專利名稱：：一種肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝癌(h印atocellularcarcinoma,HCC)是目前發(fā)病率高、治療困難、死亡率高的惡性腫瘤，全球每年有1000000人死于肝癌(YuAS，KeeffeEB.Managementofhepatocellularcarcinoma.RevGas_troenterolDisord，2003，3(1):8-24)。我國(guó)月干癌的死亡率在所有惡性腫瘤中居第二位，年死于肝癌的人數(shù)占全世界肝癌年死亡總數(shù)的53%(PisaniP，ParkinDM，BrayF，etal.Estimatesofworldwidemortalityfrom25cancersinl990.IntJCaner，1999，83:18-29)。雖然肝癌的診斷和治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但生存率在總體水平上變化不是很明顯。迄今已建立的一系列人肝癌細(xì)胞系(cellline)和人肝癌細(xì)胞系的動(dòng)物模型，為肝癌的發(fā)病機(jī)理和治療研究奠定了良好的基礎(chǔ)。動(dòng)物肝癌細(xì)胞的建立從20世紀(jì)50年代末開(kāi)始，第一株人肝癌細(xì)胞系于1960年建立(陳瑞銘.一株人體肝癌細(xì)胞株的建立和一些初步的觀察.腫瘤研究論文集，1962，39-47)。目前國(guó)內(nèi)外已建立了動(dòng)物和人的肝癌細(xì)胞系有IOO多株，人肝癌細(xì)胞系數(shù)十株。人肝癌細(xì)胞系因?yàn)槿〔挠贖CC患者，或人肝癌動(dòng)物模型，因此，其中的信息與人的更為相似，獲得的結(jié)果更有意義，應(yīng)用也更為廣泛。人肝癌細(xì)胞系取材于原發(fā)肝癌組織，建系過(guò)程中沒(méi)有改變其生物學(xué)特性早期所建的細(xì)胞系大都屬于此類(AlexanderJJ，BeyEM，GeddesEW，etal.Establishmentofacontinuouslygrowingcelllinefromprimarycarcinomaoftheliver.SAfrMedJ，1976,50(54):2124-2128;MorrisKM，AdenDP，K麗lesBB，ColtenHR.Complementbiosynthesisbythehumanhepatoma—derivedcelllineH印G2.JClinInvest,1982，70(4):906-913;王金兵，朱德厚，葉秀珍，等.啟東肝癌細(xì)胞系QGY-7703的建立及其特征.中華腫瘤雜志，1981,3(4):243;董榮春，周榮華，呂發(fā)度，等.S匪C-7721人肝癌細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1980，(1):5-9)，它們有一些共同點(diǎn)，如AFP均為陽(yáng)性，能分泌一些血漿蛋白，但也存在一些明顯的差別，PLC/PRF/5和H印G2在裸鼠中成瘤性都較差，而QGY-7703和SMMC-7721異種移植成功率為100%，PLC/PRF/5能檢測(cè)到HBsAg，H印G2則不含HBV。郭秀嬋等建立的3株人肝癌細(xì)胞，顯示了HBV可以協(xié)同AFB1導(dǎo)致肝癌的發(fā)生(郭秀嬋，藍(lán)祥英，周玲，等.乙型肝炎病毒和黃曲霉素協(xié)同作用誘發(fā)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株的建立.病毒學(xué)報(bào)，2001，17(3).205-209)。丙型肝炎病毒是肝癌的一個(gè)重要致病因素，Aoki等建立了一株能成功翻譯由重組腺病毒產(chǎn)生的HCVRNAs的人肝癌細(xì)胞系(AokiY，AizakiH，ShimoikeT，etal.AhumanlivercelllineexhibitsefficienttranslationofHCVRNAsproducedbyarecombinantadenovirusexpressingT7RNApolymerase.Virology,1998，250:140-150)。具有特征性的人肝癌細(xì)胞系MHCC97是利用裸鼠人肝癌高轉(zhuǎn)移模型在體外建立的(TianJ，TangZY，YeSL，etal.Newhumanhepatocellularcarcinoma(HCC)celllinewithhighlymetastaticpotential(MHCC97)anditsexpressionsofthefactorsassociatedwithmetastasis.BrJCancer,1999，81(5):814-821)，該細(xì)胞系HBsAg、HBxAg、AFP均陽(yáng)性，經(jīng)皮下和肝內(nèi)接種均可使棵鼠致瘤，并發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，肝內(nèi)接種者，肺轉(zhuǎn)移達(dá)100%(12/12)，肺轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞AFP陽(yáng)性。從該細(xì)胞系克隆出的兩株細(xì)胞的生物學(xué)特性有明顯差別，高轉(zhuǎn)移株肺轉(zhuǎn)移率為100%，而低轉(zhuǎn)移株僅為40%(LiY，TangZY，YeSL，etal.Establishmentofcellcloneswithdifferentmetastaticpotentialfromthemetastatich印atocellularcarcinomacelllineMHCC97.WorldJGastroenterol,2001,7(5):630-636)。吳小鵬等一株外生型肝癌細(xì)胞系EGHC-9901,該細(xì)胞系能持續(xù)高分泌AFP，能形成完整毛細(xì)膽管且有明顯微絨毛，說(shuō)明細(xì)胞變異較小(吳小鵬，王占民，劉博，等.外生型肝癌細(xì)胞系的建立及生物學(xué)特性研究.中華外科雜志，2002，40(8):616-617)。一些人肝癌細(xì)胞系其宿主患有其他腫瘤或疾病。KMCH-1是第一株肝癌和膽管癌混合的細(xì)胞系，該細(xì)胞系在無(wú)胸腺鼠中能成瘤，但形成瘤體的分化程度卻不同，皮下移植瘤呈低分化，而腹腔內(nèi)月中瘤分化良好(MurakamiT，YanoH，MaruiwaM，etal.Establishmentandcharacterizationofahumancombinedh印atocholangiocarcinomacelllineanditsheterologoustransplantationi皿udemice.H印atology，1987，7:551-556)。RBHF-l遺傳性血色素沉積病的肝癌患者，HBV和HCV均陰性，該細(xì)胞系的建立有助于鐵沉禾只過(guò)多的石開(kāi)究(SingGK，PaceR，PriorS，etal.Establishmentofacelllinefromahepatocellularcarcinomafromapatientwithhemochromatosis.Hepatology，1994;20:74-81)。Mz-H印-l是第一株致癌物相關(guān)的肝癌來(lái)源的細(xì)胞系，該細(xì)胞系的宿主長(zhǎng)期暴露在高濃度的二氧化釷環(huán)境中，沒(méi)有肝炎病毒感染(DippoldWG，DienesHP，K皿thA，etal.Hepatocellularcarcinomaafterthorotrastexposure-establishmentofanewcellline(Mz-H印-1).H印atology，1985,5(6):1112-1119)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們根據(jù)預(yù)設(shè)目的改造原有的細(xì)胞系，從而建立有既定生物學(xué)特性的肝癌細(xì)胞系。HB611是一株轉(zhuǎn)染了含HBV基因的重組DNA分子和一種抗新霉素基因的Huh6-c15的肝癌細(xì)胞系克隆，能聚集核心顆粒并高水平產(chǎn)生和釋放HBsAg禾口HBeAg(TsurimotoT，F(xiàn)ujiyamaA，MatsubaraK.StableexpressionandreplicationofhepatitisBvirusgenomeinanintegratedstateinahumanh印atomacelllinetransfectedwiththeclonedviralDNA.ProcNatlAcadSciUSA，1987，84(2):444-448)。有人將病人的HCV轉(zhuǎn)染到S匪C-7721細(xì)胞中，在至少3個(gè)多月的時(shí)間里都能在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到HCVRNA和HCVNS3，CP10抗原的表達(dá)(SongZQ，HaoF，MinF，etal.H印atitisCvirusinfectionofhumanh印atomacellline7721invitro.WorldJGastroenterol,2001,7(5):685-689)。用于治療性研究的人肝癌細(xì)胞系主要用于藥物篩選和細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究。如楊俊霞等利用QGY細(xì)胞系作為研究模型，采用逐步用順鉑誘導(dǎo)建立了人肝癌順鉑耐藥系QGY/(^0，該細(xì)胞系和多種抗癌藥有交叉耐藥性，并且與5-氟尿嘧啶、表阿霉素、羥基喜樹(shù)堿等多種抗癌藥有不同程度的交叉耐藥性，且耐藥性穩(wěn)定(楊俊霞，湯為學(xué).人肝癌順鉑耐藥細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征.癌癥，2002，21(8):872-876)。耐藥細(xì)胞系7721/Adm阿霉素半數(shù)致死濃度(IC50)增大4.65倍，并對(duì)多種抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性，其耐藥性提高了26倍不等，該耐藥模型P-gp，MRP表達(dá)有非常顯著的升高，而GSH/GST的表達(dá)無(wú)明顯變化(楊俊4，2002，21(S):872-876)。2、人肝癌細(xì)胞系的應(yīng)用人肝癌細(xì)胞系廣泛地應(yīng)用于肝癌的生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移機(jī)制、臨床診斷、藥物篩選及防治等領(lǐng)域的研究，而且已經(jīng)深入到了基因及分子水平。它主要用于以下幾個(gè)方面。1)在肝癌發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用腫瘤的發(fā)生從根本上說(shuō)腫瘤是個(gè)基因性疾病，從原癌基因激活為癌基因和抑癌基因的失活，通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致了正常細(xì)胞的分化、異常增生，最終形成腫瘤。Ebi皿maH等認(rèn)為，c-mycmRNA的過(guò)度降低可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系的凋亡，同時(shí)可以引起B(yǎng)cl-2的減少，提高細(xì)胞的死亡率(EbinumaH，SaitoH，KosugaM，etal.Reductionofc_mycexpressionbyanantisenseapproachunderCre/loxPswitchinginducesapoptosisinhumanlivercancercells.JCellPhysiol，2001，188(1):56-66)。AFP是肝癌特異性抗原，同時(shí)也是個(gè)潛在的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通過(guò)對(duì)Bel-7402的研究，顯示AFP能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，其生長(zhǎng)調(diào)節(jié)是由特異的膜受體介導(dǎo)的，并通過(guò)cAMP-PKA和細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)水平，且有劑量依賴性(LiMS，LiPF，HeSP，etal.Th印romotingmolecularmechanismofalpha—fetoproteinonthegrowthofh麗nh印atomaBel7402ce11line.WorldJGastroenterol,2002，8(3):469-475)。2)在診斷和預(yù)防研究中的應(yīng)用目前與肝癌診斷的標(biāo)志物比較多，如AFP、MAGE、BAGE等，但都缺乏很好的特異性和敏感性，利用人肝癌細(xì)胞系可以篩選一些有潛在價(jià)值的肝癌診斷標(biāo)志物，有可能預(yù)防肝癌的發(fā)生和提高肝癌的早期診斷水平。0bora等對(duì)5株人肝癌細(xì)胞系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在干擾素抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡上，無(wú)環(huán)視黃醛具有協(xié)同作用，兩者結(jié)合有可能預(yù)防肝癌的發(fā)生(0boraA，ShiratoriY，0kunoM，etal.Synergisticinductionof即optosisbyacyclicretinoidandinterferon_betainhumanhepatocellularcarcinomacells.H印atology，2002，36(5):1115-1124)。WangZ等通過(guò)對(duì)肝癌動(dòng)物模型和人肝癌細(xì)胞系H印G2，S匪C7721以及人胚胎肝細(xì)胞系L_02中胰島素生長(zhǎng)因子II(IGF-II)的檢測(cè)表明，在癌前階段，IGF-II可以通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，而肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后，IGF-II也轉(zhuǎn)為自動(dòng)分泌。因此，IGF-II有可能成為肝癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物(WangZ，RuanYB，GuanY，etal.ExpressionofIGF-IIinearlyexperimentalh印atocellularcarcinomasanditssignificanceinearlydiagnosis.WorldJGastroenterol,2003，9(2):267-270)。3)用于肝癌治療的研究人肝癌細(xì)胞系可以應(yīng)用于藥物作用機(jī)制的研究。FavouletP等對(duì)吡柔比星和阿霉素的細(xì)胞外毒性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)吡柔比星對(duì)H印G2和Hu-H7的毒性效果更好，認(rèn)為吡柔比星能更好地應(yīng)用于晚期肝癌病人的肝動(dòng)脈化療栓塞而不至于引起完全的肝動(dòng)脈阻塞(FavouletP，CercueilJP，F(xiàn)aureP，etal.IncreasedcytotoxicityandstabilityofLipiodol—pirarubicinemulsioncomparedtoclassicaldoxorubicin—Lipiodol-potentialadvantageforchemoembolizationofunresectablehepatocellularcarcinoma.AnticancerDrugs，2001，12(10):801-806)。AbiruS等研究表明，阿司匹林和選擇性環(huán)氧化物酶-2(C0X-2)抑制劑NS-398可以抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)誘導(dǎo)的H印G2細(xì)胞侵襲，其機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2通路(AbiruS，NakaoK，IchikawaT，etal.AspirinandNS-398inhibith印atocytegrowthfactor—inducedinvasivenessofhumanhepatomacells.H印atology，2002，35(5):1117-1124)。4)用于肝炎病毒的研究將肝炎病毒整合到人肝癌細(xì)胞系中，通過(guò)檢測(cè)一些指標(biāo)，可以研究肝炎發(fā)病機(jī)制，為肝炎疫苗和藥物治療提供理論依據(jù)。Bouchard等將缺乏x蛋白的土撥鼠HBV整合轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞系H印G2中，然后用510倍的x蛋白加以剌激，HBVRNA復(fù)制有明顯增加，而單純用信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，對(duì)HBVRNA復(fù)制僅有輕微作用，說(shuō)明這些復(fù)制的信號(hào)通路是由x蛋白激活的(BouchardMJ，PuroRJ，WangL，etal.ActivationandinhibitionofcellularcalciumandtyrosinekinasesignalingpathwaysidentifytargetsoftheHBxproteininvolvedinhepatitisBvirusreplication.JVirol，2003,77(14):7713-7719)。這為抑制肝炎的復(fù)發(fā)和加劇提供了治療方向。Alisi等研究表明，核心蛋白可以直接影響不同p73亞型的功能，在HCV的發(fā)病中起著重要作用(AlisiA，GiambartolomeiS，CupelliF，etal.PhysicalandfunctionalinteractionbetweenHCVcoreproteinandthedifferentp73isoforms.Oncogene,2003，22(17):2573-2580)。5)作為生物人工肝的肝細(xì)胞來(lái)源人肝癌細(xì)胞系有正常肝細(xì)胞某些功能，對(duì)生存條件要求不嚴(yán)，來(lái)源廣泛，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，數(shù)量能滿足需要。C3A細(xì)胞是從H印G2演化而來(lái)，具有良好的分泌蛋白、參與尿素及糖原合成肝細(xì)胞特異性功能，且增殖能力強(qiáng)。目前美國(guó)H印atix公司生產(chǎn)的H印atix-ELAD體外人工肝輔助裝置中使用的生物成分就是C3SA細(xì)胞株，已被批準(zhǔn)進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)(WoodRP，KatzSM，0zakiCF，etal.Extracorporealliverassistde-vice(ELAD):aprelimirmryr印ort.TransplantProc，1993，25(4Sup-pl3):53-54)。盡管人肝癌細(xì)胞系的應(yīng)用存在著一些不足，但它是肝癌實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。隨著人類基因組的完成和分子生物技術(shù)的進(jìn)步，可以針對(duì)肝癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，同時(shí)加強(qiáng)肝癌抗體和藥物的篩選，盡早制服肝癌。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的肝癌細(xì)胞系為人肝癌細(xì)胞株H印-llCGMCCN2.3203。人肝癌細(xì)胞株H印-11CGMCCN2.3203可作為肝癌發(fā)生、肝癌發(fā)展或肝癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。人肝癌細(xì)胞株H印-11CGMCCN2.3203也可以用于建立肝癌動(dòng)物模型。本發(fā)明還提供一種人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCC漁.3204。人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCC漁.3204可作為肝癌發(fā)生、肝癌發(fā)展或肝癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型，也可以用于建立肝癌動(dòng)物模型。人肝癌細(xì)胞株H印-11和人肝癌細(xì)胞株H印-12，均已于2009年07月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，人肝癌細(xì)胞株H印-ll的保藏號(hào)為CGMCCN2.3203，人肝癌細(xì)胞株H印-12的保藏號(hào)為CGMCCN2.3204。本發(fā)明還提供一種研究肝癌的細(xì)胞模型組。本發(fā)明所提供的研究肝癌的細(xì)胞模型組由人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCCN2.3204和6人肝癌細(xì)胞株H印-11CGMCCN2.3203組成。上述細(xì)胞模型組可用于研究肝癌發(fā)生機(jī)理和/或篩選治療肝癌藥物。實(shí)驗(yàn)證明，說(shuō)明這兩株細(xì)胞具有不同的生物學(xué)活性，H印-12CGMCC漁.3204細(xì)胞較H印-11CGMCCN2.3203細(xì)胞具有更惡性的致瘤特性。H印-12CGMCC漁3204細(xì)胞具有很好的致瘤特性，這兩株細(xì)胞可以作為研究肝癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。并且，H印-11CGMCCN23203和H印-12CGMCC漁.3204配合使用可以研究肝癌早期、晚期的發(fā)生機(jī)理，觀察H印-11CGMCCN2.3203和H印-12CGMCC漁.3204分別建模的動(dòng)物模型的蛋白表達(dá)差異，克隆相關(guān)基因，并用H印-11CGMCCN2.3203進(jìn)行功能驗(yàn)證，等等，在分子水平上研究影響肝癌發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移的機(jī)理，并將其作為靶標(biāo)篩選抗癌藥物。圖1為H印-12細(xì)胞在顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)圖。圖2為H印-ll和H印-12接種免疫缺陷小鼠后10周取實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟照片。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、人肝癌細(xì)胞株H印-11和人肝癌細(xì)胞株H印-12的獲得及其致瘤效果驗(yàn)證發(fā)明人從一例肝癌患者早期發(fā)病和晚期發(fā)病的腫瘤取樣，建立兩個(gè)細(xì)胞系。1、肝癌患者資料男，46歲，術(shù)前檢查AFP:2733(0-7.0)病毒感染情況:ALT:32u/L，HBsAg:陰，Anti-HBs:陰，HBeAg:陰，Anti-HBe:陽(yáng)，Anti—HBc:陽(yáng)，Anti—HCV:陰，Anti—HIV1/2:陰。2004年2月發(fā)現(xiàn)右肝肝癌，第一次肝癌切除手術(shù)右肝部分切除。腫瘤塊病理檢查診斷肝細(xì)胞癌，腫瘤大小7X5cm可見(jiàn)脈管癌栓切緣未見(jiàn)癌，慢性膽囊炎2004年9月發(fā)現(xiàn)左肝肝癌，第二次肝癌切除手術(shù)2004年9月，肝左外葉切除。腫瘤塊病理檢查診斷肝左外葉肝細(xì)胞性肝癌，II-III級(jí)，大小8X6cm，未見(jiàn)脈管癌栓，肝切緣未見(jiàn)癌。2.腫瘤細(xì)胞建系方法將上述患者第一次肝癌切除手術(shù)和第二次肝癌切除手術(shù)取樣分別按照下述方法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞建系(1)取標(biāo)本第一次肝癌切除手術(shù)和第二次肝癌切除手術(shù)時(shí)分別利用手術(shù)刀取新鮮肝癌組織大約2克，置無(wú)菌50ml離心管，置冰上，從手術(shù)室?guī)У綄?shí)驗(yàn)室；(2)選取組織用剪刀剪去周圍的正常組織和壞死組織；(3)除菌先用含高濃度抗生素(青霉素500u/ml，鏈霉素500u/ml)的生理鹽水沖洗標(biāo)本2次，然后浸泡標(biāo)本20分鐘；(4)機(jī)械分離快速用剪刀剪碎組織，剪至絕大部分均可過(guò)200目鋼網(wǎng)；7(5)梯度f(wàn)icoll純化腫瘤細(xì)胞用含2mMEDTA的HBSS洗兩遍細(xì)胞，然后用含2mMEDTA的HBSS重懸，加到梯度Ficoll(天津?yàn)螽a(chǎn))上面(下面為100%的ficoll，中間為75%(體積百分含量)ficoll+25X(體積百分含量)RPMI1640培養(yǎng)液)。2400rpm離心20分鐘。離心完畢后，吸取75%(體積百分含量)Ficoll和上清界面間的細(xì)胞，這部分細(xì)胞主要是腫瘤細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液洗兩次；(6)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)接種密度大約為0.5IX106/ml左右，接種于24孔板，用含20%(體積百分含量)病人自體血漿的RPMI1640培養(yǎng)。每隔3-4天換液一次，待病人血漿用完后換成普通的胎牛血清；(7)腫瘤細(xì)胞的傳代待細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿24孔板以后，逐步傳至12孔板，6孔板，T25培養(yǎng)瓶，T75培養(yǎng)瓶。傳代時(shí)用含0.5mMEDTA的0.25X(質(zhì)量百分含量)胰酶消化。凍存不同代數(shù)的細(xì)胞并做好代數(shù)紀(jì)錄。凍存液為含有10%(體積百分含量)DMS0的90X(體積百分含量)FBS(fetalbovineserum，胎牛血清)。第一次手術(shù)切除的腫瘤培養(yǎng)的細(xì)胞株命名為人肝癌細(xì)胞株H印-11，第二次手術(shù)切除的腫瘤培養(yǎng)的細(xì)胞株命名為人肝癌細(xì)胞株H印-12。人肝癌細(xì)胞株H印-ll和人肝癌細(xì)胞株H印-12，均已于2009年07月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，人肝癌細(xì)胞株H印-ll的保藏號(hào)為CGMCCN2.3203，人肝癌細(xì)胞株H印-12的保藏號(hào)為CGMCC漁.3204。3、H印-11和H印-12細(xì)胞系的特征觀察H印-ll和H印-12細(xì)胞在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不同(見(jiàn)圖1)。H印-ll細(xì)胞呈多角形貼壁生長(zhǎng)，而H印-12細(xì)胞呈圓形、集落、半懸浮生長(zhǎng)。4、H印-ll和H印-12致瘤特性驗(yàn)證將兩株細(xì)胞H印-ll和H印-12通過(guò)胰酶消化，在含10%的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng))傳代23代后得到的細(xì)胞株，分別種到免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)的肝臟，在接種后每周觀察小鼠，到接種后第6周發(fā)現(xiàn)接種H印-12的小鼠腹部有腫物出現(xiàn)，而接種人肝癌細(xì)胞株H印-ll的小鼠腹部未見(jiàn)腫物出現(xiàn)，生長(zhǎng)正常。到接種后第10周接種H印-12的小鼠腹部腫物增大顯著、并出現(xiàn)消瘦，同時(shí)處死兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取動(dòng)物肝臟。發(fā)現(xiàn)接種H印-ll的小鼠肝臟內(nèi)未見(jiàn)腫瘤，而接種人肝癌細(xì)胞株H印-12的小鼠肝內(nèi)出現(xiàn)巨大腫瘤，見(jiàn)圖2。圖2表明人肝癌細(xì)胞株H印-ll和人肝癌細(xì)胞株H印-12接種免疫缺陷小鼠后10周取實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟，接種H印-ll的小鼠肝臟未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，而接種了H印-12的小鼠肝臟長(zhǎng)出巨大腫瘤。肝細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖是與肝臟內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞提供的微環(huán)境分不開(kāi)的，人肝癌細(xì)胞株H印-ll和人肝癌細(xì)胞株H印-12接種免疫缺陷小鼠的肝臟后表現(xiàn)出的差異，表明這兩株細(xì)胞在肝臟內(nèi)具有不同的生物學(xué)活性，H印-12細(xì)胞較H印-ll細(xì)胞具有更惡性的致瘤特性，反映了這兩株細(xì)胞適合對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行研究。這兩株細(xì)胞可以作為研究肝癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。人肝癌細(xì)胞株H印-ll和人肝癌細(xì)胞株H印-12配合使用可以研究肝癌早期、晚期的發(fā)生機(jī)理，觀察H印-ll和H印-12分別建模的動(dòng)物模型的蛋白表達(dá)差異，克隆相關(guān)基因，并用H印-ll進(jìn)行功能驗(yàn)證，等等，在分子水平上研究影響肝癌發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移的機(jī)理，并將其作為靶標(biāo)篩選抗癌藥物。權(quán)利要求一種人肝癌細(xì)胞株Hep-12CGMCC№.3204。2.權(quán)利要求1所述的人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCCN2.3204在作為肝癌發(fā)生、肝癌發(fā)展或肝癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCCN2.3204在建立肝癌動(dòng)物模型中的應(yīng)用。4.一種研究肝癌的細(xì)胞模型組，由人肝癌細(xì)胞株H印-12CGMCCN2.3204和人肝癌細(xì)胞株H印-11CGMCC漁.3203組成。5.權(quán)利要求4所述的細(xì)胞模型組在研究肝癌發(fā)生機(jī)理和/或篩選治療肝癌藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。該肝癌細(xì)胞系為人肝癌細(xì)胞株Hep-12CGMCCNo.3204。人肝癌細(xì)胞株Hep-12CGMCCNo.3204和人肝癌細(xì)胞株Hep-11CGMCCNo.3203可組成一種用于研究肝癌機(jī)理的細(xì)胞模型組。該肝癌細(xì)胞系具有很好的致瘤特性，可作為肝癌發(fā)生、肝癌發(fā)展或肝癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101693886SQ200910180628公開(kāi)日2010年4月14日申請(qǐng)日期2009年10月26日優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日發(fā)明者杜曉娟,柯楊,王覦,許小蘭,邢寶才申請(qǐng)人:北京腫瘤醫(yī)院;