專利名稱：一種納米材料毒性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌應(yīng)用到檢測環(huán)境中納米材料毒性的方法，屬于環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米材料是指粒徑在1-100納米之間的納米結(jié)構(gòu)材料，這種尺度的材料展示了獨特的反應(yīng)活性、光學(xué)性質(zhì)和電磁學(xué)性質(zhì)。納米顆粒物的來源包括兩種， 一種是自然來源，另一種是人為來源。自然來源很早就存在，最典型就是由火山爆發(fā)產(chǎn)生的灰塵在大氣中形成的氣溶膠，還有水體中因生物作用下形成的有機膠體等；人為來源主要是通過一些人類活動(如汽車尾氣排放，煤、天然氣的燃燒及其人工合成的納米材料使用等)而產(chǎn)生的納米尺寸物質(zhì)。在這些納米顆粒物的來源中，以人為來源最為人們所關(guān)注，且由此引起的健康和環(huán)境問題更為嚴(yán)重，本文重點討論人工來源納米顆粒物的毒性效應(yīng)。
因具有獨特的理化性質(zhì)，納米材料在科學(xué)研究以及日常生產(chǎn)、生活中得到了較廣泛應(yīng)用。目前采用納米技術(shù)和納米材料的商品廣泛出現(xiàn)在市場上，其包括電子元件、光學(xué)元件、紡織品、醫(yī)藥檢測及其藥物、高性能運動器材、化妝品、食品包裝、水處理技術(shù)、燃料電池、催化劑、生物傳感器等。以二氧化鈦為例，納米二氧化鈦被廣泛用于自凈玻璃、太陽電池、電器、食品添加劑、藥品、化妝品以及污染物處理和污染修復(fù)中，每年的使用量數(shù)以萬噸。而且隨著納米技術(shù)不斷發(fā)展，將使得采用納米技術(shù)和納米材料的產(chǎn)品會越來越多。有人估測，2006年時全球的納米材料的市場價值大約為105億美元，然而到2015年后這個值將達(dá)到1萬億美元。這意味著越來越多的含有納米材料的產(chǎn)品出現(xiàn)在我們?nèi)粘Ｉa(chǎn)和生活中。隨著這些產(chǎn)品的大量使用，大量的納米材料將通過不同途徑進(jìn)入到環(huán)境中，如進(jìn)入到大氣環(huán)境、水環(huán)境和土壤環(huán)境。于是，具有獨特物理化學(xué)屬性的納米結(jié)構(gòu)材料及其納米顆粒物逐步引起了人們對可能引發(fā)的環(huán)境和健康危害的關(guān)注。
近年來各國研究人員相繼開展了對納米材料的毒性檢測，并進(jìn)行了較為廣泛的研究，主要是通過細(xì)菌、真菌或者藻類等低等細(xì)胞的Live/Dead的方式來判定納米材料的毒性，還有通過哺乳動物細(xì)胞線(動物細(xì)胞線、人體細(xì)胞等)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來判別。例如，Huang等人在"朗繆爾"(Langmuir)雜志(2008年第24期第4140-4144頁)上借助細(xì)菌的存活率來評價納米顆粒物的毒性。Long等人在"環(huán)境科學(xué)與技術(shù)"(Environmental Science&Technology)雜志(2009年第40期第4346-4352頁)上通過哺乳動物細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)程度來評價納米顆粒物的毒性。以上兩種方法存在檢測不準(zhǔn)、操作復(fù)雜、價格昂貴、可重復(fù)性差等缺點。通過以上分析可知，目前檢測納米顆粒物細(xì)胞毒性的方法存在的問題很多。
本發(fā)明的目的正是為了解決上述幾個問題，本發(fā)明中采用了能穩(wěn)定產(chǎn)生熒光的熒光蛋白質(zhì)粒和能迅速繁殖的大腸桿菌菌體。 一方面提供了一種可以通過熒光來判定納米顆粒物毒性的方法，另一方面采用大腸桿菌作為宿主菌簡化了評價裝置的操作方式，有助于實現(xiàn)環(huán)境中納米顆粒物毒性檢測和分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過綠色熒光蛋白能高效、穩(wěn)定檢測環(huán)境中納米顆粒物毒性的方法。此方法在于實現(xiàn)檢測的高通量和靈敏度，分析的速度較快，試樣用量少，且成本較低。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下所述
一種利用綠色熒光蛋白檢測納米顆粒物毒性的方法，其特征在于包括步驟如下
1) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和大腸桿菌培養(yǎng)
(a) 取一管100微升DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒1微升，混合均勻，冰浴中放置30分鐘；
(b) 將管放到42。C水浴循環(huán)，熱擊90秒；
(c) 將所述管轉(zhuǎn)移到冰浴中2-5分鐘；
(d) 向冰浴后的所述管中加入常溫下700-800微升無抗性的SOB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入到搖床中，37'C下?lián)u動1小時；
(e) 取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞450微升加入到50毫克/升卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸收后，在37"C下培養(yǎng)12-16小時；
(f) 通過菌落PCR鑒定單菌落，確定含有能夠表達(dá)綠色熒光的蛋白的質(zhì)粒；
(g) PCR鑒定完畢無誤之后，挑選該單菌落接種于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)12-16小時；
2) 納米材料毒性的檢測
(a) 將步驟1)中培養(yǎng)得到的含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌，用0.9%生理鹽水離心洗滌三次，然后用l毫升的含有卡那霉素抗性的M9培養(yǎng)基重懸；
(b) 把事先用M9液體培養(yǎng)基準(zhǔn)備好的不同種類和不同濃度的納米顆粒物的懸濁液依次加入到96孔黑色熒光酶標(biāo)板孔板上；
(C)通過酶標(biāo)儀檢測不同種類和不同濃度的納米顆粒物熒光強度變化；
(d)通過一段時間內(nèi)熒光強度變化來評價不同種類和不同濃度納米顆粒物對大腸桿菌的毒性。
作為用于本發(fā)明的納米材料毒性檢測方法，其培養(yǎng)基要選用低熒光背景的M9培養(yǎng)基；
所述的納米顆粒物為金紅石型納米二氧化鈦、銳鈦礦型納米二氧化鈦、納米氧化銅或納
米氧化鋅；
本發(fā)明的方法中，待檢測的大腸桿菌在孔板中的密度為lxl(^個/cm、本發(fā)明的方法中，所述的納米顆粒物在M9培養(yǎng)基中分散的顆粒粒徑小于等于100納米，優(yōu)選20納米；
本發(fā)明的方法中，檢測儀器為Tecan公司生產(chǎn)的Infinite M200。


圖1為含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌的激發(fā)波長掃描圖；圖2為含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌的發(fā)射波長掃描圖3為分別加入不同濃度的納米顆粒物(nano-Ti02、 nano-ZnO、 nano-CuO)后，大腸桿菌熒光強度變化曲線(pO.05);
其中，圖3a)為金紅石型納米二氧化鈦，圖3b)為銳鈦礦型納米二氧化鈦，圖3c)為納米氧化銅，圖3d)為納米氧化鋅。
具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例參照附圖進(jìn)行詳細(xì)的說明，以對本發(fā)明方法的目的、特征和優(yōu)點有更深入的了解。以下的實施例具體解釋本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不受實施例的限制。
實施例1
本實施例涉及到納米材料毒性檢測的方法，包括如下步驟，其中所述的納米材料為金紅石型納米二氧化鈦。
1. 取一管100微升DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒l微升，混合均勻，冰浴放置30分鐘；
2. 將管放到42'C水浴循環(huán)，熱擊90秒，轉(zhuǎn)移到冰浴中2-5分鐘；
3. 向冰浴后的所述管中加入常溫下700-800微升無抗性的SOB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入到搖床中，37"C下?lián)u動1小時；
4. 取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞450微升加入到卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸收后，在37'C下過夜培養(yǎng)；
5. 挑選單菌落，并通過菌落PCR鑒定；
6. 接種在37。C下培養(yǎng)12-16小時；準(zhǔn)備好黑色酶標(biāo)板，并配制好200毫克/升的金紅石型二氧化鈦顆粒物儲備液，超聲波分散30分鐘；
7. 在4000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，并用0.9%生理鹽水洗滌三次；最后用1毫升的M9液體培養(yǎng)基重懸；
8. 依次向每個檢測池中加入100微升的大腸桿菌重懸液，接著加入金紅石型納米二氧化鈦，使得終濃度分別為5、 10、 20、 30、 50毫克/升，讓最終每孔的體積達(dá)到200微升；每個樣品設(shè)置三個平行，并預(yù)留未加入納米顆粒物的檢測池作為對照；
9. 將混合樣品放到振動搖床150轉(zhuǎn)/分、37。C下孵育30分鐘；
510.利用Tecan酶標(biāo)儀檢測在488納米激發(fā)光，520納米發(fā)射光條件下的熒光強度變化。實施例2
本實施例涉及到納米材料毒性檢測的方法，包括如下步驟，其中所述的納米材料為銳鈦礦型一.氧化鈦。實施例2中采用與實施例1中相同的納米顆粒物毒性檢測板來進(jìn)行以下步驟
1. 取一管100微升DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒1微升，混合均勻，冰浴放置30分鐘；
2. 將管放到42C水浴循環(huán)，熱擊90秒；轉(zhuǎn)移到冰浴中2-5分鐘；
3. 向冰浴后的所述管中加入常溫下700-800微升無抗性的SOB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入到搖床中，37'C下?lián)u動1小時；
4. 取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞450微升加入到卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸收后，在37'C下培養(yǎng)12-16小時；
5. 挑選單菌落，并通過菌落PCR鑒定；
6. 接種在37'C下培養(yǎng)12-16小時；準(zhǔn)備好黑色酶標(biāo)板，并配制好200毫克/升的銳鈦礦型二氧化鈦顆粒物儲備液，超聲波分散30分鐘；
7. 在4000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，并用0.9%生理鹽水洗滌三次；最后用1毫升的M9液體培養(yǎng)基重懸；
8. 依次向每個檢測池中加入100微升的大腸桿菌重懸液，接著加入銳鈦礦型二氧化鈦，使得終濃度分別為5、 10、 20、 30、 50毫克/升，讓最終每孔的體積達(dá)到200微升；每個樣品設(shè)置三個平行，并預(yù)留未加入納米顆粒物的檢測池作為對照；
9. 將混合樣品放到振動搖床150轉(zhuǎn)/分、37'C下孵育30分鐘；
10. 利用Tecan酶標(biāo)儀檢測在488納米激發(fā)光，520納米發(fā)射光條件下的熒光強度變化。實施例3
本實施例涉及到納米材料毒性檢測的方法，包括如下步驟，其中所述的納米材料為納米氧化鋅。實施例3中采用與實施例1中相同的納米顆粒物毒性檢測板來進(jìn)行以下步驟
1. 取一管100微升DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒l微升，混合均勻，冰浴放置30分鐘；
2. 將管放到42'C水浴循環(huán)，熱擊90秒；轉(zhuǎn)移到冰浴中2-5分鐘；
3. 向冰浴后的所述管中加入常溫下700-800微升無抗性的SOB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入到搖床中，37'C下?lián)u動1小時；
4. 取己轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞450微升加入到卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸收后，在37。C下培養(yǎng)12-16小時；5. 挑選單菌落，并通過菌落PCR鑒定；
6. 接種在37'C下培養(yǎng)12-16小時；準(zhǔn)備好黑色酶標(biāo)板，并配制好100毫克/升的納米氧 化鋅顆粒物儲備液，超聲波分散30分鐘；
7. 在4000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，并用0.9%生理鹽水洗滌三次；最后用1毫升的M9 液體培養(yǎng)基重懸；
8. 依次向每個檢測池中加入100微升的大腸桿菌重懸液，接著加入納米氧化鋅，使得 終濃度分別為5、 10、 20、 30、 50毫克/升，讓最終每孔的體積達(dá)到200微升；每個 樣品設(shè)置三個平行，并預(yù)留未加入納米顆粒物的檢測池作為對照；
9. 將混合樣品放到振動搖床150轉(zhuǎn)/分、37。C下孵育30分鐘；
10. 利用Tecan酶標(biāo)儀檢測在488納米激發(fā)光，520納米發(fā)射光條件下的熒光強度變化。
實施例4
本實施例涉及到納米材料毒性檢測的方法，包括如下步驟，其中所述的納米材料為納米 氧化銅。實施例4中采用與實施例1中相同的納米顆粒物毒性檢測板來進(jìn)行以下步驟
1. 取一管100微升DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒l微升，輕輕混合，冰浴 放置30分鐘；
2. 將管放到42'C水浴循環(huán)，熱擊90秒；轉(zhuǎn)移到冰浴中2-5分鐘；
3. 向冰浴后的所述管中加入常溫下700-800微升無抗性的SOB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入到搖床中， 37'C下?lián)u動1小時；
4. 取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞450微升加入到卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸 收后，在37'C下培養(yǎng)12-16小時；
5. 挑選單菌落，并通過菌落PCR鑒定；
6. 接種在37'C下培養(yǎng)12-16小時；準(zhǔn)備好黑色酶標(biāo)板，并配制好100毫克/升的納米氧 化銅顆粒物儲備液，超聲波分散30分鐘；
7. 在4000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，并用0.9%生理鹽水洗滌三次；最后用1毫升的M9 液體培養(yǎng)基重懸；
8. 依次向每個檢測池中加入100微升的大腸桿菌重懸液，接著加入納米氧化銅儲備液， 使得終濃度分別為5、 10、 20、 30、 50毫克/升，讓最終每孔的體積達(dá)到200微升； 每個樣品設(shè)置三個平行，并預(yù)留未加入納米顆粒物的檢測池作為對照；
9. 將混合樣品放到振動搖床150轉(zhuǎn)/分、37。C下孵育30分鐘；
利用Tecan酶標(biāo)儀檢測在488納米激發(fā)光，520納米發(fā)射光條件下的熒光強度變化。
權(quán)利要求
1.一種利用綠色熒光蛋白檢測納米顆粒物毒性的方法，其特征在于包括如下步驟1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和大腸桿菌培養(yǎng)(a)取一管100微升DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒1微升，混合均勻，冰浴中放置30分鐘；(b)將管放到42℃水浴循環(huán)，熱擊90秒；(c)將所述管轉(zhuǎn)移到冰浴中2-5分鐘；(d)向冰浴后的所述管中加入常溫下700-800微升無抗性的SOB培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)入到搖床中，37℃下?lián)u動1小時；(e)取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞450微升加入到50毫克/升的卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸收后，在37℃下培養(yǎng)12-16小時；(f)通過菌落PCR鑒定單菌落，確定含有能夠表達(dá)綠色熒光的蛋白的質(zhì)粒；(g)PCR鑒定完畢無誤之后，挑選該單菌落接種于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-16小時；2)納米材料毒性的檢測(a)將步驟1)中培養(yǎng)得到的含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌，用0.9％生理鹽水離心洗滌三次，然后用1毫升的含有卡那霉素抗性的M9培養(yǎng)基重懸；(b)把事先用M9液體培養(yǎng)基準(zhǔn)備好的不同種類和不同濃度的納米顆粒物的懸濁液依次加入到96孔黑色熒光酶標(biāo)板孔板上；(c)通過酶標(biāo)儀檢測不同種類和不同濃度的納米顆粒物熒光強度變化；(d)通過1小時內(nèi)熒光強度變化來評價不同種類和不同濃度納米顆粒物毒性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于待檢測的大腸桿菌在孔板中的密度為lx107 個/cm2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述的待檢測的納米顆粒物為金紅石型納米二氧化鈦、銳鈦礦型納米二氧化鈦、納米二氧化銅或納米二氧化鋅。
4. 根據(jù)權(quán)利要求I中所述的方法，其特征在于所采用的培養(yǎng)基為低熒光背景的M9培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求]中所述的方法，其特征在于所述的納米顆粒物在M9培養(yǎng)基中分散的顆 粒粒徑小于等于100納米，優(yōu)選20納米。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法。具體是一種利用含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌檢測環(huán)境中納米材料毒性的方法，該方法克服了環(huán)境中存在的一些自然有機質(zhì)對納米材料毒性檢測的干擾，使得納米材料的毒性檢測更加方便和準(zhǔn)確。具體的方法是選用轉(zhuǎn)化了綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌作為檢測用細(xì)菌，包括以下步驟第一步用M9培養(yǎng)基制備含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌的菌懸液；第二步，利用超聲分散納米材料，制備納米顆粒物懸濁液；第三步，把納米顆粒物與大腸桿菌菌懸液置于37℃條件下培養(yǎng)，并利用酶標(biāo)儀檢測其在一定時間內(nèi)熒光強度變化，然后根據(jù)其熒光強度變化的不同來判定納米顆粒物對大腸桿菌的毒性。本發(fā)明提供了一種高效、穩(wěn)定的納米材料毒性檢測方法，該方法不易受到其他因素干擾，且實驗方法簡單、成本低廉。
文檔編號C12Q1/02GK101671718SQ20091018062
公開日2010年3月17日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者楊志峰, 沈珍瑤, 牛軍峰, 姣 王, 蔣國翔 申請人:北京師范大學(xué)