專利名稱：：桃膠分解酶生產(chǎn)菌株及其在制備桃膠多糖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及桃膠多糖的制備領(lǐng)域，具體涉及一種桃膠分解酶生產(chǎn)菌株及其在制備桃膠多糖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：阿拉伯膠替代品的研究開發(fā)和生產(chǎn)是非常迫切而必要的，代替阿拉伯膠的新產(chǎn)品可以對穩(wěn)定市場供應(yīng)進(jìn)行有效控制。桃膠是替代阿拉伯樹膠的唯一天然植物膠粘劑。桃、李、杏、櫻桃等樹干分泌的膠稱為桃膠。桃膠是半透明的多糖物質(zhì)，用途廣泛，可被用于食品、醫(yī)藥、化妝、印刷、纖維等輕、化工領(lǐng)域，如紡織工業(yè)用作酸性印花漿料，花筒雕刻工藝用作保護(hù)膠劑，印刷工業(yè)用作金粉膠粘劑等。桃膠在我國的工業(yè)化生產(chǎn)還剛起步，國內(nèi)有些生產(chǎn)桃膠的廠家，但大部分都屬于酸堿法制造粗制桃膠，該方法是將原桃膠用水浸脹后，通過酸、堿和高溫的方法水解成水溶性桃膠，桃膠多糖高溫化學(xué)水解過程發(fā)生褐變反應(yīng)會導(dǎo)致產(chǎn)品色澤變暗，在后續(xù)工序還要進(jìn)行漂白脫色，在水解工序，浸提酸度大，加熱時間過長都會導(dǎo)致膠質(zhì)徹底水解成單糖，降低提取率，浸提堿性太強(qiáng)，會對生產(chǎn)設(shè)備造成影響，另外，采用酸堿水解法生產(chǎn)工藝還會產(chǎn)生大量酸堿廢水，造成一定的環(huán)保負(fù)擔(dān)。在國內(nèi)外，桃膠多糖產(chǎn)品已作為商品出售，占有可觀的市場份額并展現(xiàn)很大的市場潛力，目前市場對桃膠的需求越來越大，對產(chǎn)品質(zhì)量要求也很高。但對桃膠產(chǎn)品性質(zhì)及生產(chǎn)研究報道并不多。利用酶法生產(chǎn)桃膠多糖，是可以獲得高質(zhì)量、相對分子量范圍較窄桃膠產(chǎn)品的一種有效生產(chǎn)技術(shù)。酶法生產(chǎn)是以酶為催化劑，具有高效、安全、生態(tài)和環(huán)保等特點，能夠有效帶動相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)水平的提高，對應(yīng)用產(chǎn)業(yè)開發(fā)新產(chǎn)品、提高質(zhì)量、節(jié)能降耗、保護(hù)環(huán)境具有重要意義。找到一種高效低成本的桃膠生產(chǎn)用酶是制約桃膠生產(chǎn)的瓶頸。但目前尚未見到利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)桃膠分解用酶，從而進(jìn)行桃膠多糖生產(chǎn)的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可生產(chǎn)桃膠分解復(fù)合酶的菌株，且該桃膠分解復(fù)合酶對桃膠具有較強(qiáng)的分解能力。本發(fā)明的另一個目的是提供上述菌株生產(chǎn)的桃膠分解酶，用于桃膠多糖中的制備。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的本發(fā)明人分離篩選到一株新的對大分子原桃膠具有分解能力的菌株，該菌株屬于微桿菌，名稱為微桿菌A5(英文名為Microbacteriumsp.A5)，已于2009年8月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCN0:M209174?！⒕甑姆蛛x本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)卡拉膠由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3，6-脫水半乳糖通過a-l，3糖苷鍵和P-l，4鍵交替連接而成，在1，3連接的D半乳糖單位C4上帶有l(wèi)個硫酸基，很難被微生物分解；桃膠主要含有半乳糖，阿拉伯糖，木糖，糖醛酸，分子結(jié)構(gòu)未知，半乳糖與糖醛酸含量與卡拉膠接近，因此本發(fā)明人篩選能分解卡拉膠的菌株，將該菌株用于降解桃膠。1.能分解卡拉膠菌株的篩選卡拉膠作為一種海產(chǎn)多糖，很少為陸地微生物所降解。但是在生產(chǎn)卡拉膠的工廠之中，發(fā)明人取得了卡拉膠自然變質(zhì)的樣品，白色粉末狀的卡拉膠變質(zhì)成為棕色的膠泥樣固體。以該變質(zhì)的卡拉膠作為原料，先篩選降解卡拉膠的菌株，其步驟如下(1)采用稀釋涂平板法對變質(zhì)卡拉膠進(jìn)行微生物分離，樣品稀釋度為10—2、10—3、10—4和10—5，分別涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板和麥芽汁培養(yǎng)基平板上，每個濃度3個平板，好氧與厭氧培養(yǎng)后進(jìn)行菌落分離；(2)將分離到的12個疑似菌種接入甲基紅卡拉膠培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成甲基紅0.lg、卡拉膠40g、營養(yǎng)肉湯10g，蒸餾水定容至1L)中培養(yǎng)，若該菌株可以分解卡拉膠使硫酸解離，則接種該菌種的培養(yǎng)基變紅；接著本發(fā)明人依次采用菌株對卡拉膠分解試驗、菌株對原桃膠分解試驗，篩選出對桃膠具有分解能力的菌株，其步驟如下2.菌株對卡拉膠分解實驗選取上述步驟(2)中，紅色最明顯的菌擴(kuò)增(細(xì)菌使用營養(yǎng)肉湯，真菌使用液體真菌培養(yǎng)基)，將所得培養(yǎng)液50ml接入200ml不同濃度的純卡拉膠培養(yǎng)基中，另接入無菌水作對照組，測量其粘度作為對比；若卡拉膠分解則粘度有明顯降低；3.篩選菌株對原桃膠分解實驗選取上述試驗中對卡拉膠降解能力最強(qiáng)的細(xì)菌菌株，接入營養(yǎng)肉湯擴(kuò)增，將所得培養(yǎng)液50ml接入200ml不同濃度的桃膠培養(yǎng)基中，另接入無菌水作對照組，測量其還原糖含量作為對比；如桃膠分解還原糖含量有明顯升高；最后，對篩選到的對桃膠具有分解能力的菌株，進(jìn)行產(chǎn)酶馴化試驗，從而最終獲得具有高效降解桃膠活性的菌株，其步驟如下4.菌種產(chǎn)酶馴化實驗將上述試驗中獲得的對桃膠降解能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶馴化；第1次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150ml、2X桃膠(質(zhì)量百分比)、種子液化20mL、放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的蕩箱中振蕩培養(yǎng)七天；第2次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150mL、4%(質(zhì)量百分比)桃膠、第一次訓(xùn)化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在30°C、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養(yǎng)七天；第3次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150mL、6%(質(zhì)量百分比)桃膠、第二次馴化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養(yǎng)至殘?zhí)墙禐?%;第4次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150mL、第3次馴化過的菌液20ml、8X(質(zhì)量百分比)桃膠放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養(yǎng)至殘?zhí)墙禐?%;經(jīng)過四次馴化，最終獲得對桃膠分解力較強(qiáng)的菌株。二、菌種鑒定對上述篩選獲得的桃膠分解力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定。1.分子生物學(xué)鑒定對上述篩選所得對桃膠分解力較強(qiáng)的菌株，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)16SrDNA測序分子鑒定、細(xì)菌形態(tài)觀察和生理生化實驗，結(jié)果顯示該菌株與微桿菌屬(Microbacterium)同源性達(dá)99%以上，其形態(tài)特征及生理生化特征與微桿菌屬(Microbacterium)最相符合。2.本發(fā)明人從國內(nèi)微生物菌種保藏中心購買了其它四株微桿菌菌株與本發(fā)明篩選的菌株共同用于桃膠分解實驗，本發(fā)明的菌株具有很強(qiáng)的桃膠分解能力，而其它四種菌株不具有桃膠分解能力。此外，國內(nèi)外也未見有微桿菌菌株具有桃膠分解能力的相關(guān)報道。綜上所述，本發(fā)明篩選獲得了微桿菌屬的一種新菌株，名稱為微桿菌A5(英文名為Microbacteriumsp.A5)，該菌株可高產(chǎn)桃膠分解酶。三、菌種的培養(yǎng)條件本發(fā)明人經(jīng)過試驗研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的微桿菌A5其培養(yǎng)條件如下斜面培養(yǎng)采用含8%桃膠(質(zhì)量百分比)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，3(TC，培養(yǎng)36小時。液體培養(yǎng)采用含8%桃膠(質(zhì)量百分比)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在3(TC、180r/min振蕩培養(yǎng)24小時。本發(fā)明在菌種篩選以及菌種培養(yǎng)中所需要的培養(yǎng)基，如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯和麥芽汁培養(yǎng)基，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可實現(xiàn)本發(fā)明。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明通過分離篩選獲得一株新菌株，該菌株可高效生產(chǎn)桃膠分解酶，將該分解酶用于桃膠降解，即可得到富有經(jīng)濟(jì)價值的桃膠多糖；2.本發(fā)明采用酶法生產(chǎn)桃膠，其水解周期短，產(chǎn)品的相對分子質(zhì)量分布較窄，無環(huán)境污染，容易控制；3.本發(fā)明提供一種新的、更環(huán)保、產(chǎn)品質(zhì)量統(tǒng)一的生物法樹膠生產(chǎn)工藝，利于社會的可持續(xù)性發(fā)展，同時也將促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)栽培的廢棄物深加工綜合利用開發(fā)，具備很廣闊的市場前景。圖1為桃膠分解酶SDS-PAGE電泳圖；其中，1為蛋白Marker,2為桃膠分解酶粗酶制劑，3為稀釋后的桃膠分解酶粗酶制劑。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1菌株的篩選獲得本實施例以變質(zhì)的卡拉膠作為原料，先篩選得到能降解卡拉膠的菌株，然后通過卡拉膠降解能力以及原桃膠降解能力，兩個篩選條件，挑選出對原桃膠具有降解能力的菌株，接著再結(jié)合菌種產(chǎn)酶馴化，從而最終獲得可高效降解桃膠的菌株，其具體步驟如下1.能分解卡拉膠菌株的篩選(1)采用稀釋涂平板法對變質(zhì)卡拉膠進(jìn)行微生物分離，樣品稀釋度為10—2、10—3、10—4和10—5，分別涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板和麥芽汁培養(yǎng)基平板上，每個濃度3個平板，好氧與厭氧培養(yǎng)后進(jìn)行菌落分離；(2)將分離到的12個疑似菌種接入甲基紅卡拉膠培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成甲基紅0.lg，卡拉膠40g，營養(yǎng)肉湯10g，蒸餾水定容至1L)中培養(yǎng)，若該菌株可以分解卡拉膠使硫酸解離，則接種該菌種的培養(yǎng)基變紅；2.菌株對卡拉膠分解實驗選取上述步驟(2)中，紅色最明顯的菌擴(kuò)增(細(xì)菌使用營養(yǎng)肉湯，真菌使用液體真菌培養(yǎng)基)，將所得培養(yǎng)液50ml接入200ml不同濃度的純卡拉膠培養(yǎng)基中，另接入無菌水作對照組，測量其粘度作為對比；若卡拉膠分解則粘度有明顯降低；3.篩選菌株對原桃膠分解實驗選取上述試驗中對卡拉膠降解能力最強(qiáng)的細(xì)菌菌株，接入營養(yǎng)肉湯擴(kuò)增，將所得培養(yǎng)液50ml接入200ml不同濃度的桃膠培養(yǎng)基中，另接入無菌水作對照組，測量其還原糖含量作為對比；如桃膠分解還原糖含量有明顯升高；4.菌種產(chǎn)酶馴化實驗將上述試驗中獲得的對桃膠降解能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶馴化；第1次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150ml、2X桃膠(質(zhì)量百分比)、種子液化20mL、放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的蕩箱中振蕩培養(yǎng)七天；第2次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150mL、4X桃膠(質(zhì)量百分比)、第一次訓(xùn)化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在30°C、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養(yǎng)七天；第3次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150mL、6X桃膠(質(zhì)量百分比)、第二次馴化菌液20mL放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養(yǎng)至殘?zhí)墙禐?%;第4次馴化方法分別取營養(yǎng)肉湯150mL、第3次馴化過的菌液20ml、8X桃膠(質(zhì)量百分比)放入250mL錐形瓶中，在3(TC、振蕩速度180r/min的振蕩箱中振蕩培養(yǎng)至殘?zhí)墙禐?%;經(jīng)過四次馴化，最終獲得對桃膠分解力較強(qiáng)的菌株。實施例2菌株的鑒定分析本實施例對實施例1篩選獲得，對桃膠分解力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定。1.16SrDNA測序?qū)⒃摼晏崛NA，采用核酸/蛋白質(zhì)分析儀于NucleicAcid程序下測定，進(jìn)行DNA純度和濃度檢測，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，空白對照中含有除模板核酸外的所有組份。擴(kuò)增產(chǎn)物送測序公司測序，將得到的堿基序列通過因特網(wǎng)在GenBank等國際核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索(blastsearch)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與微桿菌屬(Microbacterium)同源性達(dá)99%以上，其形態(tài)特征及生理生化特征與微桿菌屬(Microbacterium)最相符合。2.生理生化實驗實施例1篩選獲得的對桃膠分解力較強(qiáng)的菌株，其菌落形態(tài)為黃色菌落，表面光滑不透明，邊緣整齊有光澤；革蘭氏染色結(jié)果陽性，有球桿變形現(xiàn)象，但無明顯桿-球同期，厭氧實驗結(jié)果是好氧生長，厭氧條件下不生長；接觸酶實驗陽性，氧化酶實驗陰性，V-P實驗陰性，明膠液化實驗陽性，硝酸鹽還原實驗陰性，糖醇發(fā)酵實驗葡萄糖、蔗糖和海藻糖陽性，蜜二糖陰性。查閱常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊和伯杰細(xì)菌鑒定手冊知，可知實施例1篩選到的菌株屬于微桿菌屬，桃膠發(fā)酵實驗結(jié)果陽性。目前已知的微桿菌屬的菌種，均沒有能降解桃膠的報道，因此實施例1篩選到的菌株有別于其它微桿菌株，說明本發(fā)明篩選獲得了微桿菌屬的一種新菌株，名稱為微桿菌A5(英文名為Microbacteriumsp.A5)，該菌株可高產(chǎn)桃膠分解酶。實施例3菌株生產(chǎn)桃膠分解酶的性質(zhì)鑒定1.桃膠多糖的測定1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖，先用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中定容，得1.OOmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。準(zhǔn)確取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50ml的1.OOmg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液分別加入到50ml的容量瓶中，各加5ml的DNS在沸水浴中煮5min后流水迅速冷卻，定容搖勻，空白調(diào)零。在540nm的吸收光譜波長下測定光密度值。2)樣品測定分別取各儲備液1ml于50ml容量瓶中，其他步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作相同，測出樣品的光密度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出含量。2.菌種對桃膠降解能力通過測菌體生長過程中含桃膠培養(yǎng)基中還原糖增加的情況，間接反映對菌株產(chǎn)酶分解桃膠解離出還愿糖的能力。用含8%桃膠的培養(yǎng)基按5%接種量接入各液體菌種，301:，180rpm震蕩培養(yǎng)48小時測定發(fā)酵液中還原糖含量，還原糖含量升高表明原桃膠被不同程度降解。對照組本發(fā)明人從國內(nèi)微生物菌種保藏中心購買了四株已保存的微桿菌，作為對照菌?？瞻讓φ找圆唤臃N的含8%桃膠的培養(yǎng)基為空白對照。發(fā)酵液經(jīng)四層紗布過濾，6(TC烘干至衡重稱量未分解桃膠重量，與發(fā)酵前添加量相比，計算桃膠分解率，結(jié)果如表1所示。表1不同菌株降解桃膠釋放還原糖含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1可以看出，作為對照的四株現(xiàn)有微桿菌，對桃膠分解率僅有0.1%，而本發(fā)明的微桿菌A5對桃膠分解率有95%，說明本發(fā)明的微桿菌A5是一種新的微桿菌菌種，而且具有高效降解桃膠的能力。3.發(fā)酵液中粗酶的提取發(fā)酵液經(jīng)濾布過濾后5000rpm離心30分鐘，得澄清的酶液，70%酒精沉淀，沉淀用加醋酸處理脫多糖，獲得粗酶制劑。4.桃膠分解酶系分析將上述粗酶直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，電泳結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，微桿菌A5分泌的降解桃膠酶，是一種復(fù)合酶，由兩種酶組成。實施例4微桿菌A5桃膠分解酶用于制備精致桃膠多糖將原桃膠進(jìn)行清洗，去除樹皮、泥土等雜質(zhì)后，用清水進(jìn)行浸泡，使其充分溶脹，加入實施例3中得到的，微桿菌A5生產(chǎn)的桃膠分解復(fù)合酶粗制劑，3(TC保溫24小時，間歇攪拌使反應(yīng)均勻。將反應(yīng)后的溶液5000rpm離心30min，去上清，通過DEAE-纖維素分子篩收集不同分子量多糖溶液，從而得到純凈的分子量均一的桃膠多糖溶液。采用進(jìn)風(fēng)溫度1S(TC，出風(fēng)溫度9(TC的噴霧干燥制得純凈的精制桃膠粉末。權(quán)利要求一種桃膠分解酶生產(chǎn)菌株，其特征在于該菌株于已于2009年8月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209174。2.權(quán)利要求1所述桃膠分解酶生產(chǎn)菌株的篩選方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)采用稀釋涂平板法對變質(zhì)卡拉膠進(jìn)行微生物分離，篩選出可分解卡拉膠的菌株；(2)將步驟(1)篩選到的菌株，進(jìn)行不同濃度卡拉膠的分解試驗，篩選出卡拉膠分解力最強(qiáng)的菌株；(3)將步驟(2)篩選到的菌株，進(jìn)行原桃膠分解試驗，篩選出桃膠分解力最強(qiáng)的菌株；(4)將步驟(3)篩選到的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶馴化，馴化過程中，桃膠的含量逐漸增加，最后得到對桃膠分解力較強(qiáng)的菌株，該菌株即為本發(fā)明所需的桃膠分解酶生產(chǎn)菌株。3.權(quán)利要求1所述桃膠分解酶生產(chǎn)菌株在制備桃膠多糖中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種桃膠分解酶生產(chǎn)菌株及其在制備桃膠多糖中的應(yīng)用，該桃膠分解酶生產(chǎn)菌株屬于微桿菌，名稱為微桿菌A5，已于2009年8月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209174。本發(fā)明的菌株可高效生產(chǎn)桃膠分解酶，將該分解酶用于原桃膠降解，即可得到富有經(jīng)濟(jì)價值的桃膠多糖。利用本發(fā)明的菌株，可采用酶法生產(chǎn)桃膠，其水解周期短，產(chǎn)品的相對分子質(zhì)量分布較窄，無環(huán)境污染，容易控制。本發(fā)明提供一種新的、更環(huán)保、產(chǎn)品質(zhì)量統(tǒng)一的生物法樹膠生產(chǎn)工藝，利于社會的可持續(xù)性發(fā)展，同時也將促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)栽培的廢棄物深加工綜合利用開發(fā)，具備很廣闊的市場前景。文檔編號C12Q1/04GK101701198SQ200910193340公開日2010年5月5日申請日期2009年10月27日優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日發(fā)明者冉艷紅,戚彩娃,楊曼娜,陸俏穎申請人:暨南大學(xué)