專利名稱：一種生物素化蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及生物素化重組蛋白的制備工 藝。
背景技術(shù)：
生物素可特異性地與親和素(Avidin)、鏈霉親和素(Streptavidin)非常緊密地結(jié) 合，每個親和素或鏈霉親和素能結(jié)合4個分子的生物素，且親和力極強，親和素常數(shù)(K) 為1015L/mol，比抗原與抗體間的親和力(K = 10.5 llL/mol)至少高100倍，二者的 結(jié)合特異性高和穩(wěn)定性好。利用此種生物素-親合素系統(tǒng)具有特異性強的親和作用，可 將蛋白質(zhì)標記上生物素(即生物素化蛋白)后，可被親和素/鏈霉親和素特異性的結(jié)合， 從而實現(xiàn)識別檢測、生物大分子捕獲、蛋白相互作用檢測等應(yīng)用。生物素化蛋白已經(jīng)廣 泛應(yīng)用于免疫學、細胞生物學和分子生物學的實驗研究領(lǐng)域，例如在高通量蛋白質(zhì)相互 作用篩選中，得到廣泛運用的AlphaScreen技術(shù)(www.perkinelmer.com)，就是利用微珠 表面的鏈霉親和素把生物素化的蛋白固定作為供體，而受體微珠則利用微珠表面的蛋白 A(ProteinA)固定另一蛋白。在激光(波長為680nm)的照射下，供體微珠上的光敏劑將 周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單體氧，單體氧擴散至受體微珠，與其上的化學發(fā) 光劑反應(yīng)，激活了在受體微珠上的熒光基團，使之發(fā)出波長為520 620nm的熒光(單體 氧的半衰期為4μ Sec，在溶液中的擴散距離為200nm左右。如果生物分子不存在相互作 用，單體氧無法擴散到受體微珠，則不會有熒光信號產(chǎn)生)。目前制備生物素化蛋白質(zhì)的方法有(1)將目的蛋白純化后通過化學生物素標 記法得到生物素化蛋白，通常利用生物素的羧基加以化學修飾可制成各種活性基團的衍 生物，然后與目的蛋白質(zhì)進行化學反應(yīng)。此種方法由于反應(yīng)條件比較劇烈，化學方法生 物素化過程中，一些相對敏感的蛋白容易失活；同時，由于活化的生物素不具有識別特 定蛋白質(zhì)的能力，因而化學方法生物素化是非特異的。(2)通過生物素化標簽與目的蛋白 融合表達，在體內(nèi)或體外把生物素標簽進行生物素化，從而實現(xiàn)重組蛋白的生物素化。 如通過大腸桿菌生物素連接酶(BiotinLigase)活化生物素形成生物素酰-5'-腺苷酸，將 生物素特異地轉(zhuǎn)移到生物素受體標簽蛋白-AviTag的賴氨酸上，使蛋白生物素化；大腸 桿菌生物素?；d體蛋白(biotin carboxylcarrier protein, BCCP)是大腸桿菌CoA羧化酶 的一個亞基，能夠在生物素合酶的催化下，在其C端賴氨酸上連上一個生物素，使蛋白 生物素化。這種特異性的定點修飾，對蛋白的活性影響小，產(chǎn)物專一，但是此種方法必 須把目的蛋白與生物素標簽(如AviTag等)進行融合表達，然后進行純化得到高純度的 重組蛋白，但是生物素受體標簽蛋白-AviTag不能適用于蛋白純化，而且也無法提高重組 蛋白的表達效率和可溶性，往往導致與AviTag融合蛋白不能可溶表達或難以純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，該方法操作簡便、生物素化效率高、蛋白結(jié)構(gòu)和活性不受生物素化影響。本發(fā)明所述的一種生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種具有多功能的聯(lián)合標簽的蛋白表達載體，所述聯(lián)合標簽至少包括 便于重組蛋白純化的標簽，含有特異蛋白酶切位點的標簽，以及生物素化標簽；(b)把目的蛋白的編碼序列克隆到步驟(a)所述的蛋白表達載體中，所述聯(lián)合標 簽與目的蛋白進行融合表達，獲得可在體內(nèi)或體外對融合蛋白中的生物素化標簽進行生 物素化的重組蛋白；以及(c)采用與聯(lián)合標簽相適應(yīng)的特異性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重組蛋白純化 的標簽，并切斷聯(lián)合標簽中的特異蛋白酶切位點，獲得生物素化蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明所述的生物素化蛋白質(zhì)的制備方法的進一步特征，所述便于重組蛋 白純化的標簽至少包括六組氨酸(6His)標簽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽、麥芽糖結(jié) 合蛋白(MBP)標簽、硫氧還蛋白(Trx)標簽。根據(jù)本發(fā)明所述的生物素化蛋白質(zhì)的制備方法的進一步特征，所述含有特異 蛋白酶切位點的標簽至少包括小泛素相關(guān)修飾物(Small ubiqitin-related Modifer， SUMO)、煙草蝕紋病毒蛋白酶(Tobacco etch virus Protease)識別序列、腸激酶 (Enterokinase)識別序列、凝血酶(Thrombin)識別序列、Xa因子(FactorXa)識別序列。根據(jù)本發(fā)明所述的生物素化蛋白質(zhì)的制備方法的進一步特征，所述的生物素 化標簽至少包括AviTag(GLNDIFGAQKIEWHE)及其衍生物、大腸桿菌生物素?；d 體蛋白(biotincarboxyl carrier protein，BCCP)及其衍生物、酵母受體肽(yeast acceptor peptide, yAP) (TTNWVAQAFKMTFDP)及其衍生物。本發(fā)明還提供了一種蛋白表達載體，該載體含有具有多功能的聯(lián)合標簽，以及 可調(diào)控的啟動子、復制起始子、抗性篩選標記元件，所述聯(lián)合標簽至少包括便于重組 蛋白純化的標簽，含有特異蛋白酶切位點的標簽，以及生物素化標簽。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括如前所述的蛋白表達載體、特異性的蛋白 酶、能將生物素化標簽進行生物素化的細胞或酶。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進一步特征，所述特異性的蛋白酶至少包括小泛 素相關(guān)修飾物蛋白酶、煙草蝕紋病毒蛋白酶、腸激酶、凝血酶、Xa因子。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進一步特征，所述能將生物素化標簽進行生物素化 的細胞至少包括表達細菌生物素連接酶的細胞、表達細菌生物素合成酶的細胞、表達 酵母生物素連接酶的細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進一步特征，所述把生物素化標簽進行生物素化的 酶至少包括細菌生物素連接酶、細菌生物素合成酶、酵母生物連接酶。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)利用生物素標簽，如AviTag，可在體內(nèi)或體外被生物 素連接酶高效和高特異性生物素化的特性，與目的蛋白進行融合表達，所獲得的生物素 化蛋白是在生物素化標簽進行生物素化，而不是在目的蛋白上進行生物素化，因此對目 的蛋白的活性和結(jié)構(gòu)影響很小；(2)利用其它標簽提供便捷高效的純化方法，然后再利 用蛋白酶切除其它標簽，只保留生物素化標簽和目的蛋白，從而獲得生物素化蛋白。通 過本發(fā)明所述制備方法獲得的生物素化蛋白質(zhì)能夠最大程度保證生物素化的均一性和蛋 白的活性，并且能夠定向固定在親和素包被的磁珠表面，可廣泛用于免疫檢測、復合物捕獲、AlphaScreen等應(yīng)用中。


圖1是利用“聯(lián)合標簽”制備生物素化蛋白的原理圖；圖2是利用“TrxHisSUMOAvi”制備生物素化的Avi-AMLl蛋白的流程圖；圖3 是 pReceiver-B62 載體圖譜； 圖4顯示TrxHisSUMOAvi-AMLl蛋白分別用抗6組氨酸單克隆抗體(Anti-His) 和鏈霉親和素-辣根過氧化酶(Strepavtidin-HRP)進行蛋白質(zhì)免疫印跡(WestemBolt)檢 測的結(jié)果；圖5顯示利用Ni-NTA親和層析純化TrxHisSUMOAvi-AMLl蛋白的SDS-PAGE
檢測結(jié)果；圖6顯示TrxHisSUMOAvi-AMLl蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶切后，利用Ni-NTA 親和層析，純化Avi-AMLl蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果，圖中箭頭所示蛋白為切除了 TrxHisSUMO 后的 Avi-AMLl 蛋白；圖7顯示經(jīng)MonoQ離子交換層析純化后的Avi-AMLl蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明所述的一種生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種具有多功能的聯(lián)合標簽的蛋白表達載體，所述聯(lián)合標簽至少包括 便于重組蛋白純化的標簽，含有特異蛋白酶切位點的標簽，以及生物素化標簽；(b)把目的蛋白的編碼序列克隆到步驟(a)所述的蛋白表達載體中，所述聯(lián)合標 簽與目的蛋白進行融合表達，獲得可在體內(nèi)或體外對融合蛋白中的生物素化標簽進行生 物素化的重組蛋白；以及(c)采用與聯(lián)合標簽相適應(yīng)的特異性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重組蛋白純化 的標簽，并切斷聯(lián)合標簽中的特異蛋白酶切位點，獲得生物素化蛋白質(zhì)。以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，目的在于本發(fā)明的內(nèi)容而非限制 發(fā)明的保護范圍。下面實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，如 Sambrook 等人著，分子克隆試驗指南(New York, Cold Spring Habour Laboratory Press) 中所述條件，或按照制造廠商建議條件進行。實驗所需菌種、質(zhì)粒、試劑等均為商品化 產(chǎn)品，可通過生物制品廠商購買獲得。實施例人類AMLl生物素化蛋白的制備制備方法將聯(lián)合標簽TrxHisSumoAvi與人類AMLl基因的編碼序列構(gòu)建成 融合表達克隆，于大腸桿菌中表達，Avi標簽被細菌內(nèi)生物素連接酶生物素化。重組 蛋白經(jīng)過層析純化后，用SUMO蛋白酶切除TrxHisSUMO標簽，獲得已經(jīng)生物素化的 Avi-AMLl蛋白(如圖2所示)。具體流程如下1.將人AMLl基因(GenBank登錄號L21756)的編碼序列克隆到質(zhì)粒 pRecevier_B62 (圖3)載體中獲得pTrxHisSumoAvi_AMLl表達克隆，進行測序驗證；
2.將pTrxHisSumoAvi-AMLl轉(zhuǎn)入到BL21 (DE3)菌株中，挑取單菌落到LB培養(yǎng)
基中過夜培養(yǎng)，第二天按轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8 時，加入中濃度為0.4mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4hrs ；隨后取Iml菌液，離心收集菌體，破 細胞后，離心分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后分別用抗6組氨酸單克隆抗體 (anti-His)和鏈霉親和素-辣根過氧化酶(Strepavtidin-HRP)進行Western Blot檢測，結(jié)果 均為陽性(圖4)，說明表達的重組蛋白同時含有His和已經(jīng)被生物素化；(注融合蛋白在表達時，細菌體內(nèi)所含的生物素連接酶可有效的把生物素鏈 接到AviTag上，因而重組蛋白是已經(jīng)生物素化的蛋白)3.將含有pTrxHisSumoAvi_AMLlBL21(DE3)菌株進行誘導表達，離心收集菌 體，按每克細菌加入 4ml 的裂解液(50mMTris，50mMNaCl, 2.5% Glycerol, pH 8.0)重
懸菌體，超聲破碎細胞振幅21%工作時間5.5sec間歇時間9.9sec，每次超聲時 間5min，重復3次，至液體變稀薄氣泡為止；4.取菌體破碎液離心，12,OOOrpm 30min，4°C,取上清至燒杯中，一邊攪拌，一 邊緩慢加入粉末狀的硫酸銨，至濃度為50%，繼續(xù)攪拌2小時，5.離心，12,OOOrpm 30min，4°C,棄上清，沉淀用 50mMTris，5OmM NaCl， 2.5% Glycerol, pH8.0 溶角軍；6.離心，12,OOOrpm 30min，4°C,取上清后，用孔徑為0.45 μ m濾膜過濾， 然后進行Ni-NTA親和層析，采用連續(xù)梯度洗脫方式，平衡液50mMTris(pH8.0)， 50mM NaCl, 2.5% Glycerol,洗脫液50mM Tris (pH8.0)，50mMNaCl, 2.5% Glycerol, 500mM Imidazol,按峰收集，每個收集樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖5所示， 泳道1是細胞裂解的上清；泳道2是蛋白標準參照，從上往下條帶分別為100、80、70、 60、50、40、30、25、20、15、IOkDa ；泳道3和泳道4是Ni-NTA層析的穿透；泳道5 至泳道15是Ni-NTA層析的洗脫；7.將含有目的蛋白的收集樣品，合并然后透析至50mMTris(pH8.0)，50mM NaCl，2.5% Glycerol 溶液中；8.將目的蛋白進行SUMO酶切，切除重組蛋白中的TrxHisSumo部分，酶切反應(yīng) 條件按照Genecopoeoia公司Coolcut protease產(chǎn)品說明書建議進行；9.然后進行 Ni-NTA 親和層析，平衡液50mM Tris (pH8.0)，50mM NaCl, 2.5 % Glycerol,洗脫液50mM Tris (pH8.0)，5OmM NaCl，2.5 % Glycerol, 500mM Imidazol,收集穿透液，隨后進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖6所示，泳道1是沒有 進行酶切的蛋白樣品；泳道2和泳道3是經(jīng)過酶切后的樣品；泳道4是蛋白標準參照，從 上往下條帶分別為100、80、70、60、50、40、30、25、20、15、IOkDa ；泳道5至泳道 9是Ni-NTA層析的穿透；泳道10至泳道15是Ni-NTA層析的洗脫。結(jié)果表明，獲得了 生物素化的Avi-AMLl蛋白(圖6中箭頭所示蛋白為切除了 TrxHisSUMO后的Avi-AMLl 蛋白)；10.將Ni-NTA親和層析的穿透液進行MonoQ離子交換層析，進行進一步純化， 采用連續(xù)梯度洗脫方式，平衡液50mM Tris(pH8.0)，5OmM NaCl，2.5% Glycerol,洗 脫液50mMTris(pH8.0)，300mMNaCl, 2.5% Glycerol,按峰收集。11.將MonoQ離子交 換層析收集樣品，SDS-PAGE檢測，如圖7所示結(jié)果，泳道1是生物素化的Avi-AMLl蛋白，泳道2是蛋白標準參照，從上往下條帶分別為100、 80、70、60、50、40、30、25、20、15、IOkDa0 隨后把蛋白透析至 Storage Buffer 20mM Tris 50% Glycerol PH8.0。結(jié)果分析表明1、采用TrxHisSumoAvi這樣的“聯(lián)合標簽”能夠有效與目的蛋白ANMLl進行
融合表達；2、采用Stepavtidin-HRP抗體進行Western Blot檢測顯示，融合蛋白在表達時，
細菌體內(nèi)所含的生物素連接酶可有效的把生物素鏈接到AviTag上；3、本實施例只需經(jīng)兩步純化首先進行Ni-NTA親和層析，隨后進行離子交換 層析，即可獲得純度在95%以上生物素化蛋白，操作簡便、效率高。
權(quán)利要求
1.一種生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種具有多功能的聯(lián)合標簽的蛋白表達載體，所述聯(lián)合標簽至少包括便于 重組蛋白純化的標簽，含有特異蛋白酶切位點的標簽，以及生物素化標簽；(b)把目的蛋白的編碼序列克隆到步驟(a)所述的蛋白表達載體中，所述聯(lián)合標簽與 目的蛋白進行融合表達，獲得在體內(nèi)或體外對融合蛋白中的生物素化標簽進行生物素化 的重組蛋白；以及(c)采用與聯(lián)合標簽相適應(yīng)的特異性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重組蛋白純化的標 簽，并切斷聯(lián)合標簽中的特異蛋白酶切位點，獲得高純度的生物素化蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于所述便于重 組蛋白純化的標簽至少包括六組氨酸標簽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標簽、麥芽糖結(jié)合蛋白標 簽、硫氧還蛋白標簽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于所述含有特異 蛋白酶切位點的標簽至少包括小泛素相關(guān)修飾物、煙草蝕紋病毒蛋白酶識別序列、腸 激酶識別序列、凝血酶識別序列、Xa因子識別序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的生物素 化標簽至少包括AviTag及其衍生物、大腸桿菌生物素酰基載體蛋白及其衍生物、酵母 受體肽及其衍生物。
5.—種蛋白表達載體，含有具有多功能的聯(lián)合標簽，以及可調(diào)控的啟動子、復制起 始子、抗性篩選標記元件，所述聯(lián)合標簽至少包括便于重組蛋白純化的標簽，含有特 異蛋白酶切位點的標簽，以及生物素化標簽。
6.—種試劑盒，包括如權(quán)利要求5所述的蛋白表達載體、特異性的蛋白酶、能將 生物素化標簽進行生物素化的細胞或酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述特異性的蛋白酶至少包括小 泛素相關(guān)修飾物蛋白酶、煙草蝕紋病毒蛋白酶、腸激酶、凝血酶、xa因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述能將生物素化標簽進行生物素 化的細胞至少包括表達細菌生物素連接酶的細胞、表達細菌生物素合成酶的細胞、表 達酵母生物素連接酶的細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述把生物素化標簽進行生物素化 的酶至少包括細菌生物素連接酶、細菌生物素合成酶、酵母生物連接酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物素化蛋白質(zhì)的制備方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種具有多功能的聯(lián)合標簽的蛋白表達載體，所述聯(lián)合標簽至少包括便于重組蛋白純化的標簽，含有特異蛋白酶切位點的標簽，以及生物素化標簽；(b)把目的蛋白的編碼序列克隆到步驟(a)所述的蛋白表達載體中，所述聯(lián)合標簽與目的蛋白進行融合表達，獲得在體內(nèi)或體外對融合蛋白中的生物素化標簽進行生物素化的重組蛋白；以及(c)采用與聯(lián)合標簽相適應(yīng)的特異性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重組蛋白純化的標簽，并切斷聯(lián)合標簽中的特異蛋白酶切位點，獲得高純度的生物素化蛋白質(zhì)。本發(fā)明具有過程集成、工藝簡單、生物素化效率高、蛋白結(jié)構(gòu)和活性不受生物素化影響等優(yōu)點。
文檔編號C12P21/06GK102010875SQ200910192139
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者壽建斐, 李華平, 楊淑偉, 林丹, 黃冰 申請人:廣州復能基因有限公司