專利名稱：用于可視化檢測豬瘟病毒野毒株的rt-lamp引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一套檢測毒株的引物，尤其涉及一套用于可視化檢測豬瘟病毒野毒株 的RT-LAMP引物，屬于豬瘟病毒毒株的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(classical swine fever， CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種以高熱 和出血為主要特征的高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，被世界動物衛(wèi) 生組織(0IE)列入須申報(bào)OIE疾病名錄。CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬，其基因組為線狀單 股正鏈RNA，長約12. 3kb，含有單一的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個由3898個氨基酸殘基 組成的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、El、E2)以 及8種非結(jié)構(gòu)蛋白(NPM、 p7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B)，其中NS5B基因序列是可 靠的CSFV基因型分類依據(jù)。 與CSFV同屬的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和綿羊邊界病病毒(BDV)也可以感 染豬，與CSFV存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，給豬瘟診斷帶來很大困難(孫世琪，靳野，郭慧琛， 等.我國近期豬瘟分子流行病學(xué)動態(tài).動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25(6) :69-71 ;Paton DJ， Greiser-Wiike I. Classical swine fever__an update. Res VetSci，2003，75(3): 169-178.)。另外，由于豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我國的大規(guī)模應(yīng)用，使得CSFV野毒感 染豬和疫苗接種豬的鑒別變得困難。目前豬瘟診斷方法有很多，包括病毒分離培養(yǎng)、動物接 種試驗(yàn)、血清學(xué)診斷方法、RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR等。其中病毒分離和動物試驗(yàn)不 同程度的存在診斷周期長、操作繁瑣、檢出率低等不足；常規(guī)的血清學(xué)試驗(yàn)又都存在一定的 血清學(xué)交叉反應(yīng)，難以將CSFV與同屬的BVDV和BDV感染區(qū)分開，也很難鑒別CSFV野毒感 染和疫苗接種，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對實(shí)驗(yàn)儀器的要求很高。雖然單克隆抗體技術(shù)用 于診斷在一定程度上彌補(bǔ)了這一缺陷，但是基于抗原抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)仍有一定的局限 性(如敏感性不夠高)，如膠體金檢測技術(shù)。上述方法或多或少存在缺陷，不適合于基層實(shí) 驗(yàn)室及現(xiàn)地的快速準(zhǔn)確檢測。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification， LAMP)方法是日本 學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、成 本低廉，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。由于反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，因此 肉眼也可觀察到陽性反應(yīng)管中的白色混濁物。目前，日本已利用這種特性研制出專門用于 LAMP檢測的實(shí)時(shí)監(jiān)控濁度儀，可以實(shí)現(xiàn)對LAMP擴(kuò)增過程的全程實(shí)時(shí)監(jiān)控。此外還可以向產(chǎn) 物中加入熒光染料的方法進(jìn)行判定。自從LAMP方法問世以來，已經(jīng)應(yīng)用于胚胎性別鑒定和 不同病原體的檢測。 文獻(xiàn)報(bào)道表明，LAMP方法已經(jīng)成功用于人、畜禽和水生動物的多種病原體的檢測。 如犬瘟熱病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒等都已應(yīng)用該技術(shù)建立了相應(yīng)的檢測方法。關(guān)于 CSFV的RT-LAMP方法也有報(bào)道(陳蕾，范學(xué)政，王琴，等.豬瘟病毒RT-LAMP快速診斷方法的 建立.動物傳染病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生，2008， 209-213 ;Chen HT， Zhang J，Ma LN， et al. R即idpre_clinical detection of classical swinefever by reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification[J]. Mol Cell Probes,2009，23(2) :71-74.)，但均不能用于CSFV野毒株和疫苗株的鑒別診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一套可視化檢測豬瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 —套用于可視化檢測豬瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，由一對外圍引物和一對內(nèi)引物組成;其中，一對外圍引物的序列分別為SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:l所示，一對內(nèi)引物的序列分別為SEQID NO :3和SEQ ID NO :4所示。 本發(fā)明根據(jù)GenBank中35株CSFV全基因序列及16株BVDV全基因組序列，設(shè)計(jì)針對CSFV NS5B區(qū)域的RT-LAMP引物(因?yàn)镹S5B基因序列存在的差異是CSFV基因型分類依據(jù)，所以根據(jù)NS5B區(qū)域的堿基差異設(shè)計(jì)了專門針對CSFV野毒株的RT-LAMP引物)，包括一對外圍引物F3/B3(SEQ ID NO:l禾PSEQ ID NO : 1)， 一對內(nèi)引物FIP/BIP (SEQ IDN0 :3和SEQ ID N0:4所示)，以樣品的cDNA為模板，利用Bst DNA聚合酶，在62。C恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I染料直接或在紫外光下觀察判定擴(kuò)增結(jié)果。該方法可檢測出不同基因型的CSFV野毒株，其檢出極限為2. 5TCID5。的CSFV，與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的敏感性相當(dāng)；特異性試驗(yàn)表明，該方法對豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹瀉病毒以及其它常見豬源病毒均無擴(kuò)增反應(yīng)；通過對126份不同樣品進(jìn)行比對檢測，該方法與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的符合率達(dá)100% ，與引物-探針能量轉(zhuǎn)移PCR方法的符合率為98.4%。該方法無需特殊儀器，是一種適用于基層的快速、簡便的CSFV野毒鑒別檢測方法。 以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物采用RT-LAMP檢測方法對各種基因型CSFV野毒株進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陽性，而對豬瘟兔化弱毒疫苗株、BVDV-1株以及其它常見豬源病毒檢測結(jié)果均為陰性，并且通過對大量的臨床樣品進(jìn)行檢測，其結(jié)果與本試驗(yàn)室已經(jīng)建立的CSFV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的檢出結(jié)果完全符合，而與PriPro-ET PCR方法的符合率為98. 4X，經(jīng)查證PriPro-ET PCR方法的敏感性為20拷貝，而CSFV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR敏感性為41. 8拷貝(Zhao JJ， Cheng D， Li N， et al. Evaluation of a multiplex real-timeRT-PCR for quantitative anddifferential detection of wild-type viruses andC-strain vaccine ofClassical swine fever virus.Vet Microbiol，2008，126(1-3):1-10.)(相當(dāng)于3. 2TCID5。， Cheng D， Zhao JJ， Li N， et al. Simultaneous detectionofClassical swine fever virus and North American genotype Porciner印roductiveand respiratory syndrome virus using a duplex real—time RT—PCR. J Virol Methods,2008， 151 (2) :194-199.)，應(yīng)用本發(fā)明引物序列采用RT-LAMP檢測方法，可以非常準(zhǔn)確的鑒別出CSFV野毒株，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高(基本與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的敏感性相當(dāng))、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物序列在豬瘟疾病的早期檢測和快速診斷中具有重要意義。


圖1RT-LAMP的敏感 圖2RT-LAMP的敏感 圖3RT-LAMP的敏感 圖4RT-LAMP的特異 圖5RT-LAMP的特異 圖6RT-LAMP的特異
性試驗(yàn)結(jié)果(2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果)。性試驗(yàn)結(jié)果(加入SYBR Green I后肉眼直接觀察結(jié)果)性試驗(yàn)結(jié)果(加入SYBR Green I在紫外燈下觀察結(jié)果)性試驗(yàn)結(jié)果(2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果)性試驗(yàn)結(jié)果(加入SYBR Green I后肉眼直接觀察結(jié)果)性試驗(yàn)結(jié)果(加入SYBR Green I在紫外燈下觀察結(jié)果)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而
更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)
人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式
進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。 實(shí)施例 l材料和方法 1. 1病毒株和待檢材料 CSFV石門系強(qiáng)毒株(Shimen)、2種不同基因亞型的CSFV野毒株[1. 1基因亞型HLJ-1 (06) 、 HLJ-3 (06) 、 HeN_5 (06)和HeN_3 (06) ;2. 1基因亞型:HuNl (06) 、 SH-7 (06)、SH11-0701和SX-09]、豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-l)BA株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)HuN4株、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)H16株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)CV777株、豬輪狀病毒(PRV)OSU株、偽狂犬病病毒(PrV) HLJ株、豬細(xì)小病毒(PPV)BQ株和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)LG株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室保存并提供。 待檢材料包括116份從東北地區(qū)不同養(yǎng)豬場送檢的臨床發(fā)熱病例樣品(包括19份扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等和97份血清或全血)以及10份CSFV感染細(xì)胞培養(yǎng)物。
1.2引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中35株CSFV全基因序列及16株BVDV全基因組序列，設(shè)計(jì)針對CSFV在NS5B基因保守區(qū)的RT-LAMP引物，其中包括2條外弓|物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP (表1)。 表1RT-LAMP引物序列和位置
引物序列基因組位置(5'-3')a
F3CCCTGACCATGCATATGWCAG (SEQID11050-11070
NO:l)
B3CATCCCCGCACACATGAAT (SEQID11241-11259
NO:2)
FIP (F1C-F2)AGGTTGTCCRCTGCCTCTTTG-F1C:11118-11138;
CCCGTAATCWGTGCCGA ( SEQ ID NO :3 )F2: 11076-11092
BIP(B1C-B2)ACACAAGCGCAGGCAATAGCAT-B1C: 11140-11161;
CTCTTGTAGGGTACTCCCGT (SEQIDB2: 11202-11221
NO:4) aGenomic positions corresponding to CSFV Shimen/HVRI (accession no.AY775178). 1. 3病毒RNA提取和cDNA合成
1. 3. 1RNA的提取 取140 ii L樣品，用QIAamp Viral RNA Kit提取試劑盒(QIAgen公司)提取病毒 RNA，具體操作方法參照說明書進(jìn)行。提取的病毒RNA用60 L AVE洗脫液洗脫溶解，用于 cDNA的合成。 1.3. 2cDNA的合成 取lyL病毒RNA，加入到20iiL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，內(nèi)含4iiL 5XRT Buffer、2yL dNTP Mixture (各10mM)、50pmo1 9-mer隨機(jī)引物、10U禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT XL)和20U RNA酶抑制劑(HPRI) ，42t:水浴lh，最后70°C 15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
1. 4RT-LAMP方法的優(yōu)化
1. 4. 1鎂離子濃度的優(yōu)化 以CSFV石門株全長cDNA為模板，鎂離子的濃度在2. 5-6. 5mM，以0. 5mM遞增，每個 反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)條件為62t:擴(kuò)增60min，8(TC擴(kuò)增2min，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳中 觀察。 1.4. 2引物濃度的優(yōu)化 由于外引物對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小，所以實(shí)驗(yàn)中固定外引物濃度，對內(nèi)引物濃度進(jìn) 行梯度稀釋(0. 8 ii M、 1. 2 ii M、 1. 6 ii M和2. 0 ii M)，每個濃度的引物重復(fù)3個反應(yīng)，產(chǎn)物于 2 %瓊脂糖凝膠電泳中觀察。
1. 4. 3反應(yīng)溫度的優(yōu)化 在完成以上所有條件優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)行反應(yīng)溫度優(yōu)化。反應(yīng)溫度從61°C _65°C，以 rc依次遞增，每個溫度重復(fù)3次反應(yīng)，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。
1.5擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 反應(yīng)結(jié)束后，加入1 y L的SYBR Green I染料，觀察LAMP反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變 化，再將PCR反應(yīng)管置于紫外燈下照射，觀察是否有強(qiáng)烈的熒光產(chǎn)生。取6yL RT-LAMP擴(kuò) 增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。
1. 6RT-LAMP的敏感性試驗(yàn) 將104 8TCID5。的石門血毒用滅菌的去離子水進(jìn)行連續(xù)5倍或10倍梯度稀釋，分別 提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，運(yùn)用優(yōu)化的RT-LAMP方法和熒光定量RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測，進(jìn)而對兩者的敏感性做出比較。并在RT-LAMP反應(yīng)管中加入liiL SYBR Green I觀察各管顏色變化。 1. 7RT-LAMP的特異性試驗(yàn) 提取CSFV Shimen株、HCLV株、1. 1禾P 2. 1基因亞型的CSFV野毒株、BVDV-1、PRRSV、TGEV、 PEDV、 PRV、 PrV、 PPV和PCV2等病毒核酸，按照所建立的豬瘟RT-LAMP檢測方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)，待反應(yīng)結(jié)束后于各反應(yīng)管中加入1PL SYBR Green I觀察顏色變化。同時(shí)把豬瘟石門株F3和B3之間的擴(kuò)增條帶切膠回收，插入pMD18-T載體，然后測序驗(yàn)證。應(yīng)用DNAStar軟件對序列進(jìn)行分析，并在GenBank中對序列進(jìn)行BLAST分析，用以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 1. 8重復(fù)性試驗(yàn) 取等量的4份不同代次的CSFV石門株細(xì)胞培養(yǎng)物，對每份樣品同時(shí)提取RNA三份，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-LAMP檢測，用以檢測批內(nèi)重復(fù)性。 取等量的4份不同代次的CSFV石門株細(xì)胞培養(yǎng)物，先后分3次在不同時(shí)間提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的RT-LAMP，用以檢測批間重復(fù)性。
1. 9RT-LAMP與其它方法的符合性試驗(yàn) 對10份CSFV接毒細(xì)胞培養(yǎng)物、116份各地臨床樣品，總共126份樣品按上述方法提取RNA和反轉(zhuǎn)錄后，各取1 P L cDNA作為模板，分別應(yīng)用引物_探針能量轉(zhuǎn)移PCR方法 (PriPro-ET PCR)(Liu L， XiaH， Beldk S， et al. Development of a primer-probeenergytransfer real—time PCR assay for the improved detection ofclassical swinefever virus. J Virol Methods, 2009， 160 (1-2) :69-73.)、本實(shí)驗(yàn)室已建立的豬瘟實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法和以上優(yōu)化的RT-LAMP的方法進(jìn)行檢測，分別計(jì)算兩者的符合率。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2. 1優(yōu)化的RT-LAMP反應(yīng)條件 通過對RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為25 ii L :10iiM弓l凈勿F3禾口B3各0. 5iiL，10iiM弓l凈勿FIP禾口BIP各5iiL，2.5mM dNTPs 2.5iiL，25mMMgCl2 5 ii L， 5MBetaine 2. 5 ii L， 10 X Thermo Buffer 2. 5 ii L， Bst DNA聚合酶12U，模板2 y L，用去離子水補(bǔ)足25 ii L。反應(yīng)條件為62。C lh ;80。C 2min。
2. 2RT-LAMP的敏感性 運(yùn)用優(yōu)化的RT-LAMP方法和熒光定量RT-PCR同時(shí)進(jìn)行檢測，2種方法檢測為陽性的最低稀釋度為10a4(2.5)TCID5。。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，結(jié)果陽性管有特異性的梯狀條帶，陰性對照管則無條帶出現(xiàn)(圖1);加入SYBR Green I后，陽性管呈現(xiàn)翠綠色，而陰性對照管則為淡橙色(圖2);將加入染料后的各反應(yīng)管置紫外燈下照射，陽性管發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，而陰性無特異性熒光(圖3)。
2. 3RT-LAMP的特異性 所建立的CSFV RT-LAMP檢測方法可以檢測出不同基因型的CSFV野毒株，而對豬瘟兔化弱毒疫苗株、BVDV-1、 PRRSV、 TGEV、 PEDV、 PRV、 PrV、 PPV和PCV2檢測結(jié)果均為陰性。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性管有特異性的梯狀條帶，其它管則無條帶出現(xiàn)(圖4)。于各反應(yīng)管中加入SYBR Green I后，陽性管呈現(xiàn)明顯的翠綠色，而陰性對照管則為淡橙色(圖5);將加入染料后的各反應(yīng)管置紫外燈下照射，陽性管發(fā)射出強(qiáng)烈的綠色熒光(圖6)。測序結(jié)果分析表明，擴(kuò)增的209bp的片段與CSFV Shimen/HVRI的NS5B序列(AY775178)同源性為 100%。 2. 4RT-LAMP的重復(fù)性
2. 4. 1批間重復(fù)性 取等量的4份不同代次的石門株細(xì)胞培養(yǎng)物，先后分3次不同時(shí)間提取RNA，反轉(zhuǎn) 錄后，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的RT-LAMP檢測，3次檢測結(jié)果無明顯差異。
2. 4. 2批內(nèi)重復(fù)性 各取4份不同代次的石門株細(xì)胞培養(yǎng)物，每份樣品做3個重復(fù)，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄 后，進(jìn)行一次RT-LAMP檢測，3個重復(fù)結(jié)果無明顯差異。
2. 5RT-LAMP與其它方法的符合率 對126份樣品分別應(yīng)用以上優(yōu)化的RT-LAMP方法以及已報(bào)道的CSFV實(shí)時(shí)熒
光定量RT-PCR和PriPro-ET PCR方法分別進(jìn)行檢測，RT-LAMP與熒光定量RT-PCR和與
PriPro-ET PCR的符合率分別為100 %和98. 4% (表2)。表2RT-LAMP與熒光定量RT-PCR和PriPro-ET PCR的符合率
全血/血清 組織病料 細(xì)胞培養(yǎng)物 合計(jì)
RT-LAMP 6/97 3/19 10/10 19/126
Real-time PCR 6/97 3/19 10/10 19/126
PriPro-ETPCR 8/97 3/19 10/10 21/126
符合率 RT-LAMP/Real-time PCR100% RT-LAMP/PriPro-ET PCR 98.4%序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所〈120〉用于可視化檢測豬瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物〈130>KLPI08067〈160>4〈170>PatentIn version 3.1〈210>1〈211>21〈212>DNA〈213>artifical sequence〈400>1ccctgaccat gcatatgwca g〈210>2〈211>19
8
〈212>DNA 〈213>artifical sequence 〈400>2 catccccgca cacatgaat 19 <210>3 〈211>38 〈212>DNA 〈213>artifical sequence 〈400>3 aggttgtccr ctgcctcttt gcccgtaatc wgtgecga 38 〈210>4 〈211>42 〈212>DNA 〈213>artifical sequence <400>4 acacaagcgc aggcaatagc atctcttgta gggtactccc gt 4權(quán)利要求
一套用于可視化檢測豬瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，其特征在于所述RT-LAMP引物由一對外圍引物和一對內(nèi)引物組成；其中，所述外圍引物的序列分別為SEQ ID NO1和SEQID NO1所示，所述內(nèi)引物的序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一套用于可視化檢測豬瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物由一對外圍引物和一對內(nèi)引物組成，其中，這一對外圍引物的序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO1所示，一對內(nèi)引物的序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物采用RT-LAMP檢測方法對各種基因型CSFV野毒株進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為陽性，而對豬瘟兔化弱毒疫苗株、牛病毒性腹瀉病毒以及其它常見豬源病毒檢測結(jié)果均為陰性。應(yīng)用本發(fā)明引物序列采用RT-LAMP檢測方法，可以非常準(zhǔn)確地區(qū)分CSFV野毒株和CSFV疫苗株，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK101696454SQ20091018031
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者仇華吉, 劉大飛, 孫元, 張興娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;