專(zhuān)利名稱(chēng)：人源抗狂犬病毒中和抗體Fab及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用基因重組技術(shù)，對(duì)人源抗狂 犬病毒scFv抗體進(jìn)行改造，得到一種抗狂犬病毒的中和抗體Fab分子，用于狂犬病的診斷 和治療。
背景技術(shù)：
抗體的研究最早是在血清學(xué)和氨基酸水平上開(kāi)展的，異源性鼠抗體在人體內(nèi)誘生 免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗小鼠抗體；人單克隆雜交瘤制備困難，生產(chǎn)量少，穩(wěn)定性差；獲得特異性 類(lèi)別抗體比較困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)抗體基因的研究和DNA分子重組技術(shù) 的應(yīng)用，使得抗體的研究從細(xì)胞水平進(jìn)入到分子水平，通過(guò)基因改造獲得特異性抗體成為 可能。 當(dāng)前，治療性抗體藥物研發(fā)已成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域的熱點(diǎn)，抗體藥物小型化和 高效化也是時(shí)下的研究重點(diǎn)。抗體Fab片段由重鏈Fd段和完整的輕鏈組成，是完整抗體分 子的三分之一，屬于小分子抗體，具有穿透力強(qiáng)，半衰期短，較scFv更加穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，尤其 適用于人體疾病的診療。 狂犬病治療是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)難題，人類(lèi)一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100%。中和 抗體因其能夠與血液中的狂犬病毒相結(jié)合，阻止病毒感染神經(jīng)細(xì)胞，協(xié)助清除病毒顆粒，從 而抑制狂犬病毒在組織中的擴(kuò)散?？袢《咎堑鞍?G蛋白)是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒免疫保護(hù) 的一種主要抗原，同時(shí)也是誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體并與之反應(yīng)的唯一抗原。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)篩選出一株高親和力的針對(duì)G蛋白 的人源抗狂犬病毒抗體scFv，運(yùn)用基因重組技術(shù)，將scFv的重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)同人 IgGl的CH1， C A進(jìn)行重組，擴(kuò)增Fab片段。構(gòu)建人源Fab抗體片段的原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行 可溶性表達(dá)，建立了表達(dá)蛋白的純化方法，獲得了高純度的具有中和活性的可溶性蛋白，在 狂犬病的診療藥物中具有潛在的應(yīng)用前景。 技術(shù)方案一種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，所述抗體的VH鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR 具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示的CDR1 ;SEQ ID NO. 2所示的CDR2 ;SEQ ID NO. 3所示的CDR3 ;并且所述抗體的、鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列 SEQ ID NO. 5所示的CDR5 ;SEQ ID NO. 6所示的CDR6 ;SEQ ID NO. 7所示的CDR7。所述抗 體的VH鏈具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，、鏈具有如SEQ ID NO. 8所示的氨基酸 序列。 一種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，所述抗體Fd鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所 示，抗體L鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。 一種DNA分子，編碼人源抗狂犬病毒中 和抗體Fab氨基酸序列。 一種DNA分子，如SEQ ID NO. 11所示編碼人源抗狂犬病毒中和抗 體Fab Fd鏈的氨基酸序列氨基酸序列，如SEQ ID NO. 12所示編碼人源抗狂犬病毒中和抗 體Fab L鏈的氨基酸序列氨基酸序列。 一種藥物組合物，含有上述任一條所述的單克隆抗
3體和藥學(xué)上可接受的載體。 有益效果本發(fā)明是利用基因重組技術(shù)對(duì)一株人源的抗狂犬病毒抗體ScFv進(jìn)行 改造，即將scFv的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)分別和人Ig&抗體的CHI和片段重組，再 通過(guò)重疊延伸PCR擴(kuò)增到一個(gè)全長(zhǎng)為1. 6kb左右的抗狂犬病毒Fab抗體片段的核苷酸片段 Fab抗體片段的核苷酸片段和原核表達(dá)質(zhì)粒pComb3XSS分別用Sf il限制性?xún)?nèi)切酶酶切后進(jìn) 行連接，構(gòu)建嵌合Fab片段的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F'后誘導(dǎo)表達(dá)Fab抗體片 段，其中Fd段分子量約為34KD，嵌合L鏈分子量約為26KD，兩者通過(guò)鏈間二硫鍵連接組成 人源抗狂犬病毒抗體Fab分子。該蛋白在用于狂犬病診療藥物中具有潛在的應(yīng)用前景。
圖1 :人源抗狂犬病單克隆抗體VH， 、， Fd， L鏈和Fab基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳； 1 :DNA Marker (TaKaRa， DL2000) 2-6 :依次為VH， VL， Fd， L鏈和Fab基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
圖2 :以pComb3X A為模板擴(kuò)增的人IgGl的輕鏈恒定區(qū)及重鏈恒定區(qū)1片段電泳 結(jié)果;1 :DNA Marker (TaKaRa， DL2000) 2 :人C入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 :人IgGl的CHI的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物 圖3 :以純化的Fab為抗原，標(biāo)記HRP的羊抗人Fab抗體的WB結(jié)果；1 :純化的Fab 片段2 :Protein Marker (fermatas， #0441) 圖4 :Fab純化蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果；1 :純化的Fab片段2 : ProteinMarker(fermatas， #0671) 圖5 :以狂犬病毒CTN為抗原，抗狂犬病毒抗體Fab分子為一抗的ELISA結(jié)果圖； 1-7 :倍比稀釋Fab (0. 2 g) 5 X至320 X ， 8 :陽(yáng)性參照9 :陰性參照?qǐng)D6 :以狂犬病毒CTN為 抗原，抗狂犬病毒抗體Fab分子為一抗的WB結(jié)果；1 :60KD大小處為狂犬病毒糖蛋白，26KD 大小處為狂犬病毒基質(zhì)蛋白。2 :Protein Marker
圖7 :質(zhì)譜圖?？袢《净|(zhì)蛋白；
圖8 :狂犬病毒糖蛋白；
圖9 :質(zhì)粒pComb3X A圖譜；
圖10 :質(zhì)粒pComb3XSS圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中如無(wú)特別說(shuō)明，各物質(zhì)濃度均為質(zhì)量比濃度， 實(shí)施例1. l)Fab基因的擴(kuò)增 噬菌體抗體展示技術(shù)進(jìn)行抗體庫(kù)的篩選過(guò)程如下 (1)用滅活的狂犬病毒CTN(武漢生物制劑研究所饋贈(zèng))為抗原(5 g/mL)包被6
孔板，包被液為PBS (pH7. 4) ， fC包板過(guò)夜。 (2) PBS洗滌6孔板3次，每次5min。 (3)在6孔板中加滿2% BSA， 37"封閉2h。 (4)去除封閉液，加入擴(kuò)增的噬菌體抗體，37t:孵育2h。 (5)去除未結(jié)合的噬菌體抗體，PBST緩沖液洗滌6孔板10次(第一輪洗滌10次，
4以后每輪洗滌20次)。 (6) lmg/mL胰蛋白酶500 yl加入6孔板，37"孵育30min，反復(fù)吹打，洗脫特異性 結(jié)合的噬菌體抗體。 (7) 500 ii 1洗脫液感染3. 5mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期E. coli TG1， 37。C水浴30min。
(8)滴定洗脫噬菌體的數(shù)量 a.取上一步菌液40 iU加入360 iU 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。
b.取a液4 iil加入396 ill 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。
c.取b液4 ill加入396 ill 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。
d.取c液4 ill加入396 ill 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。 e.將b、 c、 d液各取100 ii 1鋪于TYE培養(yǎng)板上(含終濃度100 ii g/mL Amp) ， 37°C 培養(yǎng)過(guò)夜。 (9)將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液以lOOOOg離心5min，去上清，沉淀用lmL 2XTY培養(yǎng)基重 懸，混勻后鋪于TYE培養(yǎng)板上，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。 (10)次日，TYE培養(yǎng)板上加入2mL 2XTY培養(yǎng)基(含終濃度15wt^甘油)，用玻璃 推子輕刮下所有菌落，混勻。 (11)取50 iil菌液加入50mL 2XTY培養(yǎng)基(含終濃度100 y g/mL Amp+lwt^葡 萄糖)，250rpm， 37"振搖培養(yǎng)至0D6。。 約為0. 4。其余菌液加入終濃度15%甘油，-7(TC保存。 (12)從50mL 2XTY培養(yǎng)基中取10mL，加入5X 1(Tpfu輔助噬菌體KM13， 37。C水 浴30min。 (13)3300g離心30min，去上清，沉淀用50mL 2XTY培養(yǎng)基(含終濃度100 y g/ mLAmp+50 ii g/mL Kana+O. 1%葡萄糖)重懸，250rpm， 30。C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。
(14)3300g離心15min，收集上清約40mL，加入10mL PEG/Nacl溶液，混勻后置于冰 上lh。 (15) 3300g離心30min，沉淀用2mL PBS重懸，充分混勻。 (16) 10800g離心10min，取上清約2mL。參照方法2 (7)，滴定加入噬菌體的數(shù)量， lmL上清用于下一輪篩選，剩余約lmL上清置于fC保存。 (17)重復(fù)以上篩選步驟，共進(jìn)行五輪"吸附_洗脫_擴(kuò)增"富集篩選并經(jīng)ELISA鑒 定。 篩選獲得的scFv的DNA序列如下
①VH的核苷酸序列為 GAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATTAATCGTT CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC CGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAAGACGCGGCGTTTTGACTA CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC VH對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為
ELLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINRSGD ITTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKTRRFDYWGQG TLVTVSS 下劃線部分為三個(gè)CDR區(qū)。 ②、的核苷酸序列為 CTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGA GGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCT GCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
、對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為
GNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGDYTPGVVFGGGTKLTVL
下劃線部分為三個(gè)CDR區(qū) 以scFv基因?yàn)槟０澹靡唤M擴(kuò)增人源抗體的上游引物和下游引物擴(kuò)增Fab的重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因。VH的上游引物是VHF :5'-GCT GCC CAA CCAGCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG_3，，下游引物為VHR :5，-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGTTCC_3'。在V/的5'端引入了和人IgGl的C A下游引物互補(bǔ) 的21個(gè)堿基序列即斜體部分序列，VHR的5'端引入了和人IgGl的CHI上游引物互補(bǔ)的 21個(gè)堿基序列，即斜體部分，以利于抗狂犬病毒抗體的VH與人IgGl的CHI片段的重疊PCR 擴(kuò)增。VL的上游引物為VLF :5'-GGG CCC AGG CGG CCC AGT CTGCCC TGA CTC AGC CTC GCT CAG TGT CCG GG_3，，下游引物為VLR :5，-CGAGGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCCGCC GAA AAC CAC-3'，在VJ7的5'端引入了 Sfil的酶切識(shí)別位點(diǎn)即 下劃線部分序列，、R的5'端引入了與人的C A上游引物5'端互補(bǔ)的21個(gè)堿基即斜體部 分序列，以、與人IgGl的C A片段的重疊PCR擴(kuò)增擴(kuò)增條件為94t:變性30s — 6(TC退火 30s — 72t:延伸60s，共循環(huán)25次。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后，過(guò)DNA純化柱純化(圖 1)。 (1)人IgGl抗體的CHI和C A段的擴(kuò)增 以質(zhì)粒pComb3X入(由scripps institute饋貝曾，圖9)為 模板，分別擴(kuò)增人IgGl抗體的和CHI核苷酸片段；CA段的上 游弓l 物為C入F:5 ' _CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC_3 '， 下游弓| 物 為C入R:5 ' -GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3 ' ;CH1的上游引物為CH1F : 5' -GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下游引物為CH1R :AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'。擴(kuò) 增條件均為95°C 4分鐘；94。C 30秒，60。C 30秒，72。C 60秒，25個(gè)循環(huán)；72。C延伸10分鐘， 瓊脂糖凝膠電泳，分別擴(kuò)增出約350bp的條帶(見(jiàn)圖2)，膠回收純化擴(kuò)增條帶，溶于去離子 水內(nèi)，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?
(2)L鏈、Fd段基因片段的擴(kuò)增
以擴(kuò)增的人源抗狂犬病毒抗體的、及人IgGl抗體的C A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板， 用上游引物L(fēng)F : 5 ' -GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3 '和下游引物L(fēng)R : 5' -GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3 '進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增L鏈，擴(kuò)增條件為95°C ， 4分鐘； 94°C， 15秒、56t:， 15秒、72t:，2分鐘，15個(gè)循環(huán)；72。C，延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò) 增出約750bp的條帶(見(jiàn)圖1)，膠回收擴(kuò)增條帶，溶于去離子水內(nèi)，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?
以擴(kuò)增的人源抗狂犬病毒抗體的Vh及人IgGl抗體的CH1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板， 用上游引物FdF : 5' -GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3'和下游弓|物 FdR :5' -AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增Fd片段，擴(kuò)增條件為95°C ， 4分鐘；94°C ， 15秒、56t: ， 15秒、72。C ， 30秒，15個(gè)循環(huán)；72°C ，延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電 泳，擴(kuò)增出約750bp的條帶(見(jiàn)圖1)，膠回收擴(kuò)增條帶，溶于去離子水內(nèi)，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?
(3)Fab基因片段的擴(kuò)增 以擴(kuò)增獲得的Fd段和L鏈核苷酸序列的膠回收純化產(chǎn)物為模板，用上游引 物FabF :5 ' -GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3 ' 和下游弓|物FabR : 5' -AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3 '進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)，先不加引物，94°C 4分 鐘；94°C 50秒、56t: 50秒、72。C 3分鐘，6個(gè)循環(huán)；而后加入FabF、FabR引物后94°C 50秒、 56°C 50秒、72t: 2分鐘，20個(gè)循環(huán)；72。C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出約1. 6kb的 條帶(見(jiàn)圖1)，膠回收純化擴(kuò)增條帶，溶于去離子水內(nèi)，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?
3) Fab原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 提取質(zhì)粒pComb3XSS(由scri卯s institute饋贈(zèng)，圖10)，質(zhì)粒及Fab片段的PCR 膠回收產(chǎn)物用Sfil限制性?xún)?nèi)切酶在5(TC酶切12-16h，電泳后膠回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶 于去離子水中。取pComb3XSS、Fab擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物按1 :4摩爾比混勻，在同一離心管 內(nèi)用T4連接酶16。C連接12-16h。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌T0P10F'，涂布含氨芐青霉素(100 y g/mL) LB平 板，置37t: 12-16h。次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照菌，37t:搖菌3.5小時(shí)后，分 別用Fab的特異引物對(duì)對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，含有插入Fab片段質(zhì)粒的菌株擴(kuò)增出一 條約1. 6kb左右的條帶。菌液PCR驗(yàn)證擴(kuò)增出大小正確條帶的菌液送生物公司進(jìn)行測(cè)序， DNA序列分析證實(shí)在重組質(zhì)粒中含有構(gòu)建的嵌合Fab片段，序列正確，其中橫線部分為前導(dǎo) 序列pelB，方框內(nèi)TAA為L(zhǎng)鏈翻譯終止密碼子(1615bp)
CGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTC .ItaaI1 TTCTAGATAATTAATTAGGAG
CCTCCTCCTCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG 將含有正確重組質(zhì)粒的菌液按1 : 100轉(zhuǎn)入2mL LB溶液中，氨芐青霉素工作濃度 為100 ii g/mL， 37。C搖菌過(guò)夜；過(guò)夜的細(xì)菌lOOOOg離心15分鐘，棄去上清液，而后用2mL SB 重懸，將重懸后的菌液按1 : 100轉(zhuǎn)入2mLLB中(氨芐青霉素終濃度為100 y g/mL) ， 37。C培 養(yǎng)0D600 = 1. O左右，加入異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmmol/L， 25。C振 蕩培養(yǎng)20h。離心收集菌體，分別處理培養(yǎng)上清、菌體超聲上清及超聲沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE 及western-blot檢測(cè)，結(jié)果Fab片段在菌體超聲上清及超聲沉淀中均有表達(dá)，其中可溶性 蛋白存在于菌體超聲上清中，F(xiàn)d段分子量約為34KD， L段分子量約為26KD。
4)表達(dá)蛋白的純化 細(xì)菌大量誘導(dǎo)表達(dá)后菌液lOOOOg離心15分鐘，棄培養(yǎng)上清，沉淀中加入原菌液 1/10體積的20mM磷酸鹽平衡緩沖液(含0. 5M/L NaCl， 10mM咪唑)，將細(xì)菌重懸；而后對(duì) 菌液進(jìn)行超聲，超5秒，停5秒，共超40分鐘，而后4°C 12000rpm離心30分鐘，棄沉淀，超 聲上清用0. 22 m濾膜過(guò)濾，然后用lmLHistr即HP柱子進(jìn)行純化。先用用5倍柱體積 的水以lmL/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱子，然后以 lmL/min的速度上樣；用平衡緩沖液平衡鎳柱至基線，分別用5倍柱體積的含50mM、100mM、 200mM、 300mM、 400mM、 500mM咪唑的緩沖液洗柱子，并收集相應(yīng)濃度咪唑的洗脫液，進(jìn)行 12% SDS-PAGE電泳及Western blot，觀察蛋白純化情況(見(jiàn)圖3，4)。結(jié)果含lOOmM咪唑 的洗脫液中見(jiàn)純化的Fab蛋白，用10KD的millpore超濾柱子進(jìn)行除鹽濃縮，PBS洗3次。
實(shí)施例2Fab抗體片段的活性鑒定
I酶聯(lián)免疫法 用包被液(0. 1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)稀釋狂犬病毒CTN(武漢生物制劑研究 所饋贈(zèng))至2ii g/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入50 yl， 4 °C過(guò)夜；PBST(PBS含0. 5 % Tween20) 5% BSA洗滌緩沖液封閉，37。C孵育2h ;PBST洗滌5次后，每個(gè)孔中加入50 抗狂犬病毒Fab分子(200 g/mL起始濃度，7個(gè)濃度梯度稀釋)4"C過(guò)夜；以1 : 2000稀釋的 羊抗人Fab 二抗50iil/孔加入到孔內(nèi)，37t:孵育30分鐘；過(guò)氧化物酶底物顯色液50 yl/ 孑L室溫下15分鐘后用2M硫酸中止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)比色采用雙波長(zhǎng)450nm/630nm。結(jié)果如 圖5示，F(xiàn)ab抗體片段能與狂犬病毒CTN起抗原抗體反應(yīng)。
II免疫印跡法 取20iU狂犬病毒CTN進(jìn)行SDS page,并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用5wt%的脫脂奶
粉封4t:閉過(guò)夜，純化的Fab 1 : 100稀釋作為一抗室溫至于脫色搖床上2h，1 : 2000稀釋
的HRP標(biāo)記的羊抗人IgGFab作為二抗，室溫至于脫色搖床上2h。 DAB顯色。可見(jiàn)有兩條清
晰的條帶大小分別為24KD，60KD左右(圖6) 。 MS質(zhì)譜指紋分析結(jié)果顯示(圖7 8) :24KD
大小處對(duì)應(yīng)的為狂犬病毒屬基質(zhì)蛋白，60KD大小處對(duì)應(yīng)的是狂犬病毒屬糖蛋白。 以上結(jié)果顯示制備的人源抗狂犬病毒抗體Fab能夠特異地與狂犬病毒結(jié)合，并具
有較高的中和活性。 本發(fā)明與以往技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn) (1)全人源抗體克服了鼠源抗體的HAMA反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)。 (2)小分子抗體Fab較scFv具有更長(zhǎng)的半衰期，穩(wěn)定性更強(qiáng)。 (3)原核表達(dá)載體易于構(gòu)建，可大量表達(dá)，生產(chǎn)快速且便于純化。 (4)具有中和活性的Fab，能夠進(jìn)一步改造為全分子IgG，可用于人類(lèi)狂犬病的臨
床治療的研究。
實(shí)施例3: 狂犬病熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN) Fab按31，32，33， 312進(jìn)行稀釋?zhuān)患尤?00TCID5。的CVS-11在37。C濕化培養(yǎng)箱 (5% C02)感作60min ;然后加入BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)48h ;丙酮固定細(xì)胞后，加熒光標(biāo)記抗狂 犬病毒抗體染色，熒光顯微鏡下讀取結(jié)果。以100TCID5。CVS-11的復(fù)制完全被抑制(即沒(méi)有 一個(gè)熒光細(xì)胞)作為最終抑制效價(jià)判定結(jié)果，以0. 5IU/mL作為狂犬病最低保護(hù)單位，制備 的Fab中和效價(jià)約為10. 26IU/mL，顯示中和抗體陽(yáng)性。
序列表 〈110〉中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所 〈120〉人源抗狂犬病毒中和抗體Fab及其制備方法和應(yīng)用 〈130〉 〈141>2009-10-09 〈160>12 〈170>PatentIn version 3.3 〈210>1 〈211>8 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈400〉 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
〈210>20138]〈211>8
0139]〈212>PRT
0140]〈213〉人工序列
0141]〈400>2
0142]lie Asn Arg Ser Gly Asp lie
0143]〈210>3
0144]〈211>9
0145]〈212>PRT
0146]〈213〉人工序列
0147]〈400>3
0148]Ala Lys Lys Thr Arg Arg Phe
0149]〈210>4
0150]〈211>114
0151]〈212>PRT
0152]〈213〉人工序列
0153]〈400>4
0154]Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly
0155]Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
0156]Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro
0157]lie Asn Arg Ser Gly Asp lie
0158]Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp
0159]Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
0160]Lys Thr Arg Arg Phe Asp Tyr
0161]Ser Ser
0162]〈210>5
0163]〈211>9
0164]〈212>PRT
0165]〈213〉人工序列
0166]〈400>5
0167]Ser Ser Asp lie Gly Gly Tyr
0168]〈210>6
0169]〈211>3
0170]〈212>PRT
0171]〈213〉人工序列
0172]〈400>6
0173]Asp Ala Thr
0174]〈210>7
0175]〈211>12
0176]〈212>PRT
Thr
Asp Tyr
GlyLeuValGinProGlyGlySerLeu
GlyPheThrPheSerSerTyrAlaMet
GlyLysGlyLeuGluTrpValSerSer
ThrThrTyrAlaAspSerValLysGly
AsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGin
AspThrAlaValTyrTyrCysAlaLys
TrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal
Asn Phe0177]〈213〉人工序列0178]〈400>7
0179]Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr0180]〈210>8
0181]〈211>112
0182]〈212>PRT
0183]〈213〉人工序列0184]〈400>8
0185]GluSerAlaLeu Thr Gin Pro
0186]SerValThrlie Ser Cys Thr
0187]AsnPheValSer Trp Tyr Gin
0188]MetlieTyrAsp Ala Thr Lys
0189]SerGlySerLys Ser Gly Asn
0190]GinAlaGluAsp Glu Ala Asp
0191]TyrThrProGly Val Val Phe
0192]〈210>9
0193]〈211>226
0194]〈212>PRT
0195]〈213〉人工序列0196]〈400>9
0197]GluLeuLeuGlu Ser Gly Gly
0198]ArgLeuSerCys Ala Ala Ser
0199]SerTrpValArg Gin Ala Pro
0200]lieAsnArgSer Gly Asp lie
0201]ArgPheThrlie Ser Arg Asp
0202]MetAsnSerLeu Arg Ala Glu
0203]LysThrArgArg Phe Asp Tyr
0204]SerSerAlaSer Thr Lys Gly
0205]SerLysSerThr Ser Gly Gly
0206]AspTyrPhePro Glu Pro Val
0207]ThrSerGlyVal His Thr Phe
0208]TyrSerLeuSer Ser Val Val
0209]GinThrTyrlie Cys Asn Val
0210]AspLysLysVal Glu Pro Lys
0211]GlyGin
0212]〈210>10
0213]〈211>218
0214]〈212>PRT
0215]〈213〉人工序列ThrProGlyValVal
ArgSerValSerGlySerProGlyGin
GlyThrSerSerAsplieGlyGlyTyr
GinHisProGlyLysAlaProLysLeu
ArgProSerGlyValProAspArgPhe
ThrAlaSerLeuThrlieSerGlyLeu
TyrTyrCysCysSerTyrAlaGlyAsp
GlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
GlyLeuValGinProGlyGlySerLeu
GlyPheThrPheSerSerTyrAlaMet
GlyLysGlyLeuGluTrpValSerSer
ThrThrTyrAlaAspSerValLysGly
AsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGin
AspThrAlaValTyrTyrCysAlaLys
TrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal
ProSerValPheProLeuAlaProSer
ThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
ThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeu
ProAlaValLeuGinSerSerGlyLeu
ThrValProSerSerSerLeuGlyThr
AsnHisLysProSerAsnThrLysVal
SerCysAspLysThrSerGlyGinAla
11
〈400>10GluSerAlaLeuThrGinProArgSerValSerGlySerProGlyGinSerValThrlieSerCysThrGlyThrSerSerAsplieGlyGlyTyrAsnPheValSerTrpTyrGinGinHisProGlyLysAlaProLysLeuMetlieTyrAspAlaThrLysArgProSerGlyValProAspArgPheSerGlySerLysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrlieSerGlyLeuGinAlaGluAspGluAlaAspTyrTyrCysCysSerTyrAlaGlyAspTyrThrProGlyValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGinProLysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSerGluGluLeuGinAlaAsnLysAlaThrLeuValCysLeulieSerAspPheTyrProGlyAlaValThrValAlaTrpLysAlaAspGlySerProValLysAlaGlyValGluThrThrThrProSerLysGinSerAsnAsnLysTyrAlaAlaSerSerTyrLeuSerLeuThrProGluGinTrpLysSerHisArgSerTyrSerCysGinValThrHisGluGlySerThrValGluLysThrValAlaProThrGluCysSer 〈210>11 〈211>678 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 11 1 GAGCTGTTGG 61 GCAGCCTCTG 121 AAGGGGCTGG 181 TCCGTGAAGG 241 ATGAACAGCC 301 TTTGACTACT 361 TCGGTCTTCC 421 TGCCTGGTTA 481 ACCAGCGGCG 541 AGCGTGGTGA 601 CACAAGCCCA 661 AGTGGCCAGG 〈210>12 〈211>654 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>12 1 GAGTCTGCCC 61 TCCTGCACTG
AGTCTGGGGG GATTCACCTT AGTGGGTCTC GCAGGTTCAC TGAGAGCCGA GGGGCCAGGG CCCTGGCACC AGGACTACTT TGCACACCTT CCGTGCCCTC GCAACACCAA CCGGCCAG
AGGCTTGGTA TAGCAGCTAT ATCGATTAAT CATCTCCAGA GGACACGGCC AACCCTGGTC CTCCTCCAAG CCCCGAACCG CCCGGCTGTC CAGCAGCTTG GGTGGACAAG
CAGCCTGGGG GCCATGAGCT CGTTCTGGTG GACAATTCCA GTATATTACT ACCGTCTCGA AGCACCTCTG GTGACGGTGT CTACAGTCCT GGCACCCAGA AAAGTTGAGC
GGTCCCTGAG GGGTCCGCCA ATATTACAAC AGAACACGCT GTGCGAAAAA GCGCCTCCAC GGGGCACAGC CGTGGAACTC CAGGACTCTA CCTACATCTG CCAAATCTTG
ACTCTCCTGT GGCTCCAGGG GTACGCAGAC GTATCTGCAA GACGCGGCGT CAAGGGCCCA GGCCCTGGGC AGGCGCCCTG CTCCCTCAGC CAACGTGAAT TGACAAAACT
TGACTCAGCC GAACCAGCAG
TCGCTCAGTG TGATATTGGT
TCCGGGTCTC GGTTATAACT
CTGGACAGTC AGTCACCATC TTGTCTCCTG GTACCAACAA
121CACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGCCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTC181CCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTC241CAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCAGGCGACTACACCCCGGGC301GTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCG361GTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGT421CTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCC481GTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCC541AGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAG601GTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
權(quán)利要求
一種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，其特征在于，所述抗體的VH鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQ IDNO.1所示的CDR1；SEQ ID NO.2所示的CDR2；SEQ ID NO.3所示的CDR3；并且所述抗體的VL鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO.5所示的CDR5；SEQ ID NO.6所示的CDR6；SEQ ID NO.7所示的CDR7。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，其特征在于，所述抗體的VH鏈 具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，、鏈具有如SEQID NO. 8所示的氨基酸序列。
3. —種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，其特征在于，所述抗體Fd鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，抗體L鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
4. 一種DNA分子，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述人源抗狂犬病毒中和抗體Fab氨基 酸序列。
5. —種DNA分子，其特征在于，編碼權(quán)利要求2所述人源抗狂犬病毒中和抗體Fab氨基 酸序列。
6. —種DNA分子，其特征在于，如SEQ ID NO. 11所示編碼權(quán)利要求3所述人源抗狂犬 病毒中和抗體Fab Fd鏈的氨基酸序列氨基酸序列，如SEQID NO. 12所示編碼權(quán)利要求3所 述人源抗狂犬病毒中和抗體Fab L鏈的氨基酸序列氨基酸序列。
7. —種藥物組合物，其特征在于含有上述權(quán)利要求任一條所述的單克隆抗體和藥學(xué)上 可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)篩選出一株高親和力的針對(duì)G蛋白的人源抗狂犬病毒抗體scFv，運(yùn)用基因重組技術(shù)，將scFv的重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)同人IgG1的CH1，Cλ進(jìn)行重組，擴(kuò)增Fab片段。構(gòu)建人源Fab抗體片段的原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行可溶性表達(dá)，建立了表達(dá)蛋白的純化方法，獲得了高純度的具有中和活性的可溶性蛋白，在狂犬病的診療藥物中具有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/13GK101696242SQ200910180629
公開(kāi)日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者朱進(jìn), 李琛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所;