專利名稱：：一種對香蕉鐮刀菌枯萎病的抗病性進行快速鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對香蕉鐮刀菌枯萎病(Fusariumwilt)的抗病性進行快速鑒定的方法，尤其是在離體培養(yǎng)的條件下，通過改良培養(yǎng)基配方并且在生根培養(yǎng)階段接種病原菌，快速而有效地篩選香蕉抗病種質(zhì)資源和育種材料，提高香蕉抗枯萎病育種的效率。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)一植物保護
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：香蕉鐮刀菌枯蔞病(又稱巴拿馬病、黃葉病)是近年來威脅我國乃至全世界香蕉生產(chǎn)的主要病害之一。該病普遍被認為是有史以來最嚴重的毀滅性植物病害之一，它是由土壤真菌fkswf,考，ra附f.sp.cw6erae(E.F.Smith)Snyd.&HansCFoc)弓l起的。目前已確認了的4個生理小種，其中4號生理小種(race4)的毀滅性最大?，F(xiàn)有的一些防治措施，例如化學防治、淹水休耕、輪作和使用有機物改良土壤等均不能有效地控制鐮刀菌枯萎病。近年來，國內(nèi)外關(guān)于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中在拮抗菌的篩選及其室內(nèi)盆栽防治試驗(Perez-vicente等，2003;Saravanan等，2003;Thangavelu等,2003;程亮等，2005;游春平等，2005;黃小光等，2006)，但真正可以應(yīng)用到生產(chǎn)實際的并不多。目前普遍認為選育抗病品種是控制該病最有效的方法之一。而建立簡便有效的抗性鑒定體系是進行香蕉枯萎病抗病育種的關(guān)鍵。由于香蕉鐮刀菌枯萎病是一種土傳病害，傳統(tǒng)的ffl間鑒定法耍求有大面積發(fā)病較為均勻的地塊，不僅費時費工，鑒定結(jié)果也容易受到環(huán)境條件的影響。目前普遍采用的苗期人工接種鑒定法主要分為2類盆栽系統(tǒng)(Matsumotoetal.,1995;林時遲等，2000;李敏惠等，2007;Weberetal.,2007;莫賤友等，2008;Smithetal.,2008)和水培系統(tǒng)(DeAscensaoandDubery,2000;Groenewaldetal.,2006;VandenBergetal.,2007)。接種方法通常采用傷根浸(淋)菌液、土壤或培養(yǎng)液接種菌液、用預(yù)先接種Foe的麥?；蚋吡涣Ｗ鳛榻臃N物等。至今尚未見報道有較大改進的其他抗性鑒定方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對香蕉抗病育種的特點和現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的香蕉鐮刀菌枯萎病抗性鑒定體系。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的-在香蕉離體快速繁殖的生根培養(yǎng)階段，將巳經(jīng)在生根培養(yǎng)基生長2-3周的試管苗轉(zhuǎn)移至改良培養(yǎng)基(modifiedmediumforinteractionsystem,MIS)進行預(yù)培養(yǎng)，每個培養(yǎng)容器接種1株試管苗。MIS的組成包括NH4N03825mg/l、KN03950mg/l、MgS04'7H20185mg/l、KH2P0485mgA、CaCl22H20220mg/l、KI0.83mg/l、H3B036.2mg/l、MnS04-4H2022.3mg/l、ZnS04.7H208.60mg/l、Na2Mo04.2H200.25mg/l、CuS04.5H200.025mg/l、CoCl2-6H200.025mg/l、Na-EDTA37.26mg/l、FeS04'7H2027.80mg/1和6g/l瓊脂。香蕉生根試管苗在MIS培養(yǎng)基生長1-2周后，選取株高4.5-5cm、植株上部展開葉片數(shù)^2、生根數(shù)3的小植株接種^Pbc。接種時，在超凈工作臺上打開培養(yǎng)容器的蓋子，用鑷子將預(yù)先浸泡在Foc孢子懸浮液(106個孢子/ml)中的無菌濾紙片(直徑5mm)放置在MIS培養(yǎng)基表面距離小植株約1cm處。最后重新蓋好培養(yǎng)容器的蓋子，并將其放置在溫度為25i2'C的組培室中觀察發(fā)病情況。接種尸oc后24d，按照0-6級的病害評價等級對單株生根試管苗進行病害等級鑒定。其中0=小植株生長正常，無任何發(fā)病癥狀；1=假莖基部的小葉片枯萎，但假莖本身的顏色并未發(fā)生變化；2=假莖顏色變暗的區(qū)域小于或等于整個假莖高度的1/2;3=假莖顏色變暗的區(qū)域超過整個假莖高度的1/2;4=變黃或枯萎的上部葉片數(shù)小于或等于小植株上部總?cè)~片數(shù)的1/2;5=變黃或枯萎的上部葉片數(shù)超過小植株上部總?cè)~片數(shù)的1/2;6=整株試管苗枯萎死亡。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)現(xiàn)有的香蕉栽培品種絕大多數(shù)是3倍體，3倍體之間無論自花或異花授粉均得不到種子；3倍體(母本)與2倍體(父本)雜交也只限于某些品種，且只有少量種子。因此，目前香蕉枯萎病抗病育種的重點研究領(lǐng)域是離體選擇(Matsumoto等，1995,1999;Bhagwat和Duncan,1998^1998b;Smkh等，1993，2006;劉海瑞等，2007;胡玉林等，2008)、遺傳轉(zhuǎn)化(Remy等，1998;裴新梧等，2005a,2005b)和原生質(zhì)體融合等(Matsumoto等,2002)。上述研究均是以香蕉的細胞、組織培養(yǎng)作為基礎(chǔ)；而大部分盆栽系統(tǒng)和水培系統(tǒng)所需的植物材料是株高15cm左右的假植苗；鑒于此，本發(fā)明提供的鑒定方法能與目前的香蕉抗病育種研究更緊密地銜接起來。(2)無論盆栽系統(tǒng)還是水培系統(tǒng)，抗病性鑒定一般是在溫室大棚中進行的；而本發(fā)明的鑒定體系是在組培室中觀察發(fā)病情況。已有的觀察和研究表明，病原菌Foc的活動受到溫度等環(huán)境因素的影響(劉紹欽等，2001)。由于培養(yǎng)室的環(huán)境條件較溫室大棚穩(wěn)定得多，加之本發(fā)明的鑒定體系本身是一個完全封閉的系統(tǒng)，使得鑒定結(jié)果的重復(fù)性和可靠性得到保證。(3)盆栽系統(tǒng)和水培系統(tǒng)分別要在接種Foc后7-8周和6周才能進行病害鑒定，而本發(fā)明提供的鑒定方法只需3-4周。具體實施例方式以巴西、GCTCV-119、Formosana、農(nóng)科1號、廣粉1號和東莞大焦等6個品種為實驗材料。將上述品種由吸芽莖尖外植體產(chǎn)生的不定芽接種至生根培養(yǎng)基1/2MS+1.0mg/1NAA+0.2mg/1IBA+30g/1蔗糖+2g/1活性炭+6g/1瓊脂。生根培養(yǎng)2-3周后，將葉片開始展開的生根試管苗轉(zhuǎn)移至MIS進行預(yù)培養(yǎng)，以150ml三角瓶作為培養(yǎng)容器，每瓶接種1株試管苗。上述品種的生根試管苗在MIS培養(yǎng)基生長l-2周后，選取株高4.5-5cm、植株上部展開葉片數(shù)22、生根數(shù)^3的小植株接種Foc。接種時，在超凈工作臺上打開三角瓶的封口膜，用鑷子將預(yù)先浸泡在Foerace4的孢子懸浮液(106個孢子/ml)中的無菌濾紙片(直徑5mm)放置在MIS培養(yǎng)基表面距離小植株約1cm處。最后重新蓋上封口膜，并將其放置在溫度為25±2°C的組培室中觀察發(fā)病情況。每個品種5個處理，每個處理重復(fù)3次。接種Foe后24d，按照0-6級的病害評價等級對單株生根試管苗進行病害等級鑒定。其中0級一小植株生長正常，無任何發(fā)病癥狀；1級一假莖基部的小葉片枯萎，但假莖本身的顏色并未發(fā)生變化；2級一假莖顏色變暗的區(qū)域小于或等于整個假莖高度的1/2;3級一假莖顏色變暗的區(qū)域超過整個假莖高度的1/2;4級一變黃或枯萎的上部葉片數(shù)小于或等于小植株上部總?cè)~片數(shù)的1/2;5級一變黃或枯萎的上部葉片數(shù)超過小植株上部總?cè)~片數(shù)的1/2;6級一整株試管苗枯蔞死亡。鑒定結(jié)果下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中同列數(shù)值后不同字母表示差異達到顯著水平/^0.05。由上表可知，供試6個品種的平均病害等級與田間病害評價的結(jié)果一致，證明應(yīng)用本發(fā)明提供的鑒定方法能夠快速、準確地區(qū)分香蕉鐮刀菌枯萎病的感病品種和抗病品種。權(quán)利要求1、一種對香蕉鐮刀菌枯萎病的抗病性進行快速鑒定的方法，其特征在于1)在香蕉離體快速繁殖的生根培養(yǎng)階段，將已經(jīng)在生根培養(yǎng)基生長2-3周的試管苗轉(zhuǎn)移至改良培養(yǎng)基MIS進行預(yù)培養(yǎng)，每個培養(yǎng)容器接種1株試管苗；2)MIS的組成包括NH4NO3825mg/l、KNO3950mg/l、MgSO4·7H2O185mg/l、KH2PO485mg/l、CaCl2·2H2O220mg/l、KI0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4·4H2O22.3mg/l、ZnSO4·7H2O8.60mg/l、Na2MoO4·2H2O0.25mg/l、CuSO4·5H2O0.025mg/l、CoCl2·6H2O0.025mg/l、Na·EDTA37.26mg/l、FeSO4·7H2O27.80mg/l和6g/l瓊脂；3)香蕉生根試管苗在MIS預(yù)培養(yǎng)1-2周后，選取株高4.5-5cm、植株上部展開葉片數(shù)≥2、生根數(shù)≥3的小植株接種病原菌Foc；4)接種時，在超凈工作臺上打開培養(yǎng)容器的蓋子，用鑷子將預(yù)先浸泡在Foc孢子懸浮液(106個孢子/ml)中的無菌濾紙片(直徑5mm)放置在MIS培養(yǎng)基表面距離小植株約1cm處。最后重新蓋好培養(yǎng)容器的蓋子，并將其放置在溫度為25±2℃的組培室中觀察發(fā)病情況；5)接種Foc后24d，按照0-6級的病害評價等級對單株生根試管苗進行病害等級鑒定。其中0級-小植株生長正常，無任何發(fā)病癥狀；1級-假莖基部的小葉片枯萎，但假莖本身的顏色并未發(fā)生變化；2級-假莖顏色變暗的區(qū)域小于或等于整個假莖高度的1/2；3級-假莖顏色變暗的區(qū)域超過整個假莖高度的1/2；4級-變黃或枯萎的上部葉片數(shù)小于或等于小植株上部總?cè)~片數(shù)的1/2；5級-變黃或枯萎的上部葉片數(shù)超過小植株上部總?cè)~片數(shù)的1/2；6級-整株試管苗枯萎死亡。全文摘要本發(fā)明涉及對香蕉鐮刀菌枯萎病(Fusariumwilt)的抗病性進行快速鑒定的方法，屬于農(nóng)業(yè)—植物保護
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明是在香蕉離體快速繁殖的生根培養(yǎng)階段，將已經(jīng)在生根培養(yǎng)基生長2-3周的試管苗轉(zhuǎn)移至改良培養(yǎng)基MIS預(yù)培養(yǎng)1-2周后，選取株高4.5-5cm、植株上部展開葉片數(shù)≥2、生根數(shù)≥3的小植株在超凈工作臺上接種病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubense(Foc)，接種后將培養(yǎng)容器放置在溫度為25±2℃的組培室中觀察發(fā)病情況。接種Foc后24d，按照0-6級的病害評價等級對單株生根試管苗進行病害等級鑒定。和目前普遍采用的盆栽系統(tǒng)和水培系統(tǒng)相比，本發(fā)明提供的鑒定方法不僅能與目前的香蕉抗病育種研究更緊密地銜接起來，而且還具有準確、快速的特點。文檔編號C12Q1/18GK101643772SQ20091019217公開日2010年2月10日申請日期2009年9月9日優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日發(fā)明者吳元立,彭新湘,易干軍申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所