專利名稱：一種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備轉(zhuǎn)基因豬的新技術(shù)。
背景技術(shù)：
精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法是目前獲得轉(zhuǎn)基因豬簡(jiǎn)單而高效的方法之一。該方 法在小鼠、豬等動(dòng)物上有過(guò)成功的報(bào)道，但隨后的研究中，由于轉(zhuǎn)基因的效 率低而一度引起爭(zhēng)議，且不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的結(jié)果差異很大，存在外源基因 整合效率差的問(wèn)題。
慢病毒被認(rèn)為是制備轉(zhuǎn)基因豬的新型優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移載體。慢病毒即能感染 分裂細(xì)胞又能感染非分裂細(xì)胞，可從生殖細(xì)胞到囊胚期各發(fā)育階段轉(zhuǎn)移外源 基因。目前利用慢病毒載體感染動(dòng)物胚胎、受精卵以及精原干細(xì)胞成功了生 產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠、羊、牛、豬、雞、魚(yú)等動(dòng)物。
大量研究證實(shí)精子和慢病毒是基因轉(zhuǎn)移的理想載體，但是有關(guān)慢病毒和精 子共孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法。 一種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，包括如下步驟慢病毒載體
與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；然后經(jīng)人工授精雌性動(dòng)物，在子代
動(dòng)物篩選轉(zhuǎn)基因豬。一種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，包括如下步驟慢病毒載體 與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；經(jīng)體外受精，體外培養(yǎng)后胚胎移植， 獲得轉(zhuǎn)基因豬。
在上述慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法中，所述慢病毒與精子共孵 育的方法為動(dòng)物精液稀釋液洗去精清，取洗去精清的精子于人工授精瓶中，
加入慢病毒液，蓋緊放于17。C保溫箱120min，其間每15min輕輕翻動(dòng)精液瓶， 防止精子沉淀聚集，送配種前10min檢驗(yàn)活力，其活力達(dá)到0.5以上可進(jìn)行人 工受精。
在上述慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法中，所述人工授精的方法 為選健康雌性動(dòng)物，于發(fā)情當(dāng)天肌注人類絨毛性腺激素，肌注后進(jìn)行人工輸 精。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明采用慢病毒與精子共孵育的技術(shù)，通過(guò)精子吸附慢病毒后再人工授 精或體外受精，將慢病毒導(dǎo)入受精卵中，并將外源基因整合到胚胎基因組中，
從而制備轉(zhuǎn)基因豬。從而克服了精子吸附裸DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因豬整合率非常低、 遺傳不穩(wěn)定等問(wèn)題。該方法的突出特點(diǎn)是結(jié)合了慢病毒與精子載體的各自優(yōu) 點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、成本較低。利用慢病毒載體與精子孵育，是一種低成本、操作 簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)基因效率較高的轉(zhuǎn)基因方法。


圖1為轉(zhuǎn)基因仔豬eGFP熒光觀察圖。圖2為人工授精PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因仔豬電泳圖。 l-8為仔豬樣品；除3號(hào)外，其它均能檢測(cè)到基因的存在。
圖3為人工授精PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因仔豬的Southern blot結(jié)果圖。Control為 已知陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)為陽(yáng)性仔豬雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1慢病毒載體包裝
用293T包裝細(xì)胞制備慢病毒載體。在質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞前24h， 消化傳代293T細(xì)胞，接種6xl06個(gè)細(xì)胞。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前2 3h，更換細(xì)胞培養(yǎng)基， 添加新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)質(zhì)粒DNA的濃度以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量計(jì)算出每種質(zhì)粒 的需要量(包裝質(zhì)粒6125/ig、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒6125/ig和外膜質(zhì)粒2150/ig)。培養(yǎng) 8h后，更換新鮮培養(yǎng)基。分別在轉(zhuǎn)染后的第l、第2和第3天采取完全更換 新鮮培養(yǎng)液和不更換培養(yǎng)液兩種方式收集制備病毒載體,并測(cè)定載體滴度。收 獲不同批次制備的病毒載體，采用大量制備試劑盒過(guò)濾后，高速梯度離心收集， 于-8(TC保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因豬的制備
1、豬精子與慢病毒載體的共孵育
豬精液稀釋液(Swine Fertilization Medium, SFM)的配制11.25g無(wú)水 葡萄糖10g二水檸檬酸三鈉4.7g二水乙二胺四乙酸二鈉3.25g—水檸檬 酸6.5g三羥甲基氨基甲烷加雙蒸水定容1升，最后加入6g牛血清白蛋白 (BSA)，現(xiàn)配現(xiàn)用。
(1)確定與配公豬，檢驗(yàn)精液品質(zhì)，最近三次記錄合格目活力達(dá)到0.7以上。選擇試驗(yàn)當(dāng)天所采長(zhǎng)白豬精液中精子活力最高的那份精液，收集精液中
濃稠的部分5mL到15mL離心管中，加入當(dāng)天配制好并預(yù)熱的SFM/BSA液 5mL (注意兩者之間溫差一定要小于1°C)。室溫放置5min。
(2) 將上述精液轉(zhuǎn)移至裝有40ml SFM/BSA的50ml離心管中，25°C， 800g離心10min小心吸去上清，加40ml SFM/BSA (25°C )精子稀釋液于17°C ■g離心10min小心吸去上清，加入3-4ml SFM/BSA (17°C)輕輕吹打，使 精子重懸。
(3) 檢測(cè)精子活力，并計(jì)數(shù)，如精子活力達(dá)到0.65以上，即可取109 個(gè)精子于40ml SFM/BSA (17°C)的人工授精瓶中，加入50ug DNA ，吸去 泡沫，蓋緊放于17"C保溫箱lOOmin，其間每15min輕輕翻動(dòng)精液瓶，防止精 子沉淀聚集，送配種前l(fā)Omin檢驗(yàn)活力，其活力達(dá)到0.5以上可進(jìn)行人工受 精。
2、轉(zhuǎn)基因豬的制備
(1) 人工授精于發(fā)情當(dāng)天肌注人類絨毛性腺激素(HCG)。肌注HCG24 h后，進(jìn)行人工輸精，每側(cè)lmL(約含精子5x107個(gè)/mL)。分娩后，用PCR、 Southern blot鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性仔豬。PCR結(jié)果見(jiàn)圖2， Southern blot結(jié)果見(jiàn)圖3 。 PCR法是一種快速簡(jiǎn)潔的鑒定方法，由于存在一定的假陽(yáng)性，用于初步陽(yáng)性 仔豬的檢測(cè)。Southern blot是一種經(jīng)典的陽(yáng)性鑒定方法，準(zhǔn)確率高，用于進(jìn)一 步的陽(yáng)性檢測(cè)，兩者結(jié)果結(jié)合說(shuō)明轉(zhuǎn)基因獲得了成功。
(2) 體外受精:將體外培養(yǎng)42—44h的卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs) 取出，脫卵丘細(xì)胞之后，用TRIS緩沖培養(yǎng)液(mTBM)洗滌3遍；每個(gè) 50AtLmTBM液滴中放置25個(gè)成熟的卵母細(xì)胞；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30—45min之后，每個(gè)液滴中添加此前處理好的精液，同時(shí)添加高滴度的慢病毒載體;
將精子、卵母細(xì)胞和高滴度慢病毒載體混合液在培養(yǎng)箱中，39°C， 5%(^02的 空氣，飽和濕度培養(yǎng)7h;將可能的受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌3遍后，按照20-25 個(gè)胚/50/zL， 39°C， 5XC02的空氣，飽和濕度培養(yǎng)；分別在2d和7d計(jì)算卵裂 率和囊胚率以及陽(yáng)性胚胎率。采用輸卵管移植，分娩后，用直接觀察熒光、PCR、 Southern blot鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性仔豬。熒光結(jié)果見(jiàn)圖1 ， PCR結(jié)果見(jiàn)圖2， Southern blot的結(jié)果見(jiàn)圖3。
權(quán)利要求
1.一種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于包括如下步驟慢病毒載體與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；然后經(jīng)人工授精雌性動(dòng)物，在子代豬中篩選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
2. —種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于包括如下步 驟慢病毒載體與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；經(jīng)體外受精，體外 培養(yǎng)后胚胎移植，獲得轉(zhuǎn)基因豬。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于所述慢病毒 與精子共孵育的方法為動(dòng)物精液稀釋液洗去精清，取洗去精清的精子于人工 授精瓶中，加入慢病毒原液，蓋緊放于17。C保溫箱120min，其間每15min輕 輕翻動(dòng)精液瓶，防止精子沉淀聚集，送配種前10min檢驗(yàn)活力，其活力達(dá)到 0.5以上可進(jìn)行人工受精。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于所述人工授精的 方法為選健康雌性豬，于發(fā)情當(dāng)天肌注人類絨毛性腺激素，肌注后進(jìn)行人工 輸精。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種慢病毒與精子孵育制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，包括如下步驟慢病毒載體與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；然后經(jīng)人工授精雌性動(dòng)物，在子代動(dòng)物篩選轉(zhuǎn)基因豬。本發(fā)明采用慢病毒與精子共孵育的技術(shù)，通過(guò)精子吸附慢病毒后再人工授精或體外受精，將慢病毒導(dǎo)入受精卵中，并將外源基因整合到胚胎基因組中，從而制備轉(zhuǎn)基因豬。從而克服了精子吸附裸DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因豬整合率非常低、遺傳不穩(wěn)定等問(wèn)題。該方法的突出特點(diǎn)是結(jié)合了慢病毒與精子載體的各自優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、成本較低。利用慢病毒載體與精子孵育，是一種低成本、操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)基因效率較高的轉(zhuǎn)基因方法。
文檔編號(hào)C12N15/867GK101654687SQ20091019214
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者丁景華, 習(xí)欠云, 吳珍芳, 張守全, 張永亮, 江青艷, 蔡偉光 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)