專利名稱：一種重組畢赤酵母發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的重組畢赤酵母發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。Koichi Ogata等人于1969年首次發(fā)現(xiàn)了可以利用甲醇為唯一碳源和能源生長(zhǎng)(Koichi Ogata， et al.l969)的酵母。由于這一特性，早期畢赤酵母被用來(lái)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。直到，1987年， Cregg等人才首次將畢赤酵母用于外源基因的表達(dá)(JMCregg， etal.1987)。巴斯德畢赤酵 母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)基因操作簡(jiǎn)易、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、表達(dá)量高、生 產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具有真核表達(dá)系統(tǒng)的對(duì)外源蛋白的翻譯后修飾等特點(diǎn)，如糖基 化、蛋白磷酸化等。與釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，它還避免了其分泌效率差、表達(dá)菌株不 夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷。由于這些優(yōu)點(diǎn)使得該系統(tǒng)成為目前研究最多、應(yīng)用最 廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。 在畢赤酵母利用甲醇的代謝途徑中存在兩個(gè)乙醇氧化酶，AOXl和AOX2。其 中AOXl承擔(dān)大部分的乙醇氧化酶活性。根據(jù)AOX1和AOX2基因的完整性不同，畢赤 酵母表現(xiàn)出三種甲醇利用表現(xiàn)。當(dāng)AOXl和AOX2基因都完整時(shí)，畢赤酵母菌株表現(xiàn)出 甲醇快速利用的表型(mut+);當(dāng)AOXl被敲除、AOX2基因完整時(shí)，畢赤酵母菌株表現(xiàn)出 甲醇慢速利用的表型(muts);當(dāng)AOXl和AOX2基因都被敲除時(shí)，畢赤酵母菌株表現(xiàn)不利 用甲醇生長(zhǎng)的表型(mut-)。在表達(dá)外源蛋白時(shí)，后面兩種表型有時(shí)優(yōu)于mut+，而且甲醇 的消耗量小。三種表型的菌株均可以在AOXl啟動(dòng)子的調(diào)控下控制外源蛋白的表達(dá)。但 是在三種表型重組畢赤酵母菌株的發(fā)酵策略上存在一定的差異。 畢赤酵母發(fā)酵工藝一般分為三個(gè)階段，甘油分批發(fā)酵階段、甘油補(bǔ)料階段和外 源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段。前兩個(gè)階段對(duì)于三種表型都是一樣，但在外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段 卻有較大的不同。對(duì)于!!1加+-重組菌，在甲醇誘導(dǎo)時(shí)菌體還可以利用甲醇生長(zhǎng)，故在誘 導(dǎo)階段多采用直接甲醇補(bǔ)料；對(duì)于muts重組菌，在甲醇誘導(dǎo)菌體生長(zhǎng)緩慢，為了維持一 定的生長(zhǎng)速度，在誘導(dǎo)階段多采用混合補(bǔ)料，如甲醇-甘油混合補(bǔ)料、甲醇-山梨醇混 合補(bǔ)料和甲醇-乳酸混合補(bǔ)料等；對(duì)于mut-重組菌，在甲醇誘導(dǎo)菌體不生長(zhǎng)，為了維持 一定的生長(zhǎng)速度，在誘導(dǎo)階段加入一定量的甲醇后，還需流加甘油等維持菌的生長(zhǎng)。在 誘導(dǎo)階段，不同的甲醇流加策略對(duì)重組菌表達(dá)外源蛋白的影響很大。文獻(xiàn)中報(bào)道的甲醇 流加策略有間歇式恒速流加、DO stat流加和居于甲醇傳感器的反饋控制流加。這些 甲醇流加方式在不同程度上存在局限性。間歇式恒速流加流加速率的控制比較困難， 當(dāng)流加速率設(shè)置的太大，容易造成發(fā)酵液中甲醇的蓄積，從而影響外源蛋白的表達(dá)，當(dāng) 流加速率設(shè)置的太小，發(fā)酵液中甲醇濃度始終處于很低的水平，影響誘導(dǎo)效果。DOstat 流加，發(fā)酵液中甲醇濃度始終處于很低的水平，誘導(dǎo)效果不加。居于甲醇傳感器的反饋 控制流加，該方法需要使用甲醇傳感器，目前甲醇傳感器還不是很成熟，還存在一些問(wèn) 題，如傳感器對(duì)甲醇濃度非線性響應(yīng)、零點(diǎn)漂移等，在此基礎(chǔ)上要進(jìn)行有效控制有一定的困難。因此，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單易行的甲醇流加策略，對(duì)于提高發(fā)酵表達(dá)外源蛋白十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種畢赤酵母發(fā)酵方法，從而可以通過(guò)高密度發(fā)酵，高 效地生產(chǎn)外源蛋白。 本發(fā)明所述的重組畢赤酵母發(fā)酵方法，包括三個(gè)階段，甘油分批發(fā)酵階段、甘 油補(bǔ)料發(fā)酵階段和外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段。甘油分批階段，菌體利用培養(yǎng)中甘油生長(zhǎng)， 當(dāng)培養(yǎng)基中甘油耗盡時(shí)開始流加甘油，進(jìn)一步提高菌濃。最后進(jìn)入外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階
段，在該階段采用脈沖式流加甲醇誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。 本發(fā)明所說(shuō)脈沖式甲醇流加是指在發(fā)酵液中甲醇耗盡時(shí)，以發(fā)酵液中溶氧反彈 作為指示， 一次性流加甲醇使發(fā)酵液中甲醇濃度至設(shè)定值。待下一次甲醇耗盡時(shí)，重復(fù) 這一操作，周期性執(zhí)行，直至發(fā)酵結(jié)束。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是綜合了 DO Stat和間歇式恒速流加的優(yōu)點(diǎn)，即以溶氧作為發(fā)酵液 中甲醇是否耗盡的指示，當(dāng)溶氧反彈表示發(fā)酵液中甲醇耗盡，然后以恒速流加的方式一 段時(shí)間甲醇至所需濃度。有效克服了外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段甲醇間歇式恒速流加、DO stat流加和居于甲醇傳感器的反饋控制流加存在的不足，


圖1、誘導(dǎo)階段過(guò)程數(shù)據(jù)圖 圖2、誘導(dǎo)不同時(shí)間下融合蛋白IFN13 -HSA表達(dá)情況的SDS-PAGE分析 M :低分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :誘導(dǎo)前的樣品；2 :誘導(dǎo)12h的樣品；3 :誘導(dǎo)24h的 樣品；4 :誘導(dǎo)36h的樣品；5 :誘導(dǎo)48h的樣品；6 :誘導(dǎo)60h的樣品；7 :誘導(dǎo)72h的 樣品；8 :誘導(dǎo)84h的樣品；9 :誘導(dǎo)96h的樣品； 圖3、誘導(dǎo)不同時(shí)間下融合蛋白IFN a 2b-HSA表達(dá)情況的SDS-PAGE分析 M :低分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :誘導(dǎo)24h的樣品；2 :誘導(dǎo)36h的樣品；3 :誘導(dǎo)42h的
樣品；4 :誘導(dǎo)59h的樣品；5 :誘導(dǎo)66h的樣品；7 :誘導(dǎo)70h的樣品；7 :誘導(dǎo)90h的 樣品；8 :誘導(dǎo)96h的樣品
實(shí)施例1表達(dá)P干擾素-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFNP -HSA由
本室構(gòu)建保存，該重組畢赤酵母甲醇利用表型為mut+。 取lml-8(TC甘油管保存的菌種GS115/pPIC9K-IFNP-HSA，融化后，接入裝 有50ml BMGY培養(yǎng)基(1 % Yeast Extract, 2 % Peptone, 2 % Glycerol, lOOmM potassium phosphate pH6.0， 1.34 % Yeast Nitrogen Base, 4X 10-5Biotin)的250ml搖瓶中，于 200rmp， 3(TC培養(yǎng)24h，制備得到一級(jí)種子。取以5 %的接種量將一級(jí)種子接入裝有 100ml BMGY培養(yǎng)基的1L三角瓶中，于200rmp， 3(TC培養(yǎng)24h，制備得到二級(jí)種子。 按5%的接種量把二級(jí)種子接入裝有2L BMGY培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵初始條 件為溫度3(TC、轉(zhuǎn)速500rpm、通氣量2VVM、 pH6.0后開始發(fā)酵。發(fā)酵約22h左右，初 始培養(yǎng)基中的碳源甘油消耗完，溶氧開始反彈，此時(shí)開始流加補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基(5% Yeast Extract, 10 % Peptone, 10 % Glycerol, 6.7 % YNB， 2X10-4 % Biotin)，流速為2.5mL/min，共補(bǔ)料600mL。補(bǔ)料完成后，待再次溶氧上升超過(guò)60%時(shí)，開啟甲醇脈沖式流加， 一次性補(bǔ)加0.5%發(fā)酵液體積的甲醇。周期性執(zhí)行，每當(dāng)溶氧上升超過(guò)60%時(shí)， 一次性補(bǔ) 加0.5%發(fā)酵液體積的甲醇，誘導(dǎo)96h，典型的誘導(dǎo)階段過(guò)程曲線如圖1。 SDS-PAGE電 泳檢測(cè)不同時(shí)段表達(dá)情況(如圖2)，用雙抗體夾心Elisa方法定量檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)融合蛋 白的表達(dá)量為500mg/L。
實(shí)施例2表達(dá)干擾素a 2b-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFN a 2b-HSA
由本室構(gòu)建保存，該重組畢赤酵母甲醇利用表型為mut+。 取lml-80。C甘油管保存的菌種GS115/pPIC9K-IFNa 2b-HSA，融化后，接入裝 有50mlBMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于200rmp， 3(TC培養(yǎng)24h，制備得到一級(jí)種子。 取以5%的接種量將一級(jí)種子接入裝有100mlBMGY培養(yǎng)基的1L三角瓶中，于200rmp， 3(TC培養(yǎng)24h，制備得到二級(jí)種子。按5X的接種量把二級(jí)種子接入裝有2LBMGY培養(yǎng) 基的5L發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵初始條件為溫度3(TC、轉(zhuǎn)速500rpm、通氣量2VVM、 pH6.0 后開始發(fā)酵。發(fā)酵約22h左右，初始培養(yǎng)基中的碳源甘油消耗完，溶氧開始反彈，此時(shí) 開始流加補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基，流速為2.5mL/min，共補(bǔ)料600mL。補(bǔ)料完成后，待再次溶 氧上升超過(guò)60%時(shí)，開啟甲醇脈沖式流加， 一次性補(bǔ)加0.5%發(fā)酵液體積的甲醇。周期性 執(zhí)行，每當(dāng)溶氧上升超過(guò)60%時(shí)， 一次性補(bǔ)加0.5%發(fā)酵液體積的甲醇，誘導(dǎo)96h，典型 的誘導(dǎo)階段過(guò)程曲線如圖1。 SDS-PAGE電泳檢測(cè)不同時(shí)段表達(dá)情況(如圖3)，用雙抗體 夾心Elisa方法定量檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)融合蛋白的表達(dá)量為300mg/L。
權(quán)利要求
一種重組畢赤酵母的發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法包括三個(gè)部分，甘油分批階段、甘油補(bǔ)料階段和甲醇誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)階段，其特征在于，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)階段甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段采用甲醇脈沖式補(bǔ)料。
2. 如權(quán)利要求1所述發(fā)酵方法，其特征在于，其中所說(shuō)的甲醇脈沖脈沖式補(bǔ)料是在發(fā) 酵液中甲醇耗盡時(shí)一次性補(bǔ)入甲醇使發(fā)酵液中甲醇濃度至設(shè)定值，周期性執(zhí)行這一操作 直至發(fā)酵結(jié)束。
3. 如權(quán)利要求2所述，其特征在于，設(shè)定的甲醇濃度范圍為0.05%至5%。
4. 如權(quán)利要求3所述，其特征在于，設(shè)定的甲醇最佳濃度為0.5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的重組畢赤酵母的發(fā)酵方法。在甘油生長(zhǎng)重組畢赤酵母的基礎(chǔ)上，采用脈沖式甲醇補(bǔ)料誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。該方法在甲醇流加控制時(shí)不需使用甲醇傳感器，同時(shí)克服DO stat補(bǔ)料誘導(dǎo)過(guò)程中的甲醇濃度過(guò)低，也克服了恒速間歇式恒速流加誘導(dǎo)過(guò)程中由于補(bǔ)料速度過(guò)快而帶來(lái)的甲醇蓄積和補(bǔ)料速度過(guò)低導(dǎo)致的甲醇濃度過(guò)低等缺點(diǎn)。采用脈沖式甲醇補(bǔ)料后，重組長(zhǎng)效融合干擾素的表達(dá)量得到了很大程度的提高。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101691595SQ20091018469
公開日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者儲(chǔ)敏, 朱瑞宇, 李英, 金堅(jiān), 陳蘊(yùn), 雷楗勇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)