專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素CdtB、其表達(dá)載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種重組cdtB新序列原核表達(dá)載體構(gòu)建及其蛋白純化、復(fù)性方法。
背景技術(shù)：
：CdtB是細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素(cytolethaldistendingtoxin，CDT)家族的一個(gè)成員，細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素是一種新近發(fā)現(xiàn)的、由伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌(Jc"'wo6ad〃wsa"/womycefewco/n/tora，^4fl)產(chǎn)生的細(xì)胞毒'f生因子之一。伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌04a)是侵襲性牙周炎的主要致病菌之一，在各型牙周炎中尤以侵襲性牙周炎為最重，此型牙周炎具有發(fā)病年齡早、病變進(jìn)展快、易造成牙周組織迅速破壞而導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落等特點(diǎn)，而且有明顯的家族聚集性，對(duì)于牙周炎病因?qū)W的研究確認(rèn)細(xì)菌是牙周炎發(fā)生的始動(dòng)因子，而伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌"fl)作為局限型4旻襲'f生牙周炎(Localizedaggressiveperiodontitis,LAgP)的主要致病菌，可產(chǎn)生一系列毒力因子使其易于定植、破壞宿主組織、抑制組織修復(fù)和干擾宿主免疫防御功能，對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展意義重大。細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素(CDT)是新近被發(fā)現(xiàn)的由G-致病菌產(chǎn)生的一種毒素，該毒素能使中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(chinahamsterovarycell,CHO)停留在G2/M期而不能進(jìn)入分裂期，從而導(dǎo)致細(xì)胞膨脹、死亡，故命名為細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素，而A是迄今被發(fā)現(xiàn)的可產(chǎn)生CDT的唯一的牙周可疑致病菌。細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素是一種熱不穩(wěn)定蛋白，經(jīng)研究證實(shí)由三個(gè)相鄰基因編碼cdtA，cdtB,cdtC,對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為CdtA，CdtB,CdtC，分子量近似為28，32，20A:Da組成異源三聚體全毒素。目前已經(jīng)確認(rèn)CdtB為毒力亞基。純化的重組Cd但蛋白在體外與超螺旋DNA共同作用，可使DNA超螺旋松解或形成DNA切口。重組Cd但顯孩i注射入細(xì)胞內(nèi)，引起宿主細(xì)胞DNA破壞、細(xì)胞死亡。CdtB由CdtA和CdtC轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，CdtB進(jìn)入細(xì)胞核，即可通過(guò)激活DNA損傷依賴(lài)的檢查點(diǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致DNA破壞和細(xì)胞周期停滯。包涵體由于沒(méi)有完全正確的天然態(tài)結(jié)構(gòu)，不具有生物學(xué)活性，必須經(jīng)體外分離、純化、復(fù)性等工藝才能變成有生物學(xué)活性的產(chǎn)品，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)顯示，體外表達(dá)的蛋白60%以包涵體形式存在，這就使得從包涵體中提取、純化及復(fù)性重組蛋白的工藝引起高度重視，且直接關(guān)系到經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)有的國(guó)內(nèi)純化蛋白的工藝存在諸多問(wèn)題如采用變性劑致使蛋白粘稠度大、操作難度大，效率低，而國(guó)外一般采用昂貴的蛋白表達(dá)純化儀器，如RTS500SYSTEM。因此，目前本領(lǐng)域還缺少一條工藝簡(jiǎn)便、成本低廉、活性好，僅僅依靠純手工即可完成的蛋白純化復(fù)性工藝。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種能原核表達(dá)cdtB基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15b-cdtB構(gòu)建方法，并經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10和BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，體外誘導(dǎo)表達(dá)蛋白CdtB，該蛋白有望作為蛋白藥物應(yīng)用于腫瘤等疾病的治療。并且本發(fā)明是克服現(xiàn)有的包涵體蛋白純化過(guò)程中存在的問(wèn)題，提供一種無(wú)需昂貴儀器，只需純手工即可完成，且方法簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、成本低、活性好，產(chǎn)品復(fù)性率可達(dá)80%以上。技術(shù)方案重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB,其核苷酸序列如SEQIDNO.l所述。重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB,其氨基酸序列如SEQIDN0.2所述。重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB、的表達(dá)載體pET-15b-cdtB。重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB的制備方法，制備步驟為目的基因cdtB的合成設(shè)計(jì)上游引物5,-CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT-3，，帶限制性?xún)?nèi)切酶XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物5，-CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3，，帶限制性?xún)?nèi)切酶BamHI酶+刀^f立點(diǎn)；分另'J以4半方欠線(xiàn)》欠線(xiàn)桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa)ATCC29522、29523為模板，PCR擴(kuò)增cdtB基因，PCR條件是94°C30s,55。C30s，72'Clminx30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為852bp;雙酶切cdtB基因與帶有6xHis標(biāo)簽的載體pET-15b，連接構(gòu)建重組載體pET-15b-cdtB,轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建cdtB基因工程菌，所述雙酶切采用的是BamHI和XhoI,所述宿主菌為大腸桿菌；培養(yǎng)cdtB基因工程菌，體外誘導(dǎo)表達(dá)CdtB蛋白，以包涵體形式存在，清洗、溶解包涵體得到包涵體溶解液所述培養(yǎng)cdtB基因工程菌為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37。C;所述體外誘導(dǎo)Cd但蛋白表達(dá)使用大腸桿菌BL21(DE3),終濃度為0.1M的IPTG,誘導(dǎo)4h,溫度為37°C;5所述清洗、溶解包涵體是將工程菌超聲破碎，離心收集沉淀，用溶液1、2清洗，溶液3溶解，溶液4析出蛋白，所述溶液1為2M尿素、lwt%TritonX-100,所述溶液2為2M尿素，所述溶液3為8M尿素、0.1M(3ME,所述溶液4為PBS緩沖液；純化包涵體所述純化包涵體是使用Ni-HisTrapHP預(yù)裝柱純化，純化過(guò)程中使用吸附緩沖液和洗脫緩沖液，利用Ni離子良好的螯合性能，吸附帶6xHis標(biāo)簽的CdtB蛋白，吸附條件為pH7.4;所述吸附緩沖液含有8M尿素、20mM磷酸鈉和0.5M氯化鈉，所述洗脫緩沖液含有8M尿素、20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉和500mM咪唑；復(fù)性所述復(fù)性采用透析法，形成濃度梯度降低變性劑尿素的濃度由原始濃度8M降至OM,透析液含有pH8.0-9.020mMTris-HCl、5g精氨酸和lg還原型谷胱甘肽，采用半透膜透析；超濾得到體外重組的CdtB活性蛋白所述超濾為采用孔徑0.2uM—次性濾膜超濾，-80°C凍存。有益效果本發(fā)明運(yùn)用原核表達(dá)載體pET-15b在C端含有6個(gè)氨基酸6xHis標(biāo)簽序列，便于蛋白的純化和分離，大腸桿菌表達(dá)的CdtB蛋白以包涵體形式存在，對(duì)其進(jìn)行體外復(fù)性比較困難，本發(fā)明在通過(guò)大腸桿菌高效表達(dá)CdtB的基礎(chǔ)上，對(duì)影響包涵體純化復(fù)性的一系列因素的進(jìn)行大量比較研究的基礎(chǔ)上，確定了重組CdtB體外純化、復(fù)性的較為合適的方法，使其復(fù)性效率達(dá)80%左右，復(fù)性后CdtB濃度為0.19pg4U。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、成本低、活性好，產(chǎn)品復(fù)性率可達(dá)80%以上，且該蛋白有望作為蛋白藥物應(yīng)用于腫瘤等疾病的治療，用此方法在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)也具有優(yōu)勢(shì)。圖1:目的基因cdtB合成；圖2:pET-15b-cdtB質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖3:CdtB表達(dá)及純化后非還原SDS-PAGE圖；圖4:westernblot鑒定CdtB蛋白；圖5:CdtB蛋白體外酶活性檢測(cè)；圖6:CDT全毒素作用于Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察；圖7:目的蛋白與CHO細(xì)胞孵育后CFU觀(guān)察；圖8:流式細(xì)胞儀觀(guān)察不同濃度CdtAB作用Hela細(xì)胞后細(xì)胞周期情況；圖9:pET-15b-CdtB質(zhì)粒圖譜；圖10:pET-15b-CdtB克隆表達(dá)區(qū)。圖1中，1為DL2000Marker,2為PCR擴(kuò)增的cdtB基因片段；圖2中，1為DL2000Marker,2為pET-15b-cdtB;圖3為CdtB純化后非還原SDS-PAGE圖。(各項(xiàng)代表含義見(jiàn)表3)表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖6為CDT全毒素作用于Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察其中(a)DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)72h的正常Hela細(xì)胞；(b)DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的加入CDT全毒素后孵育72h的Hela細(xì)胞；圖7為目的蛋白與CHO細(xì)胞孵育后CFU觀(guān)察，各項(xiàng)代表含義見(jiàn)表6;圖8為流式細(xì)胞儀觀(guān)察不同濃度CdtAB作用Hela細(xì)胞后細(xì)胞周期情況，ED5o表示細(xì)胞半數(shù)停留G2期時(shí)，蛋白濃度為12.6ng/ml。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:(1H殳計(jì)上游引物5'國(guó)CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT-3',帶XhoI限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，下游引物5'-CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3，，帶限制性?xún)?nèi)切酶BamHI酶切4立,泉；分另'J以4半》文線(xiàn)力文線(xiàn)4干菌(爿c""oftad〃M51""/wcw^c"e附co附/to"51，爿")ATCC29522、29523DNA為模板，PCR擴(kuò)增cdtB基因，PCR條件是(94。C30s,55°C30s，72°Clmin)x30循環(huán)，72°C延伸8min,lwt。/。瓊脂糖凝膠電泳,在852bp處見(jiàn)一明顯條帶，與預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小吻合。(圖1)(2)PCR產(chǎn)物回收經(jīng)PCR擴(kuò)增后的cdtB基因，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后，連接原核表達(dá)栽體pET-15b，按常規(guī)方法連接，大小為1118bp。并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPIO感受態(tài)細(xì)胞。LB平板上隨機(jī)挑幾個(gè)單克隆，PCR及測(cè)序鑒定，序列表見(jiàn)附表。(圖2、序列表)(3)以1:100的比例轉(zhuǎn)接到5mlLB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6,加入IPTG至終濃度為O.IM，37。C誘導(dǎo)4h,8000轉(zhuǎn)/分，離心10min,收集菌體沉淀，bindingbuffer重懸，-80°C過(guò)夜。(4)室溫溶解包涵體液，使用溶液1振蕩清洗3-4遍，12000轉(zhuǎn)/分，離心10min,收集沉淀，所述溶液1為2M尿素、lwt%TritonX-100;使用溶液2振蕩清洗3遍，12000轉(zhuǎn)/分，離心10min,收集沉淀，溶液2為2M尿素；使用溶液3溶解沉淀，并經(jīng)超聲碎菌lmin,13000轉(zhuǎn)/分，離心2min，收集上清，所述溶液3為8M尿素、O.lMpME;使用溶液4，13000轉(zhuǎn)/分，離心2min析出蛋白沉淀，溶液4為PBS緩沖液；再次使用溶液3溶解沉淀，超聲碎菌lmin，13000轉(zhuǎn)/分，離心2min,收集上清，此時(shí)可溶性蛋白上清為澄清、透明的乳白色。調(diào)節(jié)pH7.4,準(zhǔn)備純化。(5)使用GeneQuant公司的Ni-HisTrapHP預(yù)裝柱，用bindingbuffer(pH7.4)平衡柱子，將待純化蛋白上清上柱，上樣完成后，用加入5mM咪唑的bindingbuffer沖洗柱子，再用elutionbuffer洗脫柱子，收集蛋白，測(cè)OD260和OD280,測(cè)算洗脫峰，SDS-PAGE驗(yàn)證，取純化較好的蛋白留待復(fù)性。(圖3)(6)將上述洗脫后較純的蛋白收集液，通過(guò)透析法復(fù)性。其原理是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過(guò)半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。包涵體蛋白通過(guò)添加尿素、TritonX-100等使得包涵體得以溶解，通過(guò)梯度透析使變性劑成分尿素、TritonX-100等小分子物質(zhì)通過(guò)半透膜(濃度梯度跨度過(guò)大，易使蛋白變性析出)，逐漸降低其在蛋白中含量，最終達(dá)到分離的效果。且在堿性緩沖液及精氨酸、還原型谷胱甘肽存在的情況下，可促進(jìn)蛋白二疏鍵重新結(jié)合、促進(jìn)蛋白恢復(fù)活性。梯度透析液組分見(jiàn)表5表5<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>透析液均調(diào)至pH8.0-9.0,透析時(shí)間為48h-72h。(7)透析后的蛋白測(cè)算OD值估算濃度，并經(jīng)westernblot鑒定。(使用抗His抗體作為一抗，羊抗小鼠IgG作為二抗)(圖4)(8)體外酶活性驗(yàn)證復(fù)性成功與否。將復(fù)性后蛋白液分成6個(gè)濃度梯度，在緩沖液的作用下，與超螺旋質(zhì)粒pET-32a,37。C孵育lh,lwt%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察。緩沖液為25mMHepes(pH7.0),10mMMgCl2,5mMCaCl2。(圖5)(9)經(jīng)測(cè)算純化復(fù)性后蛋白濃度為0.19pg4U。卿0.2nM—次性濾膜過(guò)濾蛋白CdtA,CdtB,CdtC，體外重構(gòu)CDT全毒素，重構(gòu)液為10mMTris-HCl(pH7.0),100mMNaCl2，5mMCaCl2，4'C孵育lh。與人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela細(xì)胞)孵育72h，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，正常細(xì)胞作為對(duì)照。(圖6)可見(jiàn)加入CDT全毒素后的Hela細(xì)胞體積明顯膨大，一些細(xì)胞可見(jiàn)核碎裂。(ll)將CdtA,CdtB,CdtC任意組合成不同組分及濃度，與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢上皮細(xì)胞(CHO細(xì)胞)孵育6天，觀(guān)察細(xì)胞集落形成單位情況(CFU)。細(xì)胞接種到6孔板中，每孔240個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加入目的蛋白，蛋白組分見(jiàn)表6表6<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>觀(guān)察可見(jiàn)CDT全毒素可以導(dǎo)致細(xì)胞膨脹最終死亡，單獨(dú)的CdtA,CdtB，CdtC蛋白無(wú)細(xì)胞毒性作用，且CdtB為主要毒力基團(tuán)，其濃度最小l嗎即可表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，3嗎時(shí)細(xì)胞毒性作用即達(dá)到最大。(1》將Hela細(xì)胞與不同濃度的CdtAB反應(yīng)，流式細(xì)胞儀觀(guān)察細(xì)胞周期情況，CdtAB濃度范圍為0.6-10嗎/ml。可見(jiàn)隨著濃度的增加，細(xì)胞停留在G2期的比重增大，濃度為10ng/ml時(shí)，有40。/。細(xì)胞停留在G2期，試驗(yàn)表明，本發(fā)明通過(guò)純手工的工藝，能夠純化到純度較高，且活性好的蛋白，且省時(shí)、省錢(qián)、省力，復(fù)性率達(dá)80%,在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有優(yōu)勢(shì)。且CdtB蛋白具有導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞(如Hela細(xì)胞)DNA裂解、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞體積膨脹、最后死亡的特殊細(xì)胞毒性作用，因此該蛋白的研究，對(duì)于基因治療以及蛋白藥物治療腫瘤具有廣闊的前景，意義重大。序列表<110>南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院<120〉重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素CdtB、其表達(dá)載體及其制備方法<130><140><141>2009-08-12<160>4<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>852<212〉DNA<213>Cytolethaldistendingtoxin<400〉11ATGCAATGGGTAAAGCAATTAAATGTGGTT61TATGCTAACTTGAGTGATTTTAAAGTAGCA121AATGAAAGTAAATGGAATATTAATGTACGC181ATTTTGATGGTACAAGAAGCGGGTTCATTA241ATTCAACATGGGGGAACGCCAATTGAGGAA301CCAAATATGGTCTATATTTATTATTCCCGT361GCTATCGTGTCACGTCGTCAAGCCGATGAA421CTTCAATCTCGCCCGGCAGTAGGTATCCGC481GCTTTGGCCACAGGTGGTTCTGATGCGGTA541ACCTCATCACCATCATCACCGGAAAGACGA601AATCGTGCGCCGGTTAATCTGGAAGCTGCA661ACAATTATTATTGCGCCAACAGAACCGACT721ATTTTACATGACGCACATTTACCACGTCGA781TTAATGTTAAATCAGTTACGCTCACAAATT841CATGATCGCTAA<210>2<211〉283<212>PRT<213>CytolethaldistendingtoxinTTCTGTACGAACTTGGAATCCAATTATTATCCAAGTTCGGTATACCTGGATTAGATGTTGGCTTTTATCGATTGGTACTGAGTTTAATTCGGATATAGCTTTAAGACAGGCATCGGTCCGGAGCAAGCACACATCCGATCTGTTATTTAGTGCAAGGTTCCGGGAGAACACAGTAAGAACATTTAGGTACGGGCAAACCGTACATTCTGAATGTATTTTTGTAATATCTTGGATGGTTGTAACCCGCCGTGTAATATTTTGTGAACGTATATTTTCCTGTCTTTTCAAGTTTCAGCAGTAAGGTGCAGATCTCACGAGTATCGCTCCCGTAGTGAACTTATTCTTCTGTGTACAGTGCATCACTACTTTTTGGTGATTTCGAGTGAAAATAGATTATGCGCGGCGCAAGTTAGTTTTGTT<400>21MQWVKQ]jNWFCTMIiFSFSSYANLSDFKVATW肌QGSSAVNESKWN工NVRQIiSGEQGAD61ILMVQEAGSLPSSAVRTSRVIQHGGTPIEEYTWNLGTRSRP腿VYIYYSRLDVGANRVNL121AIVSRRQADEAFIVHSDSSVLQSRPAVGIRIGTDVFETVHALATGGSDAVSL工RNIFTTF181TSSPSSPERRGYSWMWGDFNRAPVNLEAALRQEPAVSENTIIIAPTEPTHRSGNILDYA241ILHDAHLPRREQARERIGASLMLNQLRSQITSDHFPVSFVHDR<210><211><212><213>329DNA人工序列<400>3ccgctcgagatgcaatgggtaaagcaatt29<210><211><212><213>430DNA人工序列<400>4cgcggatccttagcgatcatgaacaaaact30權(quán)利要求1.重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所述。2.重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所迷。3.重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB的表達(dá)載體pET-15b-cdtB。4.重組細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素cdtB的制備方法，其特征在于制備步驟為a.目的基因cdtB的合成設(shè)計(jì)上游引物5，陽(yáng)CCGCTCGAGATGCAATGGGTAAAGCAATT陽(yáng)3，，帶限制性?xún)?nèi)切酶XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物5'-CGCGGATCCTTAGCGATCATGAACAAAACT-3，，帶限制性?xún)?nèi)切酶BamHI酶切位點(diǎn)；分別以伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa)ATCC29522、29523為模板，PCR擴(kuò)增cdtB基因，PCR條件是94°C30s，55°C30s,72°Clminx30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為852bp;b.雙酶切cdtB基因與帶有6xffis標(biāo)簽的載體pET-15b,連接構(gòu)建重組載體pET-15b-cdtB，轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建cdtB基因工程菌，所述雙酶切采用的是BamHI和XhoI，所述宿主菌為大腸桿菌；c.培養(yǎng)cdtB基因工程菌，體外誘導(dǎo)表達(dá)CdtB蛋白，以包涵體形式存在，清洗、溶解包涵體得到包涵體溶解液所述培養(yǎng)cdtB基因工程菌為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37°C;所述體外誘導(dǎo)CdtB蛋白表達(dá)使用大腸桿菌BL21(DE3),終濃度為0.1M的IPTG,謙導(dǎo)4h,溫度為37°C;所述清洗、溶解包涵體是將工程菌超聲破碎，離心收集沉淀，用溶液1、2清洗，溶液3溶解，溶液4析出蛋白，所述溶液1為2M尿素、lwt%TritonX-IOO，所述溶液2為2M尿素，所迷溶液3為8M尿素、,0.1MPME,所述溶液4為PBS緩沖液；d.純化包涵體所述純化包涵體是使用Ni-HisTrapHP預(yù)裝柱純化，純化過(guò)程中使用吸附緩沖液和洗脫緩沖液，利用Ni離子良好的螯合性能，吸附帶6xffis標(biāo)簽的CdtB蛋白，吸附條件為pH7.4;所述吸附緩沖液含有8M尿素、20mM磷酸鈉和0.5M氯化鈉，所述洗脫緩沖液含有8M尿素、20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉和500mM咪唑；e.復(fù)性所述復(fù)性釆用透析法，形成濃度梯度降低變性劑尿素的濃度由原始濃度8M降至0M,透析液含有pH8.0-9.020mMTris-HCl、5g精氨酸和lg還原型谷胱甘肽，采用半透膜透析；f.超濾得到體外重組的CdtB活性蛋白所述超濾為采用孔徑0.2iuM一次性濾膜超濾，-80°C凍存。全文摘要本發(fā)明提供一種能原核表達(dá)cdtB基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15b-cdtB構(gòu)建方法，并經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10和BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，體外誘導(dǎo)表達(dá)蛋白CdtB，該蛋白有望作為蛋白藥物應(yīng)用于腫瘤等疾病的治療。并且本發(fā)明是克服現(xiàn)有的包涵體蛋白純化過(guò)程中存在的問(wèn)題，提供一種無(wú)需昂貴儀器，只需純手工即可完成，且方法簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、成本低、活性好，產(chǎn)品復(fù)性率可達(dá)80％以上。文檔編號(hào)C12N15/31GK101629177SQ20091018433公開(kāi)日2010年1月20日申請(qǐng)日期2009年8月18日優(yōu)先權(quán)日2009年8月18日發(fā)明者艷徐,璐李,楊迷芳,段君蘭,王曉茜申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院