專利名稱：豬細小病毒與豬偽狂犬病毒二重SYBR Green I實時熒光PCR檢測引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實時熒光PCR檢測方法，具體涉及豬細小病毒與豬偽狂犬病毒二 重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
豬細小病毒(PPV)和豬偽狂犬病毒(PRV)均可感染母豬，引起母豬流產(chǎn)、胚胎死 亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化及不孕等，同時還可引起仔豬的皮炎和腹瀉。也可感染仔豬，導(dǎo) 致仔豬死亡或者形成僵豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。臨床上通過觀察臨床癥狀和 病理變化不能區(qū)分和確定某種疾病的感染，而且時有混合感染，給臨床檢測和控制這兩種 疾病造成了很大困難。熒光定量PCR檢測技術(shù)是近幾年才研制成功的，它融匯了 PCR技術(shù)的核酸高效擴 增，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，直接探測PCR過程 中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。根據(jù)熒光能量傳遞技術(shù)(Fluorescene resonance energy transferFRET)，探針一般采用雙標記，5 ‘端用熒光報告基團標記，3 ‘端用熒光淬 滅基團標記，當兩基團離的比較近時，檢測不到熒光，距離較遠時，則能檢測到熒光。目前用 的熒光探針有Taqman探針、分子信標、雙雜交探針等，另外STOR Green I是一種能與雙鏈 DNA特異結(jié)合的一種染料，也可以用來定量。熒光定量PCR儀完全封閉操作，儀器直接讀數(shù)， 結(jié)果判斷更客觀真實，定量范圍寬(可包括0-108個拷貝/ μ 1)，PCR產(chǎn)物可以用熔點且無 需樣品梯度稀釋等特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對豬細小病毒和豬偽狂犬病毒在臨床上通過觀察 臨床癥狀和病理變化不能區(qū)分和確定某種疾病的感染，而且時有混合感染的問題，提供一 種能同時檢測豬細小病毒與豬偽狂犬病毒的二重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是豬細小病毒與豬偽狂犬病毒二重STOR Green I實時熒光 PCR檢測引物的序列如下豬細小病毒引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA TTT AAT CAA CAG GCA CCA C-3'；下游引物P2 5' -TTC TGT ATC AAG TTC TTT ATC CC-3'；豬偽狂犬病毒的引物序列如下上游引物P3 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P4:5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3'。利用上述引物檢測豬細小病毒與豬偽狂犬病毒的二重STOR Green I實時熒光 PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系和 SYBRGreen I實時熒光PCR擴增程序?qū)悠愤M行檢測。
所述STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份
權(quán)利要求
1.豬細小病毒與豬偽狂犬病毒二重STOR Green I實時熒光PCR檢測引物，其特征在于豬細小病毒引物的序列如下上游引物 Pl 5' -TAA TTT AAT CAA CAG GCA CCA C-3'； 下游引物 P2 5' -TTC TGT ATC AAG TTC TTT ATC CC-3'； 豬偽狂犬病毒的引物序列如下 上游引物 P3 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'； 下游引物 P4:5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。
2.利用權(quán)利要求1所述引物檢測豬細小病毒與豬偽狂犬病毒的二重STOR Green I實 時熒光PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體 系和STOR Green I實時熒光PCR擴增程序?qū)悠愤M行檢測，其特征在于所述STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份
全文摘要
本發(fā)明公開了豬細小病毒與豬偽狂犬病毒二重SYBR Green I實時熒光PCR檢測引物及方法，設(shè)計與合成引物，利用引物檢測豬細小病毒與豬偽狂犬病毒的二重SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，利用SYBR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系和SYBR Green I實時熒光PCR擴增程序?qū)悠愤M行檢測。本發(fā)明能同時檢測豬細小病毒與豬偽狂犬病毒兩種病毒，不能檢測出豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬流感病毒，具有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性，有利于妊娠母豬繁殖障礙性病毒病的鑒別與診斷。
文檔編號C12N15/11GK102071258SQ200910172718
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者崔保安, 李明鳳, 胡慧, 郭顯坡, 陳紅英, 魏戰(zhàn)勇 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)