專利名稱：：一種提高辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提高辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的方法，屬于利用細(xì)胞遺傳學(xué)理論與育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：在辣(甜)椒育種工作中，自交系的選育是非常重要的工作，但常規(guī)選育方法存在周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、占地多等問(wèn)題。單倍體育種是解決這一問(wèn)題的重要方法，它可以大大提高育種效率，縮小育種群體的規(guī)模，并縮短育種年限。游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的主要途徑。經(jīng)小孢子培養(yǎng)得到的花粉株系間性狀變異幅度大，超親現(xiàn)象和出現(xiàn)特殊優(yōu)良性狀的頻率要顯著高于常規(guī)育種；株系內(nèi)性狀整齊，世代間穩(wěn)定性強(qiáng)；通過(guò)小孢子培養(yǎng)獲得的自交系具有高度的純合性，雜交配組可獲得更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)；通過(guò)該法建立起來(lái)的DH群體是開(kāi)展ALFP、RAPD、SSR等分子標(biāo)記和基因圖譜研究用的理想材料。因此，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在遺傳和育種研究中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已有成功的研究報(bào)道，張菊平等獲得了專利(專利號(hào)ZL200610042616.0)，但目前國(guó)內(nèi)報(bào)道顯示，辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率還比較低，最高為1.83個(gè)胚狀體/花藥(劉凡，趙泓，陳斌，張?jiān)略?辣椒游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)的胚狀體形成.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2007，40(6)371-379)，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制。因此，如何提高游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)率，是關(guān)系到辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)能否廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種提高辣(甜)椒游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)率的方法，使得通過(guò)小孢子培養(yǎng)快速獲得純合自交系的技術(shù)應(yīng)用于辣(甜)椒遺傳和新品種選育。本發(fā)明的基本原理是在一定條件下，離體培養(yǎng)植物小孢子的發(fā)育可以脫離在體內(nèi)時(shí)的正常的發(fā)育軌道，通過(guò)分裂增殖最終形成胚狀體或愈傷組織。將形成的胚狀體轉(zhuǎn)接于適宜的培養(yǎng)基上時(shí)，可獲得完整的再生植株。本發(fā)明突出的創(chuàng)新點(diǎn)是通過(guò)提高培養(yǎng)用花蕾質(zhì)量，采用從花蕾的取樣、前期預(yù)處理、花蕾消毒到花藥剝?nèi)〉娜痰蜏乜刂?，并于rc黑暗預(yù)培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)到28°C黑暗培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)，使得辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)胚狀體的誘導(dǎo)率最高達(dá)8.4個(gè)胚狀體/花藥，顯著高于已公布的1個(gè)胚狀體/花藥的專利技術(shù)(專利號(hào)ZL200610042616.0)。提高胚狀體誘導(dǎo)率的方法(本發(fā)明的創(chuàng)新)(1)提高花蕾質(zhì)量培育壯苗、及時(shí)定植、合理肥水、及時(shí)摘取果實(shí)和已開(kāi)放的花，保持植株旺盛的生長(zhǎng)勢(shì)；使適宜取蕾的初花期和盛花期處于白天溫度2530°C，夜間溫度20°C左右的環(huán)境。(2)花蕾的選取晴天早晨8:0010:00選取花瓣等于或略大于花萼且花藥尖端10%25%呈淡紫色的花蕾，用封口袋盛裝于冰盒中暫存。(3)花蕾的低溫預(yù)處理將選取的適宜花蕾在4°C低溫條件下預(yù)處理1天。(4)低溫滅菌和花藥的剝?nèi)缇玫木凭?70%)、次氯酸鈉(2%)和無(wú)菌水皆在4°C低溫保存。滅菌的花蕾用無(wú)菌水洗滌后，浸泡于無(wú)菌水中并置于冰浴上備用，剝?nèi)』ㄋ幵诒∩线M(jìn)行。(5)低溫保存液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在加入固體培養(yǎng)基之前置于4°C冰箱低溫保存。(6)適溫培養(yǎng)將接種的花藥于7°C低溫黑暗預(yù)培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)于28°C下繼續(xù)黑暗培養(yǎng)直至形成子葉胚。本發(fā)明通過(guò)以下步驟完成(1)試材的確定選取具有綜合優(yōu)良性狀的辣(甜)椒基因型作為試驗(yàn)材料。(2)培養(yǎng)基的制備基本培養(yǎng)基為Nitsch組分(NitschandNitsch1969)。固體培養(yǎng)基-Nitsch組分+2%麥芽糖+1.0%活性炭+0.6%瓊脂，pH為6.0，于121°C，1.IMpa條件下滅菌18分鐘。液體培養(yǎng)基-Nitsch組分+2%麥芽糖+0.5mg/LZT+l.Omg/LIAA,pH為5.8，以0.45μm和0.22μm微孔濾膜抽濾滅菌。(3)固體培養(yǎng)基的分裝于超凈工作臺(tái)上將已滅菌的固體培養(yǎng)基在未凝固之前分裝至已滅菌的60X15mm培養(yǎng)皿中備用，每皿5mL。(4)花蕾的選取選取小孢子發(fā)育時(shí)期大多處于單核靠邊期的花蕾。(5)花蕾的預(yù)處理將選取的適宜花蕾進(jìn)行4°C低溫預(yù)處理1天。(6)花蕾的滅菌于超凈工作臺(tái)上，用4°C預(yù)冷的70%酒精表面滅菌30秒鐘，之后用4°C預(yù)冷的2%的次氯酸鈉滅菌1012分鐘，然后用4°C預(yù)冷的無(wú)菌水沖洗3次，時(shí)間分別為1、4、10分鐘。(7)花藥的剝?nèi)∮诔瑑艄ぷ髋_(tái)上，將無(wú)菌培養(yǎng)皿置于冰浴上，并用鑷子從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，徹底去除花絲，操作中盡量避免損傷花藥。(8)花藥接種在裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，加入4°C預(yù)冷的液體培養(yǎng)基每皿3mL，之后接種花藥12枚/皿，用Parafilm膜封口。(9)游離小孢子培養(yǎng)將接種花藥的培養(yǎng)皿置于7°C條件下暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)于28°C下繼續(xù)暗培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)1218天花藥自然開(kāi)裂，釋放出小孢子。(10)胚狀體的形成暗培養(yǎng)期間陸續(xù)出現(xiàn)各種類型的胚狀體，培養(yǎng)8周后將子葉胚接種于分化培養(yǎng)基上，形成再生植株。本發(fā)明對(duì)辣(甜)椒小孢子培養(yǎng)采取的方法實(shí)用、步驟具體、適用的基因型廣泛、重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體技術(shù)在創(chuàng)建DH群體上的廣泛應(yīng)用。利用該方法獲得的胚狀體及再生植株，較已公布的專利技術(shù)有顯著提高。9個(gè)性狀優(yōu)良且品種間差異較大的基因型用該方法培養(yǎng)均獲得了胚狀體，最高達(dá)8.4個(gè)胚狀體/花藥。本發(fā)明創(chuàng)建的DH群體可廣泛應(yīng)用于辣椒的分子標(biāo)記、基因圖譜構(gòu)建和自交系的選育等遺傳和育種工作中。圖1單核靠邊期的小孢子。圖2培養(yǎng)3周后的細(xì)胞團(tuán)。圖3培養(yǎng)7周后的胚狀體。圖4培養(yǎng)獲得的胚狀體。圖5胚狀體的分化。圖6胚狀體的再生植株。以下結(jié)合附圖發(fā)明人給出了具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)闡述。具體實(shí)施例方式按照本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實(shí)施步驟為(1)試材的確定選取綜合性狀優(yōu)良的甜椒基因型08-488作為試驗(yàn)材料。(2)試材的培養(yǎng)及花蕾質(zhì)量的提高培育壯苗、及時(shí)定植、合理肥水、及時(shí)摘取果實(shí)和已開(kāi)放的花，保持植株旺盛的生長(zhǎng)勢(shì)；使適宜取蕾的初花期和盛花期處于白天溫度2530°C，夜間溫度20°C左右的環(huán)境。(3)培養(yǎng)基的制備基本培養(yǎng)基為NitschandNitsch(1969)組分(引自J.P.Nitsch，C.Nitsch.HaploidPlantsfromPollenGrains.Science,1969,1(3):85_87·具體成分詳見(jiàn)列表)。固體培養(yǎng)基-Nitsch組分+2%麥芽糖+1.0%活性炭+0.6%瓊脂，ρΗ為6.0，于121°C，1.IMpa條件下滅菌18分鐘。液體培養(yǎng)基-Nitsch組分+2%麥芽糖+0.5mg/LZT+l.Omg/LIAA,ρΗ為5·8，以0.45μm和0.22μm微孔濾膜抽濾滅菌。分化培養(yǎng)基=Nitsch組分+2%蔗糖+0.9%瓊脂，ρΗ為6.0，于121°C，1.IMpa條件下滅菌18分鐘。(4)培養(yǎng)基的分裝于超凈工作臺(tái)上將已滅菌的固體培養(yǎng)基在未凝固之前分裝于已滅菌的60X15mm培養(yǎng)皿，每皿5mL；待固體培養(yǎng)基凝固后，接種花藥前加入提前在4°C預(yù)冷的液體培養(yǎng)基，每皿3mL。(5)花蕾的選擇在08-488的初花期和盛花期，通過(guò)鐵釩-蘇木精壓片法鏡檢確定小孢子發(fā)育時(shí)期與外部形態(tài)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確找到發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期(圖1)的花蕾。此時(shí)花蕾的外部形態(tài)特征表現(xiàn)為花瓣等于或略大于花萼，并且花藥尖端有1025%呈淡紫色。選擇健壯植株上的花蕾，晴天早晨8:0010:00摘取適宜的花蕾，用封口袋放于盛有冰的冰盒中暫存。(6)花蕾預(yù)處理將選取的適宜花蕾置于4°C條件下處理1天。(7)花蕾消毒于超凈工作臺(tái)上，將4°C低溫處理的花蕾，用4°C預(yù)冷的70%的酒精表面消毒30秒鐘，之后用4°C預(yù)冷的2%的次氯酸鈉消毒10分鐘，最后用4°C預(yù)冷的無(wú)菌水沖洗3次，時(shí)間分別為1、4、10分鐘，后浸泡于無(wú)菌水中置于冰浴上備用。(8)花藥的剝?nèi)≡诔瑑艄ぷ髋_(tái)上，將無(wú)菌培養(yǎng)皿置于冰浴上，并用鑷子從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，徹底去除花絲，操作中盡量避免損傷花藥。(9)花藥接種在裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，加入4°C預(yù)冷的液體培養(yǎng)基每皿3mL,之后接種花藥12枚/皿，用ParafiIm膜封口。(10)游離小孢子培養(yǎng)將接種花藥的培養(yǎng)皿置于7°C條件下暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)于28°C下繼續(xù)暗培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)1218天后花藥自然開(kāi)裂，釋放出小孢子。(11)胚狀體的形成釋放出的小孢子繼續(xù)培養(yǎng)3周后，于倒置顯微鏡下鏡檢觀察到細(xì)胞團(tuán)(圖2)；培養(yǎng)7周后，可見(jiàn)各種類型的胚狀體(圖3)，胚狀體的誘導(dǎo)率最高達(dá)8.4個(gè)胚狀體/花藥，最低為7.3個(gè)胚狀體/花藥，平均達(dá)7.8個(gè)胚狀體/花藥；培養(yǎng)8周后出現(xiàn)明顯子葉型胚(圖4)；將子葉胚接種于分化培養(yǎng)基上可見(jiàn)子葉胚轉(zhuǎn)綠，出現(xiàn)真葉，最終形成再生植株(圖5，6)。需要說(shuō)明的是，上述實(shí)例選取甜椒基因型08-488作為實(shí)驗(yàn)材料，但并不局限于該材料，已開(kāi)展的9個(gè)基因型差異較大的辣(甜)椒品種的小孢子培養(yǎng)胚狀體研究，均獲得較高的胚狀體誘導(dǎo)率，此方法對(duì)于其他辣(甜)椒基因型均可達(dá)到本發(fā)明的目的。附表NitschandNitsch培養(yǎng)基基本組成成分表(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種提高辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的方法，包括以下步驟(1)試材的確定選取具有綜合性狀優(yōu)良的辣(甜)椒基因型作為試驗(yàn)材料；(2)培養(yǎng)基的制備基本培養(yǎng)基為NitschandNitsch(1969)組分(引自J.P.Nitsch，C.Nitsch.HaploidPlantsfromPollenGrains.Science，1969，1(3)85-87具體成分詳見(jiàn)列表)固體培養(yǎng)基-Nitsch組分+2％麥芽糖+1.0％活性炭+0.6％瓊脂，pH為6.0，于高溫121℃高壓1.1Mpa條件下滅菌18分鐘；液體培養(yǎng)基-Nitsch組分+2％麥芽糖+0.5ZTmg/L+1.0mg/LIAA，pH為5.8，以0.45μm和0.22μm微孔濾膜抽濾滅菌；分化培養(yǎng)基Nitsch組分+2％蔗糖+0.9％瓊脂，pH為6.0，于121℃，1.1Mpa條件下滅菌18分鐘；(3)培養(yǎng)基的分裝于超凈工作臺(tái)上將已滅菌的固體培養(yǎng)基在凝固之前分裝于已滅菌的60×15mm培養(yǎng)皿中，每皿5mL；待固體培養(yǎng)基凝固后，在接種花藥前加入每皿3ml液體培養(yǎng)基備用；(4)花蕾的選擇在初花期和盛花期，通過(guò)鐵釩—蘇木精壓片法鏡檢確定小孢子發(fā)育時(shí)期與外部形態(tài)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確找到發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的花蕾，此時(shí)花蕾的外部形態(tài)特征表現(xiàn)為花瓣等于或略大于花萼，并且花藥尖端有10～25％呈淡紫色；(5)花蕾預(yù)處理將選取的適宜花蕾置于4℃條件下處理1天；(6)花蕾消毒在超凈工作臺(tái)上，用70％的酒精表面消毒30秒鐘，之后用2％的次氯酸鈉消毒10分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗3次，時(shí)間分別為1、4、10分鐘；(7)花藥的剝?nèi)∮诔瑑艄ぷ髋_(tái)上，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中用鑷子從花蕾中剝?nèi)』ㄋ帲瑥氐兹コńz，操作中盡量避免損傷花藥；(8)花藥接種在裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，加入液體培養(yǎng)基每皿3mL，之后接種花藥12枚/皿，用Parafilm膜封口；(9)游離小孢子培養(yǎng)將接種的培養(yǎng)皿進(jìn)行暗培養(yǎng)；(10)胚狀體的形成培養(yǎng)期間各種類型的胚狀體陸續(xù)出現(xiàn)，8周后將子葉胚接種于分化培養(yǎng)基上，形成再生植株；其特征是(1)提高花蕾質(zhì)量培育壯苗、及時(shí)定植、合理肥水、及時(shí)摘取果實(shí)和已開(kāi)放的花，保持植株旺盛的生長(zhǎng)勢(shì)；使適宜取蕾的初花期和盛花期處于白天溫度25～30℃，夜間溫度20℃左右的環(huán)境；(2)采用從培養(yǎng)基、花蕾的選擇、花蕾預(yù)處理、花蕾消毒到花藥剝?nèi)∪痰蜏乜刂埔后w培養(yǎng)基加入之前于4℃低溫預(yù)冷保存；選擇健壯植株的花蕾，晴天早晨8:00～10:00摘取適宜的花蕾用封口袋放于盛有冰的冰盒暫存；花蕾消毒用的酒精(70％)、次氯酸鈉(2％)和無(wú)菌水使用之前皆在4℃低溫預(yù)冷保存，消毒后的花蕾浸泡于無(wú)菌水中置于冰浴上備用；在超凈工作臺(tái)上，將無(wú)菌培養(yǎng)皿置于冰浴上剝?nèi)』ㄋ帲?3)游離小孢子培養(yǎng)將接種花藥的培養(yǎng)皿置于7℃條件下暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)于28℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)12～18天后花藥自然開(kāi)裂，將小孢子釋放于液體培養(yǎng)基中。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種提高辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的方法，屬于利用細(xì)胞遺傳學(xué)理論與育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。該發(fā)明在前人已發(fā)表的辣椒游離小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)提高培養(yǎng)用花蕾質(zhì)量，采用從花蕾的取樣、前期預(yù)處理、滅菌到花藥剝?nèi)∪痰蜏乜刂?，并?℃黑暗預(yù)培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)到28℃黑暗培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)，使獲得的胚狀體最高達(dá)8.4個(gè)胚狀體/花藥，平均為1.3個(gè)胚狀體/花藥，高于公布的1個(gè)胚狀體/花藥的專利技術(shù)及國(guó)內(nèi)目前報(bào)道的最高為1.83個(gè)胚狀體/花藥的研究。本發(fā)明的特點(diǎn)是方法實(shí)用、步驟具體、適用的基因型廣泛、重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)辣(甜)椒游離小孢子培養(yǎng)在單倍體育種及創(chuàng)建遺傳作圖群體上的廣泛應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N5/04GK101822213SQ20091017539公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2009年12月21日優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日發(fā)明者宋彥平,李曉峰,王彥華,申書(shū)興,羅雙霞,軒淑欣,銀婷,陳雪平,顧愛(ài)俠申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)