平平,斌彭,翔李,聰聶,謝劍平,樂趙申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院