專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于.基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸(microRNA，miRNA)標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：不孕不育是一類(lèi)常見(jiàn)的生殖疾病，在我國(guó)育齡夫婦中的發(fā)病率約為10%。其中有近一半與男方因素有關(guān)，由此被稱(chēng)為男性不育。在所有導(dǎo)致男性不育病因中，精子生成障礙是最為常見(jiàn)的病因，也是我國(guó)成年男性生殖健康面臨的最主要威脅之一。精子生成障礙的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程，主要臨床表現(xiàn)為射出精液中精子密度的降低，按WHO標(biāo)準(zhǔn)可分為少精子癥、無(wú)精子癥等(WHO定義無(wú)精子癥顯微鏡檢未見(jiàn)精子的標(biāo)本，經(jīng)離心/15min,3000卬m仍無(wú)精子)。目前，對(duì)于精子生成障礙程度的評(píng)估主要依靠常規(guī)的精子密度判別(人工計(jì)數(shù)或利用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)分析，即CASA)，尚無(wú)其他有效的手段。而常規(guī)的精子密度分析也存在以下缺點(diǎn)個(gè)體精液質(zhì)量波動(dòng)較大，尤其易受到禁欲天數(shù)、溫度、采集精液方法等因素的影響，從而造成精子密度測(cè)量不準(zhǔn)確；無(wú)法及時(shí)反映治療后的結(jié)果，且不易進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)相應(yīng)疾病的早期診斷效果也遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需要；更為重要的是，無(wú)精子癥的明確診斷常需進(jìn)行睪丸穿刺活檢，這給尋求生育幫助的人群帶來(lái)極大的痛苦。盡管目前國(guó)內(nèi)外研究者正努力探索新的精子生成障礙評(píng)估和監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物，并對(duì)現(xiàn)有評(píng)估手段進(jìn)行有效的補(bǔ)充，但一直難以突破傳統(tǒng)生物標(biāo)志物發(fā)展和男性生殖實(shí)際應(yīng)用中的瓶頸，即有創(chuàng)穿刺活檢、精液質(zhì)量分析結(jié)果波動(dòng)、以及早期診斷/動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)困難。綜上所述，由于精子生成障礙起病比較隱匿，現(xiàn)有診療手段還存在一些不足，發(fā)現(xiàn)、應(yīng)用新的診斷、監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物是本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。另外，精子生成障礙的病因還不清楚，尚缺乏有效的治療手段，大多數(shù)精子生成障礙病人只能選擇ICSI或AID等輔助生育手段，無(wú)法滿(mǎn)足心理上的要求，并有可能出現(xiàn)后代的遺傳缺陷。這就要求我們尋找到靈敏、特異、易于檢測(cè)的標(biāo)志物，這些新的標(biāo)志物及其指標(biāo)變化也可以作為相應(yīng)疾病藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療的新途徑。微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點(diǎn)，它是一類(lèi)長(zhǎng)約19-23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，多位于基因組非編碼區(qū)，進(jìn)化上高度保守，可在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)，如生物個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞凋亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時(shí)也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。p參與調(diào)控線蟲(chóng)時(shí)序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，miRNA已逐漸成為調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯的研究熱點(diǎn)，分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破?，F(xiàn)在預(yù)測(cè)miRNA至少能調(diào)控5300個(gè)人類(lèi)基因，也就是所有基因的30%。隨著研究的深入，越來(lái)越多的miRNA.被發(fā)現(xiàn)。目前，miRNA與腫瘤的關(guān)系己成為研究的重點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過(guò)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)與慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌高度相關(guān)。然而，miRNA與男性生殖尤其是精液質(zhì)量的關(guān)系研究仍十分罕見(jiàn)，目前僅有極少量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而未見(jiàn)人類(lèi)精漿miRNA水平的研究。最新的研究成果發(fā)現(xiàn)血清/血漿中存在上百種的miRNA，性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測(cè)，且存在顯著的疾病特異性，在肺癌、結(jié)腸癌中已經(jīng)證實(shí)血清miRNA的表達(dá)譜可作為早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。這一發(fā)現(xiàn)令人振奮，血清miRNA作為一類(lèi)非編碼調(diào)節(jié)性的小分子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標(biāo)志物，開(kāi)拓了生物標(biāo)志物的新境界。該研究迅速引起國(guó)際媒體的廣泛關(guān)注，路透社、合眾社、《科學(xué)的美國(guó)人》、美國(guó)《技術(shù)評(píng)論》等都對(duì)該研究成果進(jìn)行了專(zhuān)門(mén)報(bào)道，《Nature》雜志也在其網(wǎng)站首頁(yè)的"最新研究進(jìn)展"專(zhuān)欄中展示了這一最新研究進(jìn)展。然而同樣作為體液的精漿還未得到相應(yīng)的關(guān)注，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與精子生成障礙相關(guān)的特異精漿miRNA作為生物標(biāo)志物，并研發(fā)相應(yīng)疾病的診斷、監(jiān)測(cè)試劑盒，不僅在該領(lǐng)域處于國(guó)際領(lǐng)先地位，可創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)我國(guó)男性生殖健康也將是一次強(qiáng)有力的推動(dòng)。目前，對(duì)精子生成障礙程度的評(píng)估多局限于常規(guī)精液分析，易出現(xiàn)結(jié)果的波動(dòng)，且難以早期診斷和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)于無(wú)精子癥的確診還有賴(lài)于睪丸穿刺活檢。迄今為止，還未見(jiàn)關(guān)于精漿miRNA用于精液質(zhì)量和男性生殖功能的評(píng)價(jià)與治療方面的任何報(bào)道，尤其是精漿miRNA在精子生成障礙如少精子癥和無(wú)精子癥的評(píng)價(jià)與診療方面。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿microRNA標(biāo)志物。4本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述精漿microRNA標(biāo)志物或其引物的應(yīng)用。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有上述精漿microRNA標(biāo)志物或其引物的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒。本發(fā)明人通過(guò)分離和比較正常生育健康男性、少精子癥男性、無(wú)精子癥男性精漿中的miRNAs，發(fā)現(xiàn)了精漿中存在可用于評(píng)估精子生成障礙程度的高效率、高特異性和高敏感性的miRNA及其組合，在精子生成障礙組(即發(fā)生精子數(shù)目減少的組)中這幾個(gè)microRNA的表達(dá)量均較高，因而提出了精子生成障礙相關(guān)的精漿microRNA標(biāo)志物，以及該精漿microRNA標(biāo)志物或其引物在制備精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用，研制出可便于臨床應(yīng)用的精子生成障礙診斷、監(jiān)測(cè)試劑盒。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿microRNA標(biāo)志物，選自SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4中一種或多種。.所述的精漿microRNA標(biāo)志物由SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4構(gòu)成。所述的精漿microRNA標(biāo)志物在制備精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。所述試劑是能夠測(cè)定這些精漿microRNA標(biāo)志物在精漿中表達(dá)量的試劑。所述的精漿microRNA標(biāo)志物的引物，其中序列為SEQIDNo.2的標(biāo)志物的上游引物為SEQIDNo.7，下游引物為SEQIDNo.8;序列為SEQIDNo.3的標(biāo)志物的上游引物為SEQIDNo.9，下游引物為SEQIDNo.10;序列為SEQIDNo.4的標(biāo)志物的上游引物為SEQIDNo.ll，下游引物為SEQIDNo.12。上述精漿microRNA標(biāo)志物的任意一對(duì)引物在制備精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。—種精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，該試劑盒含有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4中一種或多種精漿microRNA標(biāo)志物的引物。所述的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，該試劑盒含有SEQIDNo.7和SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.lO、SEQIDNo.ll和SEQIDNo.12中的一對(duì)或多對(duì)。所述的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，該試劑盒中引物為SEQIDNo.7和SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10、以及SEQIDNo.ll和SEQIDNo.12。試劑盒中除引物外的其他試劑可采用現(xiàn)有技術(shù)中相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的常用試劑。更進(jìn)一步，本發(fā)明所述的精子生成障礙為原發(fā)性精子生成障礙或原因不明的精子生成障礙，即所選精子生成障礙樣本排除了感染、藥物、內(nèi)分泌、梗阻等導(dǎo)致精子生成障礙的因素。本發(fā)明詳細(xì)描述如下-本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的精液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了RT-PCR方法、Real-timePCR(Eva-Green,Taqman探針)方法的一種或幾種進(jìn)行檢測(cè)。具體來(lái)說(shuō)研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分一、研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)A組健康生育男性對(duì)'照組(n=96):1.年齡在24至34歲間；2.無(wú)生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。?.無(wú)其它全身性疾?。?.性功能正常；5.精液質(zhì)量正常；6.—年內(nèi)有正常生育史。B組少精子癥組(n=96):1.年齡在24至34歲間；2.男性不育一年以上；3.除少精子外無(wú)其他生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；4.無(wú)其它全身性疾??；5.性功能正常；6.精子密度低于20x106/1111，排除無(wú)精子癥。C組無(wú)精子癥組(n=96):1.年齡在24至34歲間；2.男性不育一年以上；3.除無(wú)精子外無(wú)其他生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；4.無(wú)其它全身性疾??；5.性功能正常；6.—次射精精液經(jīng)離心無(wú)精子，排除梗阻性病因；7.重復(fù)精液質(zhì)量檢測(cè)/睪丸穿刺活檢，確診為無(wú)精子癥。二、精漿精子分離及前處理6(1)從-70'C冰箱取出冷凍精液后，將精液在37'C水浴使精液完全融解，15000轉(zhuǎn)離心10min，取上清500pl至一潔凈1.5mlEP管中。(2)向EP管中加入500W飽和酚，12000轉(zhuǎn)離心30min，立即取上清至一潔凈1.5mlEP管中。(3)向EP管中加入500W三氯甲垸，12000轉(zhuǎn)離心15min，取上清至一潔凈1.5mlEP管中。(4)重復(fù)步驟(2)、(3)兩次，離心均為12000轉(zhuǎn)15min。(5)-20'C保存處理后的樣本。三、Real-timePCR方法測(cè)量精漿miRNAs表達(dá)量取經(jīng)前處理的精漿，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品。設(shè)計(jì)目標(biāo)miRNAs引物基于組織特異性，根據(jù)文獻(xiàn)的篩選并確定4條miRNAs，運(yùn)用Stem-loopPCR方法設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)。加入熒光探針(TaqmanProbe)進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)。檢測(cè)并比較健康生育男性對(duì)照、少精子癥、無(wú)精子癥人群精漿樣本中miRNAs表達(dá)量的差異。檢測(cè)到的存在差異表達(dá)的健康生育男性對(duì)照和精子生成障礙患者精漿miRNAs包括has-let-7a(SEQIDNo.1)、has-miR-17(SEQIDNo.2)、has-miR-19b(SEQIDNo.3)、has-miR-411(SEQIDNo.4)。這些miRNAs在無(wú)精子癥患者中的拷貝數(shù)都顯著高于少精子組和健康對(duì)照組，并且這些miRNAs在精漿中表達(dá)具有穩(wěn)定性。采用其中的3個(gè)(特別是SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4構(gòu)成的組合)可以將對(duì)照組、少精子組、無(wú)精子組區(qū)分開(kāi)。這三條單獨(dú)也可以分開(kāi)，但如果只用一條，可能會(huì)有重合，比如有的表達(dá)較低的樣本會(huì)被劃入正常范圍，而如果用三條，即使一條并不高，但另外兩條表達(dá)都很高，就可以將其帶入得分高的組(即存在精子生成障礙風(fēng)險(xiǎn))。四、診斷試劑盒制備方法根據(jù)上述一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人還制備了一種能用于精子生成障礙動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含測(cè)定受試者精漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的成熟has-miR-17、has-miR-19b、has-miR-411的引物和工具。診斷試劑盒包括一批精漿miRNAs引物，還可以包括Taq酶、dNTP等試劑。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用精漿miRNA作為精子生成障礙評(píng)價(jià)的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于(1)精漿miRNA是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類(lèi)小分子RNA生物標(biāo)志物的成功開(kāi)發(fā)是對(duì)以蛋白為主的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的顛覆，將為男性生殖疾病的防治開(kāi)創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。(2)本發(fā)明提供的精漿miRNA標(biāo)志物可用于精子生成障礙程度評(píng)估和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可避免侵入性診斷，可反復(fù)檢測(cè)，且易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持，延緩和阻止疾病進(jìn)展，并實(shí)時(shí)觀測(cè)治療效果。.(3)本發(fā)明采用符合精子生成障礙和不符合精子生成障礙(包括正常人和有精子數(shù)量異常的人)的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，證明這幾種標(biāo)志物表達(dá)量存在顯著性差異并具有穩(wěn)定性，以說(shuō)明該標(biāo)志物具有特異性，可作為標(biāo)志物使用。(4)本發(fā)明采用嚴(yán)密、多階段的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)體系，初期通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選多種精漿miRNAs，應(yīng)用Real-timePCR等方法在大樣本進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，采用分層評(píng)分系統(tǒng)對(duì)診斷結(jié)果進(jìn)行標(biāo)化，并在另一組獨(dú)立人群中對(duì)精漿miRNA標(biāo)志物和診斷試劑盒進(jìn)行盲法評(píng)價(jià)，保證了該精漿miRNA生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的可靠性。圖l光鏡下精子計(jì)數(shù)圖(CASA分析，GroupA:健康生育男性對(duì)照組、GroupB:少精子癥組和GroupC:無(wú)精子癥組)。圖2顯示以has-let-7a、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-411這四個(gè)miRNAs作為標(biāo)志物時(shí)對(duì)GroupA:健康生育男性對(duì)照組、GroupB:少精子癥組和GroupC:無(wú)精子癥組進(jìn)行區(qū)分的結(jié)果。圖3個(gè)體精漿miRNAs表達(dá)水平波動(dòng)性分析。圖4正常對(duì)照組和無(wú)精子組之間的ROC曲線。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例l研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)本發(fā)明人于2006年9月到2008年9月間從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院搜集符合要求的成年男性的精液樣品，通過(guò)對(duì)樣品資料的整理，從中選擇了符合要求的96例健康生育男性對(duì)照(平均年齡29.32±3.13)、96例少精子癥患者(平均年齡28.96±4.32)、96例無(wú)精子癥患者(平均年齡28.76±4.07)作為Real-timePCR檢測(cè)miRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象(圖1)。具體的樣品歸類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)如下A組健康生育男性對(duì)照組(n=96)1.年齡在24至34歲間2.無(wú)生殖邦內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病3.無(wú)其它全身性疾病4.性功能正常5.精液質(zhì)量正常.6.—年內(nèi)有正常生育史B組少精子癥組(n=96)1.年齡在24至34歲間2.男性不育一年以上3.除少精子外無(wú)其他生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病4.無(wú)其它全身性疾病5.性功能正常6.精子密度低于20X106/11！1，排除無(wú)精子癥C組無(wú)精子癥組(n=96)1.年齡在24至34歲間2.男性不育一年以上3.除無(wú)精子外無(wú)其他生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病4.無(wú)其它全身性疾病5.性功能正常6.—次射精精液經(jīng)離心無(wú)精子，排除梗阻性病因7.重復(fù)精液質(zhì)量檢測(cè)/睪丸穿刺活檢，確診為無(wú)精子癥。實(shí)施例2研究對(duì)象精液采集和精液質(zhì)量常規(guī)分析在至少禁欲2天后，研究對(duì)象被要求在房間內(nèi)通過(guò)手淫將精液收集到一個(gè)無(wú)菌寬口的塑料容器中。精樣在37'C溫育液化約30分鐘后，我們按照WHO人類(lèi)精液分析實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(WorldHealthOrganization,1999)進(jìn)行了精液常規(guī)分析，包括精液容積、精子濃度、一次射精總數(shù)、精子活動(dòng)力、精子運(yùn)動(dòng)性和前向性參數(shù)等，主要使用p-cell板和計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA，WLJY9000，WeiliNewCenturyScience&TechDev.)?；顒?dòng)精子率為WHO標(biāo)準(zhǔn)的"A"級(jí)精子(37'C下快速前進(jìn)，速率》25nm/sec)加上"B"級(jí)精子(緩慢前進(jìn)，速率在5nm/sec和25pm/sec之間)，而排除"C"級(jí)精子(不前進(jìn)，速率〈5pm/sec)和"D"級(jí)精子(不運(yùn)動(dòng))。9項(xiàng)CASA參數(shù)包括鞭打頻率(BCF,Hz)，精子頭側(cè)擺幅度(ALH，nm)，曲線速度(VCL,nm/s),平均路徑速度(VAP，pm/s),直線速度(VSL，pm/s)，直線性(LIN,VSL/VCLxlOO,%)，前向性(STR,VSL/VAPxl00，％)，角標(biāo)準(zhǔn)差(MAD,°)和擺動(dòng)性(WOB,VAP/VCL，°)。在整個(gè)研究過(guò)程中均實(shí)施嚴(yán)格的質(zhì)控。每個(gè)樣本連續(xù)檢測(cè)兩次。所有觀察計(jì)數(shù)均在不清楚樣本背景的情況下自動(dòng)完成以避免偏倚。WHO的精液參數(shù)參考值包括精液容積(2ml)、精子密度(20xl06/ml)、一次射精總數(shù)(40xl06)和精子活動(dòng)力(50%motilesperm(活動(dòng)精子))。顯微鏡檢未見(jiàn)精子的標(biāo)本，經(jīng)離心/15min,3000卬m仍無(wú)精子者為無(wú)精子癥。將精子密度低于20xl06/ml，但非無(wú)精子癥的男性診斷為少精子癥。根據(jù)精子密度參考值，將重復(fù)精液質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)行確診，對(duì)無(wú)精子癥者也可采用睪丸穿刺活檢加以確診。實(shí)施例3ReaMi邁ePCR方法測(cè)量精漿miRNA表達(dá)量設(shè)計(jì)引物(表l)對(duì)96例健康生育男性對(duì)照、96例少精子癥、96例無(wú)精子癥患者的精漿進(jìn)行miRNAs的定量Real-timePCR檢測(cè)。(1)制備cDNA樣品a)取50(^1精漿；b)加等體積的水飽和酚，振蕩混勻，4'C，15000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清；c)加與上清等體積的氯仿震蕩混勻，4'C，12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清；d)重復(fù)步驟b)、c)兩次，離心均為12000轉(zhuǎn)20min。取上清作為RNA樣品；e)然后通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4pl5xAMV緩沖液、2^110mMdNTP混合液(Takara公司)、0.5plRNA酶抑制劑(Takara公司)、1plAMV(Takara公司)以及1.5^1基因特異性反向引物混和物。反應(yīng)步驟為16'C孵育15分鐘，42'C反應(yīng)1小時(shí)，85'C孵育5分鐘；(2)Real-timePCR:染料法取lplcDNA，將cDNA倍比稀釋?zhuān)尤隣，Taq酶(Takara公司)，1^120xEVAGREEN，0.25pllO^M正向引物，0.25pl10pM通用反向引物，1.2pl25mMMgCl2，1.6pl2.5mMdNTP混合液(Takara公司)，2^110><PCR緩沖液，12.4pl純水，20pl體系進(jìn)行熒光定量PCR。探針?lè)ㄈplcDNA，加入l^il10pM正向引物，lplIO^iM通用反向引物，Q.4^U10pM探針(表2)，10plTaqMan10universalPCRmasterMix，6.6^1H20，體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的都是ABIPrism7300熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件都是95'C、5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)—95'C、15秒，60°C、l分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)并比較健康生育男性對(duì)照、少精子癥、無(wú)精子癥人群精漿樣本中miRNA表達(dá)量的變化，各組樣品精漿miRNA的表達(dá)量比值可用方程2—AG表示，其中AG-CTgr。叩廣CTgroup2。為保證各次實(shí)驗(yàn)間的可比性，我們?cè)诿堪迳隙荚O(shè)置了P—樣本，以其作為內(nèi)參調(diào)整計(jì)算表達(dá)量。從結(jié)果分析得出，hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-411這三條miRNA在各組間均有顯著差別(圖2)。非參數(shù)的趨勢(shì)性檢驗(yàn)也顯示了相同的差異。并且染料法和探針?lè)ńY(jié)果之間保持較高的一致性(r=0.74,p=0.000)。表l四個(gè)miRNAs的引物序列引物名稱(chēng)對(duì)應(yīng)miRNA引物序列hsa-let-7a-Rhsa-miR-17-Rhsa-miR-19b-Rhsa-miR-411-Rhsa-let-7a-Fhsa-miR-17-Fhsa-miR-19b-Fhsa-miR-411-FURPCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACTATACCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGCCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGTACGCTACACTCCAGCTGGGTGAGGTAGTAGGTTGTACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTTACAGTGCACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCCATGCAAACACTCCAGCTGGGTAGTAGACCGTATAGTGGTGTCGTGGAGTCG表2miRNA的探針序列miRNATaqMan探針(5'-3')hsa-miR-19b(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAGTTTT(MGB)實(shí)施例4個(gè)體精槳miRNA表達(dá)量的穩(wěn)定性分析采用實(shí)施例3的方法對(duì)六名成年男性的精漿miRNA水平的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。和實(shí)施例2同樣的采集方法采集研究對(duì)象連續(xù)三次射出的精液(間隔時(shí)間為2周，間隔期內(nèi)無(wú)疾病發(fā)生并保持禁欲)。結(jié)果顯示，精漿中hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-411這三個(gè)miRNA表達(dá)水平較穩(wěn)定(圖3)。這些都提示了個(gè)體精漿miRNA的表達(dá)量較為穩(wěn)定，具備作為診斷/監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的特性。實(shí)施例5miRNA精漿特異性表達(dá)分析采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法，觀察hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-411這三個(gè)可以作為標(biāo)志物的miRNAs是否在精漿中特異表達(dá)，結(jié)果顯示hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-411均為在精漿和睪丸中特異表達(dá)，而在外周血中無(wú)表達(dá)。這三條miRNA具有精漿表達(dá)特異性。實(shí)施例6三種miRNA組合對(duì)精子生成障礙的判斷根據(jù)上述Real-timePCR方法，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)3組精漿樣品的miRNAs表達(dá)水平的分析，以正常對(duì)照組miRNAs表達(dá)量的四分位數(shù)為閾值，對(duì)has-miR-17、has-miR-19b、has-miR-411進(jìn)行評(píng)分，進(jìn)二步求得總得分，以此繪制ROC曲線來(lái)評(píng)估預(yù)測(cè)的靈敏性和特異性，進(jìn)而評(píng)估這三個(gè)miRNAs低表達(dá)或高表達(dá)對(duì)精子生成狀態(tài)的評(píng)估能力。ROC分析結(jié)果顯示，has-miR-17、has-miR-19b、has-miR-411以77.1。/。的AUC(ROC曲線下面積)將正常對(duì)照組和無(wú)精子組分開(kāi)，以56.3%的AUC將正常對(duì)照組和少精子組分開(kāi)(圖4)。在上述一系列研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人證明了采用has-miR-17、has-miR-19b、has-miR-411能夠很好地將男性對(duì)照和不同程度的精子生成障礙的人群分開(kāi)。實(shí)施例7miRNA分層評(píng)分，獨(dú)立人群盲法驗(yàn)證當(dāng)對(duì)hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-411這三個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行分層評(píng)分時(shí)(四分位數(shù)分層后累加)，能夠?qū)由烧系K的程度進(jìn)行評(píng)估，表述為精子生成障礙程度，積分越高，發(fā)生精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)越高。表3三個(gè)miRNAs四分位數(shù)得分并求和123456789Total正常對(duì)照組1816151311985196少精子組210111214169101296無(wú)精子組0347101415182596Total202930323539323338288注每個(gè)miRNA按表達(dá)量的四分位數(shù)分為四個(gè)等級(jí)O、1、2、3,最低的0分，最高的3分，三條綜合可以得分為0~9分，而無(wú)精子組絕大多數(shù)得分很高(表達(dá)量都高)，而正常對(duì)照組很少有高分。舉例來(lái)說(shuō)，如有一個(gè)樣本評(píng)分為9分(最高的分值組)，其精子密度正常的可能性?xún)H為2.63%,而為非梗阻性無(wú)精子癥的可能性為65.8%;如有一個(gè)樣本評(píng)分為0分(最低的分值組)，則其不可能為非梗阻性無(wú)精子癥，80%的可能性為正常精子生成。針對(duì)得出的評(píng)估分值(即根據(jù)具體得分判斷其分組，得高分的歸入無(wú)精子組，得12低分的歸入對(duì)照組)(比較而言，》7算高分，《3算低分)，對(duì)另一組獨(dú)立采集的人群進(jìn)行盲法首診，即采用雙盲試驗(yàn)，對(duì)獨(dú)立人群(另一醫(yī)院采集的40例成年男性)同時(shí)進(jìn)行精液質(zhì)量常規(guī)分析和精漿樣品的miRNA檢測(cè)，對(duì)精子生成情況進(jìn)行分析對(duì)比，結(jié)果顯示通過(guò)3個(gè)miRNA檢測(cè)評(píng)分，可以將不同精子生成狀態(tài)的人群很好的區(qū)分開(kāi)(40例隨即選擇樣本中有9例評(píng)分較高(》7分)，其中達(dá)到9分(最高分)的有5例，這5例經(jīng)穿刺診斷均為非梗阻性無(wú)精子癥，另外4例評(píng)分較高的精子密度均低于20xl06/ml，其余評(píng)分較低的精子密度均高于20xl06/ml)，提示這幾種miRNA可作為評(píng)估精子生成障礙風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物。實(shí)施例8用于精子生成障礙診斷和監(jiān)測(cè)的miRNA診斷試劑盒的制作該miRNA試劑盒的制作工藝和操作流程主要基于RT-PCR、Real-timePCR技術(shù)。首先通過(guò)測(cè)序的方法和Real-timePCR方法確定正常人和精子生成障礙患者精漿中有一個(gè)以上拷貝的miRNA。然后通過(guò)定量PCR等技術(shù)篩選與精子生成狀態(tài)相關(guān)的一類(lèi)精漿miRNA，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生精子生成障礙以及診斷病變程度的指標(biāo)。最后篩選出對(duì)應(yīng)的精漿miRNA的數(shù)量控制在幾條，這是在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上做出的最優(yōu)化的精簡(jiǎn)。此試劑盒包括一批精漿miRNA引物(如表1中的一對(duì)或幾對(duì))，其中miRNA的引物包括has-miR-17、has-miR-19b、has-miR-411。還可以有相關(guān)PCR技術(shù)常用的試劑，如Taq酶、PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、探針等試劑，這些試劑可采用相應(yīng)的市售產(chǎn)品。此試劑盒的價(jià)值在于只需要一次射出精液中極少量的精漿，即可檢測(cè)精槳miRNA標(biāo)志物的變化趨勢(shì)，再通過(guò)該變化趨勢(shì)預(yù)測(cè)精子生成障礙發(fā)生的可能性或診斷精子生成障礙的程度，并易于進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和觀察治療效果。具體試劑盒組成如下試劑盒中的引物可以一對(duì)SEQIDN0.7和SEQIDN0.8各lOpM0.25pl。試劑盒中還可以含有0.3^1Taq酶，lpl20xEVAGREEN,1.2425mMMgCl2,1.6^12.5mMdNTP混合液，2pl10xPCR緩沖液，純水?；蛘咴噭┖兄谐蛞锿膺€含有l(wèi)pllOpM通用反向引物，0.4^1lO^M探針(表2)，10^1TaqManuniversalPCRmasterMix,6.6(^1H2O。試劑盒中的組分除引物外的試劑可以采用現(xiàn)有技術(shù)中用于microRNA含量檢測(cè)的相應(yīng)試劑。引物還可以是SEQIDN0.9和SEQIDNO.10;或者SEQIDNO.ll和SEQIDN0.12;引物也可以是以下三對(duì)引物中的任意二對(duì)或三對(duì)SEQIDN0.7和SEQIDN0.8，SEQIDN0.9和SEQIDNO.10以及SEQIDNO.ll和SEQIDNO.12。參考文獻(xiàn)*WorldHealthOrganization.WHOLaboratoryManualfortheExaminationofHumanSemenandSperm-CervicalMucusInteraction.4thedn.CambridgeUniversityPress,Cambridge,UK，1999.*CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.ChenX，BaY，MaL，CaiX，'YinY，WangK，GuoJ，ZhangY,ChenJ,GuoX,LiQ，LiX,WangW，ZhangY,WangJ，JiangX，XiangY，XuC，ZhengP,ZhangJ，LiR，ZhangH，ShangX，GongT,NingG，WangJ，ZenK,ZhangJ，ZhangCY.CellRes.2008Oct;18(10):997-1006.參CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.MitchellPS,ParkinRK，KrohEM,FritzBR,WymanSK,Pogosova-AgadjanyanEL，PetersonA,NoteboomJ，O'BriantKC,AllenA,LinDW，UrbanN,DrescherCW,KnudsenBS,StirewaltDL,GentlemanR,VessellaRL,NelsonPS,MartinDB，TewariM.ProcNatlAcadSciUSA.2008Jul29;105(30):10513-8.*MicroRNAbiogenesisisrequiredformouseprimordialgermcelldevelopmentandspermatogenesis.HayashiK,ChuvadeSousaLopesSM，KanedaM,Tang'F，HajkovaP,LaoK，O'C謂llD,DasPP，TarakhovskyA,MiskaEA,SuraniMA.PLoSONE.2008Mar5;3(3):e1738.*AmicroarrayformicroRNAprofilinginmousetestistissues.YanN,LuY,SunH,TaoD，ZhangS,LiuW,MaY.Reproduction.2007Jul;134(l):73-9.*AlteredmicroRNAexpressioninpatientswithnon-obstructiveazoospermia.LianJ,ZhangX，TianH,LiangN，WangY,LiangC，LiX,SunF.ReprodBiolEndocrinol.2009Febll;7(l):13.<110〉南京醫(yī)科大學(xué)<120〉一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用〈160〉13〈210>1〈211〉22<212〉腿<213〉天然序列，來(lái)源于人O)uman)精液〈220><223>microRNA:has-let-7a〈400>1ugagguaguagguuguauaguu22〈210>2〈211〉23<212〉RNA〈213>天然序列,來(lái)源于人(human)精液<220>〈223〉microRNA:has-miR-17<400〉2caaagugcuuacagugcagguag23〈210〉3〈211>23<212>RNA〈213>天然序列，來(lái)源于人(human)精液〈220〉<223>microRNA:has-miR-19b〈400〉3ugugcaaauccaugcaaaacuga23〈210>4〈211〉21<212〉腿〈213>天然序列，來(lái)源于人(human)精液<220〉〈223〉microRNA:has-miR-411〈400〉4uaguagaccguauagcguacg2115<210>5〈211>30<212〉讓〈213〉人工序列<220>〈223〉hsa-let-7a正向引物〈400>5acactccagctgggtgaggtagt鄉(xiāng)ttgt30<210〉6<211>44<212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉hsa-let-7a反向引物〈400〉6ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaactatac44〈210>7〈211〉31〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223>hsa-miR-17正向引物<400>7acactccagctgggcaaagtgcttaceigtgc31〈210〉8〈211〉44<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉hsa-miR-17反向引物〈400〉8ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagctacctgc44〈210>9<211〉31<212>薩<213〉人工序列〈220〉〈223>hsa-miR-19b正向引物〈400〉9acactccagctgggtgtgcaaatccatgcaa31<210〉10〈211〉44<212〉腿<213〉人工序列<220〉<223>hsa-miR-19b反向引物〈400〉10ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagtcagtttt44<210〉11<211〉29〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223>hsa-miR-411正向引物<400〉11acactccagctgggtagtagaccgtatag29<210〉12<211〉44<212>DNA<213>人工序列〈220>〈223〉hsa-miR-411反向引物〈400>12ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcgtacgct44〈210>13<211〉16〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉通用反向引物<400>13tggtgtcgtggagtcg1權(quán)利要求1、一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿microRNA標(biāo)志物，選自SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4中一種或多種。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的精漿microRNA標(biāo)志物，其特征在于由SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4構(gòu)成。3、權(quán)利要求1或2所述的精漿microRNA標(biāo)志物在制備精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求1所述的精漿micj:oRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于序列為SEQIDNo.2的標(biāo)志物的上游引物為SEQIDNo.7,下游引物為SEQIDNo.8;序列為SEQIDNo.3的標(biāo)志物的上游引物為SEQIDNo.9,下游引物為SEQIDNo.lO;序列為SEQIDNo.4的標(biāo)志物的上游引物為SEQIDNo.ll，下游引物為SEQIDNo.12。5、權(quán)利要求4所述的任意一對(duì)引物在制備精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。6、一種精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述的精漿microRNA標(biāo)志物的引物。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求5所述引物中的一對(duì)或多對(duì)。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒，其特征在于所述引物為SEQIDNo.7和SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.lO、以及SEQIDNo.ll和SEQIDNo.l2。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種與精子生成障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物選自SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4中一種或多種。該標(biāo)志物對(duì)精子生成障礙具有特異性和敏感性，可用于制備精子生成障礙診斷或監(jiān)測(cè)的試劑，可避免侵入性診斷，可反復(fù)檢測(cè)，且易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)精子生成障礙的程度。文檔編號(hào)C12N15/11GK101633925SQ20091018412公開(kāi)日2010年1月27日申請(qǐng)日期2009年8月25日優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日發(fā)明者夏彥愷,沈洪兵,王心如,胡志斌申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)