專利名稱：一種棉花脫水素類似基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種棉花脫水素類似基因以及其構(gòu)建的 植物表達載體及其在耐旱、耐寒、耐鹽堿轉(zhuǎn)基因植物研制方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在自然界，植物暴露在各種各樣的環(huán)境條件下，水分虧缺，冷和凍，熱，鹽和氧匱乏 是影響植物生長的主要環(huán)境因子。大多數(shù)農(nóng)作物對不良環(huán)境條件是敏感的，經(jīng)常會由于環(huán) 境脅迫而產(chǎn)生減產(chǎn)。在脅迫發(fā)生期間，植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列生理生化變化，如糖，脂，蛋白 質(zhì)和核酸以及光合作用，固氮作用和呼吸作用等以適應(yīng)脅迫。植物生長的不同階段，包括種 子萌發(fā)，種子成熟和衰老都不同程度受脅迫條件的影響。植物不能依靠自身的運動趨利避害，所以在長期的進化過程中形成了一系列主動 適應(yīng)外界環(huán)境變化以保護自身的機理。在逆境條件下，植物細胞會發(fā)生諸如可溶性蛋白、糖 類、有機酸、脯氨酸、ABA含量的增加，新的蛋白異聚體的出現(xiàn)，膜脂成分的改變等相應(yīng)變化。 同樣在鹽分脅迫和干旱條件下也可以誘發(fā)植物細胞啟動保護機制，以減少水分喪失。同時 在植物種子形成過程為了保證能適應(yīng)各種逆境和長期保存，也存在一個脫水過程。在這些 過程中，涉及到一些與植物脫水有關(guān)的基因及其產(chǎn)物，脫水素(dehydrin)就是其中較重要 的一種，它們主要功能是保護植物細胞中的大分子在脫水過程中不受傷害，使植物對干旱、 鹽堿、寒冷等水分脅迫相關(guān)的非生物逆境表現(xiàn)出更好的耐受能力。脫水素的一個重要結(jié)構(gòu)特征是它具有3類非常保守的區(qū)域K、S和Y片段，其中K 片段是所有脫水素都具有的。K片段富含賴氨酸，通常位于C端，可具有1到12個重復(fù)，一 般由15個氨基酸殘基組成(EKKGIMDKIKEKLPG)，其中也可能存在某些單核苷酸的置換或結(jié) 構(gòu)上的修飾。K片段能形成雙親性的α 2螺旋，這是脫水素的重要功能結(jié)構(gòu)。許多脫水素還 含有由絲氨酸殘基組成的S片段。有證據(jù)表明S片段的磷酸化可以使脫水素在信號肽的引 導(dǎo)下進入細胞核。很多脫水素的N端還具有另一類保守區(qū)域Y片段。它的序列為DEYGNP， 與植物和細菌分子伴侶的核酸結(jié)合位點有同源性。除了以上3個保守區(qū)域外，脫水素還具 有另外一些保守性稍差的區(qū)域，這些區(qū)域富含甘氨酸和極性氨基酸(特別是蘇氨酸)，稱作 S片段，它們通常分布于K片段之間?；?種保守區(qū)域組成的不同，可將脫水素分為5種類型^iSK2、Kn、SKn、KnS和 Y2Kn。^iSK2型脫水素是最豐富的一類，含有1到3個Y片段、1個S片段和2個K片段，是 一類堿性或中性蛋白質(zhì)，能被干旱或脫落酸(abscisic acid, ABA)誘導(dǎo)，但不被低溫誘導(dǎo)。 Kn型脫水素含有2到9個K片段，而不含有Y片段和S片段，是一類酸性或中性蛋白質(zhì)，能 被低溫、干旱和ABA誘導(dǎo)，并且被低溫誘導(dǎo)的能力要強于干旱和ABA。SKn型脫水素含有1 個S片段和2到3個K片段，是一類酸性蛋白質(zhì)，它們優(yōu)先被低溫誘導(dǎo)。KnS型脫水素的K 片段與其它類脫水素有所不同，起始序列為KEG(其它類的起始序列為EKKG)，它們能被低 溫和干旱誘導(dǎo)。Y2Kn型脫水素含有2個Y片段和1到2個K片段，是一類酸性蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種棉花脫水素類似基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明的第二個目的在于提供棉花脫水素類似基因的cDNA序列，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種棉花脫水素類似蛋白，由SEQ ID NO 1所示核 苷酸序列編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。本發(fā)明的第四個目的在于提供含有所述棉花脫水素類似基因的植物表達載體。本發(fā)明的第五個目的在于提供用所述植物表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或植 株。本發(fā)明的第六個目的在于所述棉花脫水素類似基因在可提高對水分脅迫相關(guān)非 生物逆境耐受能力的植物品種中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)路線為1)干旱處理棉花幼苗；2)從經(jīng)干旱處理的的棉花幼苗上取葉片，并從葉片提取總RNA ；3)mRNA差異顯示分析，得到差異表達的cDNA片段；4)根據(jù)差異表達的cDNA片段，用RACE方法獲得棉花脫水素類似基因，命名為 GhDhl ；6)構(gòu)建(ihDhl植物表達載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草，采 用干旱模擬實驗驗證轉(zhuǎn)(^hDhl基因煙草，比對照煙草具有更強的耐旱能力。本發(fā)明克隆了一種棉花棉花脫水素類似基因(ihDhl，構(gòu)建(ihDhl基因植物表達載 體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)(^hDhl基因煙草，采用干旱模擬實驗驗證轉(zhuǎn)(ihDhl 基因煙草，比對照煙草具有更強的耐旱能力，且(^hDhl基因在煙草中的表達能在一定程度 上提高煙草種子在萌發(fā)過程中對干旱脅迫的抵抗能力。


圖1是棉花總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是差異片段的反向Northern Dot blot圖；圖3是棉花脫水素類似蛋白(ihDhl親水性分析圖；圖4是植物表達載體pBI 121-GhDhl構(gòu)建流程圖；圖5是轉(zhuǎn)GhDhl基因煙草GhDhl基因Southern雜交檢測圖；圖6A、6B和6C是轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草PEG模擬干旱脅迫實驗結(jié)果示意圖；圖7是煙草幼苗干旱模擬實驗結(jié)果示意圖；圖8是煙草幼苗干旱處理后重新澆水實驗結(jié)果示意圖；圖9A是轉(zhuǎn)空載體pBI121和轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草Tl代種子萌發(fā)狀況對比圖； 和9B是轉(zhuǎn)空載體PBI121煙草Tl代種子萌發(fā)狀況圖示；
圖9C是轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草Tl代種子萌發(fā)狀況圖示。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進一步詳細說明。
實施例1棉花脫水素類似基因(ihDhl的克隆一、棉花材料的處理鄂雜棉11號Fl代種子萌發(fā)15天，取整株材料干旱誘導(dǎo)8小時，凍存于_70度冰箱。二、棉花總RNA的提取A.取0. Ig棉花葉片液氮研磨后，加0. 5ml植物RNA提取液(購自invitrogen)， 振蕩至徹底混勻。B.室溫放置5分鐘。C. 4"C 12，OOOrpm離心1分鐘，上清轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。D.加入 0. Iml 5M NaCl，溫和混勻。E.加入0. 3ml氯仿，上下顛倒混勻。F. 4"C 12，OOOrpm離心10分鐘，取上層水相轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。G.加與所得水相等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。H.4°C 12，OOOrpm離心10分鐘。棄掉上清，注意不要倒出沉淀。加Iml 75%乙I. 40C 5，OOOrpm離心3分鐘。倒出液體，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸 出，室溫晾干2-3分鐘。J.加50 μ 1無RNase水，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。提取的總RNA用瓊脂糖凝膠檢測完整性，電泳結(jié)果如圖1所示。三、RNA樣品中DNA污染的去除Α.在 RNase-free 的 Eppendorf■管中依次力口入 16 μ 1 總 RNA、2 μ 1 10XBuffer> 1 μ IRnaseOUTU μ 1 RNase-free DNaseI (2U/μ 1)；B.室溫放置 15min ；C.力卩入 2μ1 25mM EDTA，65°C保溫 15min。四、mRNA差異顯示分析依據(jù)GEN0MYX 公司 f IuoroDD Kit System 進行操作(一 )逆轉(zhuǎn)錄1、在0· 2mltube中，加入下列成分總RNA(0. lug/ul) 2. OulHIEROGLPH T7(dT12)AP anchored primer (2uM) 2. Oul2、70°C水浴10分鐘。立即放置在冰浴中。3、加入下列成分2. Oul 10XSuperScriptII RT buffer ；2. Oul 250uM dNTP mix ；2.OullOOmM DTT ；9.8ul DEPC · H20 ;0·2ul 200U/ul SuperScriptII RT。4、進行下列循環(huán)42 °C 5 分鐘；50 °C 50 分鐘；70 °C 15 分鐘；4°C 保存( 二 ) DDRT-PCR 1、向0. 2ml tube中加入下列成分1. Oul RT mix (unlabeled 3，AP) ；1. Oul 10XPCR buffer ； 1. 5ul 25mM MgCl2 ； 2. 0ul250uM dNTP ； 1.75ul 2uM 5' ARP ；0.7ul 5uM 3' TMR-AP (flurescent 3' AP)；1. 75ulH20 ；0.Iul AmpliTaq(5U/ul)2、進行下列循環(huán)950C 2 分鐘；92°C 15 秒，50°C 30 秒，72°C 2 分鐘共 4 個循環(huán)；92°C 15 秒，60°C 30秒，72 °C 2分鐘共30個循環(huán)；4°C3、取 4. Oul DDRT-PCR 產(chǎn)物，加入 1. 5ul fluoro loading buffer，95°C變性 5 分 鐘，冰浴，上樣。(三)聚丙烯酰胺凝膠電泳1、清洗33 X 61cm的低熒光玻璃和250微米spacer及梳子2、配制5. 6%序列膠取70ml 5. 6% denaturing HR-IOOOgel (FL407), 560ul 10% APS,56ul TEMED 混 勻，鋪膠，使膠聚合1小時3、上槽加入0. 5 X TBE，下槽加入IXTBE4、上樣，兩側(cè)力口入 4. Oul DNA standard marker 禾口 1. 5ul fluoroDD loading dye5、電壓 3000V，5 小時6、蒸餾水多次沖洗序列膠7、GenomyxSC Fluorescent Imaging Scanner 掃描呈像(四)DDRT-PCR 產(chǎn)物的第二次 PCR 1、將所切的膠條放入含有30ulTE buffer的0. 5ml tube中，37°C，溫育1-2天2、在0. 2ml tube中加入下列成分2ul 膠溶液；2ul 10XPCR buffer ；1. 2ul 25mM MgCl2 ；0. 3ul IOOmM dNTP ；2ul2uM M13reverse primer ；2ul 2uM T7 Promoter primer ；0.5ul Taq03、循環(huán)參數(shù)95°C 2 分鐘；92°C 15 秒，50°C 30 秒，72°C 2 分鐘共 4 個循環(huán)；92°C 15 秒，60°C 30秒，72 °C 2分鐘共30個循環(huán)；4°C4、取IOul電泳檢測(五)反向Northern雜交，克隆和序列分析為降低差異顯示中的假陽性，進行了兩次反向Northern雜交。在克 隆片段之前進行第一次反向Northern雜交，取6ul擴增的片段同時點在兩張 Hybond-N+ (AmershamPharmarcia, U. S. A)尼龍膜上，用地高辛標記的dUTP分別以干旱誘導(dǎo) 和未誘導(dǎo)的棉花總RNA為模板標記總cDNA。在預(yù)雜交液中，65°C進行2_3小時的預(yù)雜交， 過夜進行雜交。陽性的cDNA片段被克隆到pGEM-T fesy載體(ftOmega，USA)上，每一條 片段選擇6個克隆，進行第二次反向Northern雜交。選擇陽性cDNA片段進行測序。反向 Northern的結(jié)果如圖2所示，其中A代表干旱誘導(dǎo)后的總cDNA探針，B代表干旱誘導(dǎo)前的 總cDNA探針，1-8代表mRNA差異顯示出差異片段。將經(jīng)過反向Northern Dot blot鑒定的mRNA差異顯示片段2號用引物T7和M13 擴增，回收后連入.pGEM -T Vector，篩選到陽性克隆后，進行序列分析，其核苷酸序列 如SEQ ID N0:4所示。該序列全長為579bp，經(jīng)BLAST搜索，未發(fā)現(xiàn)與dehydrin家族基因 同源性很高。按三個讀碼框翻譯出氨基酸序列，最大的讀碼框為4(^bp，編碼的135個氨基 酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
6
五、用RACE方法獲得棉花脫水素類似基因(ihDh 1全長cDNA依據(jù)已知部分cDNA序列，按照設(shè)計兩條基因特異性引物，序列如下GSPl :5’ CTGTTGCCGCCTCATCGCAC 3’GSP2 :5’ GGGACTGCACTGTCCTCTTC 3’以干旱誘導(dǎo)的總RNA為模板，用GSPl進行逆轉(zhuǎn)錄，隨后用GSP2和AAP進行PCR擴 增，具體操作如下A逆轉(zhuǎn)錄1、在0. 5ml離心管中加入以下成分Iul IOuM GSPl ；12.5ul (l-5ug)Total RNA ；13.5ul DEPC · H202、混勻，70°C變性10分鐘，置于冰浴中至少2分鐘，離心3、按下表加入以下成分2. 5ul 10XPCR buffer ；2. 5ul 0. IM DTT ；1. 25ul RNaseOUT (40U/ul)； 3ul25mMMgC12 ；1. 25ul IOmM dNTP,以上各種成分可在另一管中混勻，在45°C預(yù)熱4、混勻各種成分，離心，42°C溫育1-2分鐘5、加入 Iul SuperscriptII RT 混勻，42°C 10 分鐘，50°C 1-1. 5 小時6、70°C 15分鐘，以終止反應(yīng)7、離心 10-20 秒，37°C溫育，加入 Iul RNase Mix 混勻，37°C 30 分鐘8、離心，冰浴B純化cDNA單鏈ljfbinding solution 平衡至室溫2、取 IOOul ddH20 70°C溫育3、將120ul binding solution (6M NaI)加入到第一鏈合成混合物中，混勻4、將cDNA/Nal混合物轉(zhuǎn)移到GlassMAX離心柱中，13000g離心20s5、從管中取出柱子，將濾過液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，保存此管直至cDNA純化 完成，將離心柱放回原來的離心管中6、將0. 4ml冷1 Xwash buffer加入到柱子中，13000g離心20秒，棄濾過液重復(fù)3 次7、用0.鈿1冷70%乙醇洗2次柱子8、13000g離心1分鐘，以徹底除去殘留的乙醇9、將柱子轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，加入50ul 65°C預(yù)熱的ddH20，13000g離心20秒CcDNA 力口尾1、在0.5ml離心管中加入以下成分5. Oul 5Xtailing buffer ；2. 5ul 2mM dCTP ； 16. 5ul cDNA sample ；24. Oul H202、94°C 3分鐘，置于冰上1分鐘，離心3、加入 Iul TdT，混勻，37°C 10 分鐘4、65°C加熱10分鐘，離心，冰浴保存D 加尾 cDNA PCR 擴增1、在冰上，向0. 2ml離心管中加入以下成分5ul 10XPCR buffer ；3. Oul 25mM MgC12 ； 1. Oul IOmM dNTP ；2. Oul IOuM GSP2 ；2.Oul IOuM AAP ；5.Oul dC-tailed cDNA ；31.5ul ddH20。2、94°C 變性 5 分鐘3、加入 0. 5ul Taq 酶，混勻4、循環(huán)參數(shù)940C 5 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 2 分鐘 30 個；72°C 7 分鐘；5°C5、取5_20ul電泳檢測E 巢式 PCR:1、取 5ul 第一輪 PCR 產(chǎn)物加入 495ul TE buffer2、在冰上，向0. 2ul離心管中，加入以下成分5ul 10XPCR buffer ；3. Oul 25mM MgC12 ； 1. Oul IOmM dNTP ；2. Oul IOuM GSP2 ； 2.Oul IOuM AAP ；5.Oul dC-tailed cDNA ；31.5ul ddH20。3、94°C5 分鐘4、加入 0. 5ul Taq 酶，混勻5、循環(huán)參數(shù)940C 5 分鐘；94°C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 2 分鐘 30 個；72 °C 7 分鐘；5°C將第二輪PCR獲得的片段克隆至pGEM-T-easy載體上測序獲得基因5’端序列，其 核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。根據(jù)已知序列設(shè)計引物進行RT-PCR擴增并將獲得片段克隆至pGEM-T-easy載體 上測序，獲得(^hDhl cDNA全長序列如SEQ ID NO 2所示。根據(jù)已知序列設(shè)計引物進行PCR擴增基因組DNA并將獲得片段克隆至 pGEM-T-easy載體上測序，獲得GhDhl基因組DNA全長序列如SEQ ID NO 1所示。該(ihDhl基因的cDNA全長為909bp，包含一個600bp的開放讀碼框，編碼299個氨 基酸，從第312個堿基開始含有一個95bp的內(nèi)含子。它的5’端非翻譯區(qū)長為87bp，3’端 非翻譯區(qū)長為219bp。(ihDhl編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，該基因編碼的299個氨基 酸序列具有脫水素蛋白的明顯特征，含有一個S片段和兩個K片段。將推導(dǎo)出的氨基酸全序列在NCBI Genebank上進行Blast搜索，同源性最高的幾 個搜索結(jié)果如下g bA A N 7 8 1 2 5.1 dehydrin [Citrus χ paradisi]1383e-31
gbIAAC02689. 1|coId regulated LTC0R18[Lavatera thuringiaca]1206e-26
refXP_002285919.1 I PREDICTED !hypothetical protein[Vitis vi...1083e-22
e mbCAN66038. 1hypothetical protein [Vitis vinifera]1083e-22
g bAAP56259.1 dehydrin [Citrus sinensis]1023e-20
g bABC68275.1 dehydrin [Coffea canephora]99.4 2e-19gb AAT06600. 2 | dehydrin [Lupinus albus] 96. 7 le-18gb |ABS12348. 1 | dehydrin[Populus χ canadensis] 95.9 2e-18ref | NP_850947. 1 | ERDlO (EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION 10). 95.9 2e-18gb |ABS12346. 1 | dehydrin[Populus maximowiczii] 95. 5 2e-18emb | CAA78515. 1 | dehydrin-cognate [Pisum sativum] 94.4 5e-18用軟件DNAMAN計算(ihDhl蛋白的pi = 5. 48，預(yù)測的分子量是22. 420kD，分析 GhDhl蛋白氨基酸殘基的親水性，如圖3所示，可見它是一個親水性很強的蛋白。實施例2 (ihDhl基因植物表達載體的構(gòu)建請參閱圖4，將PCR擴增得到的(ihDhl基因cDNA用T4DNA連接酶連接至 pGEM-TEasy 上得到質(zhì)粒 pGEM-GhDhl，用 BamHl 和 SacI 同時雙酶切 pGEM-GhDhl 和 pBI121， 分別獲得(^hDhl片段和線性pBI121載體，用T4DNA連接酶將(ihDhl片段和線性pBI121載 體連接，得到(^hDhl基因植物表達載體pBIl21-GhDh 1。實施例3利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草1、根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞的制備1)挑取新鮮的LBA4404單菌落接種于含適量抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng) 至對數(shù)生長期；2)4°C，8000rpm離心5分鐘，收集菌體于小離心管中；3)用600 μ 1冰預(yù)冷的500mM CaCl2重懸洗滌細胞；4) 40C，8000rpm離心5分鐘，細胞沉淀中加入100 μ 1冰預(yù)冷的500mM CaCl2,混 勻后備用04-48小時后使用效果最佳)。2、根癌農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化1)加入1 μ 1植物表達載體質(zhì)粒DNA至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，于液氮中 速凍5分鐘，37°C溫浴5分鐘；2)加入600μ1 LB液體培養(yǎng)基輕搖4-6小時，室溫，6000rpm離心3分鐘，富
集菌體；3)保留50-200 μ 1菌液，混勻，均勻涂布于含適量抗生素的LB選擇平板上，28°C倒 置培養(yǎng)兩天。4)挑取新鮮菌落，進行PCR鑒定，篩選陽性克隆。3、煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，將經(jīng)PCR法鑒定的陽性植株移栽到土壤中，煙草生長正常。4、轉(zhuǎn)基因煙草植株的Southern檢測用SDS法提取煙草葉片總DNA，EcoR I消化后走瓊脂糖凝膠電泳，以DIG標記 的(ihDhl基因為探針進行Southern雜交，表明(ihDhl已經(jīng)整合到煙草中，雜交結(jié)果如圖5
9所示，1號泳道為正對照、2號泳道為未轉(zhuǎn)基因煙草負對照，3號和4號泳道為轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草。5, GhDhl基因功能鑒定及轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草的干旱耐受實驗(1) PEG模擬干旱脅迫實驗請參閱圖6A，將卡那抗性煙草置于含3 % PEG4000的生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，20天 后觀察，植株生根，圖6B和6C為對照煙草(即非轉(zhuǎn)基因植株)置于含3% PEG4000的生根 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，20天后觀察，不生根，葉緣黃化，表現(xiàn)出較重的干旱脅迫的癥狀。(2)轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草干旱耐受實驗以未轉(zhuǎn)基因煙草作為對照，將移栽到土壤后10天的的煙草進行干旱處理，結(jié)果顯 示，轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草干旱脅迫條件下生長狀況明顯好于對照，如圖7所示，1為非轉(zhuǎn)基因 對照植株、2為第6號轉(zhuǎn)基因株系、3為第15號轉(zhuǎn)基因株系；重新澆水進行復(fù)蘇后轉(zhuǎn)基因植 株與對照組相比受干旱影響較小，如圖8所示，1為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?為第6號轉(zhuǎn)基因株 系、3為第15號轉(zhuǎn)基因株系。(3)轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草Tl代種子萌發(fā)實驗請參閱圖9A、9B和9C，9A中A代表轉(zhuǎn)GhDhl基因Tl代種子，CK代表轉(zhuǎn)PBI121載 體Tl代種子。分別選取轉(zhuǎn)(ihDhl基因煙草各6個株系的Tl代種子，以轉(zhuǎn)空載體PBI121的煙草 (圖9B)做為對照，在附加13% PEG的MS培養(yǎng)基上進行萌發(fā)試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)(ihDhl基 因煙草第11號株系的種子萌發(fā)明顯快于轉(zhuǎn)空載體的煙草種子(圖9C)，而且在萌發(fā)后的生 長速度也比對照快。這說明(^hDhl基因在煙草中的表達能在一定程度上提高煙草種子在萌 發(fā)過程中對干旱脅迫的抵抗能力。SEQUENCE LISTING<110>創(chuàng)世紀轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司<120> 一種棉花脫水素類似基因及其應(yīng)用<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>720<212>DNA<213> 棉花<400>1
0184]gaagtgatccacaatcttgatacggtaatacgttaggtagttttcagcatacttgttttg600185]agtttagtggttgtagataaagaaaaaatggctgaggagcataccaaggttggtggtgag1200186]gaagcagtggcgagcaaggagcgagggatgtttgatttcttggggaagaaagaagaggag1800187]aagcctcaacctcaagaggaggtggtgtccacccagtttgagaaagtcaagatagaagag2400188]gaacataaggaagatgagaagaaacacagtctcctggacaagcttcaccgatccaatagc3000189]agctccagctcttctagtgacgaggaagaaggtgaaggtgaaggcggagagaagaagaag3600190]aagaaaaaggagaagaagggaaagaaagaagaggacagtgcagtcccagtggagaagtgc4200191]gatgaggcggcaacagttcaccactcagagacgccggaaaagaagggtttcatggagaag480
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<210>3
<211>199
<212>PRT
〈213〉棉花
<400>3
Met Ala Glu Glu His Thr Lys ValGly Gly Glu Glu Ala Val Ala Ser
151015
Lys Glu Arg Gly Met Phe Asp PheLeu Gly Lys Lys Glu Glu Glu Lys
202530
Pro Gln Pro Gln Glu Glu Val ValSer Thr Gln Phe Glu Lys Val Lys
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505560



Lys
65
Glu
Leu His Arg Ser Glu Gly
Gly
Lys Gly Lys
Glu Ala Ala 115 Lys
Asn 70 Gly
Lys 100 Thr
Glu 85
Glu Glu
Ser Ser Ser Ser Glu Lys
Gly Asp Ser
Val His His
lie Lys Asp
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Val Thr Thr Pro
Glu 145 His
Lys
Lys
Pro 150 Thr
Lys 135 Pro
Ser 120 Leu
Ala 105 Glu
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Glu Lys lie 180
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Lys Tyr His
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Lys
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Pro
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Ser
Lys
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Ser
Lys
Glu
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Asp
Asp
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Lys 110 Lys
Lys
Glu
Glu
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Lys
Glu
95
Cys
Gly
Asp
Asn
Lys 175 Lys
Asp
Phe
Glu
Asp 160 lie
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<210>4
<211>579
<212>DNA
<213>棉花
<400>4
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<213>棉花
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1權(quán)利要求
1.一種棉花脫水素類似基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棉花脫水素類似基因，其特征在于所述棉花脫水素類 似基因的cDNA序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權(quán)利要求2所述的棉花脫水素類似基因編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQID NO :3所示的氨基酸序列。
4.含有權(quán)利要求1或2所述棉花脫水素類似基因的植物表達載體。
5.用權(quán)利要求4所述植物表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或植株。
6.權(quán)利要求1或2所述棉花脫水素類似基因在耐旱、耐寒、耐鹽堿植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供了棉花脫水素類似基因GhDh1，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，構(gòu)建GhDh1基因植物表達載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)GhDh1基因煙草，采用干旱模擬實驗驗證轉(zhuǎn)GhDh1基因煙草，比對照煙草具有更強的耐旱能力，且GhDh1基因在煙草中的表達能在一定程度上提高煙草種子在萌發(fā)過程中對干旱脅迫的抵抗能力。
文檔編號C12N15/29GK102080088SQ20091018955
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者孫超, 崔洪志, 王君丹, 陳文華 申請人:創(chuàng)世紀轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司