專利名稱：：培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)或生物制藥領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：目前常用于培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，但梅興國(guó)等科學(xué)家通過(guò)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，在B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞時(shí)，容易出現(xiàn)變紅變褐現(xiàn)象，造成培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的含量較低，因此提出采用兩步培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇，首先在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)得到一定生物量的紅豆杉植物細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入生產(chǎn)培養(yǎng)基中進(jìn)行紫杉醇生產(chǎn)得到高含紫杉醇的細(xì)胞培養(yǎng)物，由于B5培養(yǎng)基成分復(fù)雜，還沒(méi)有設(shè)計(jì)或優(yōu)化出一種培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞促進(jìn)紫杉醇合成的專用生產(chǎn)培養(yǎng)基，兩步培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法普遍選擇B5培養(yǎng)基作為生產(chǎn)培養(yǎng)基，仍然沒(méi)有解決培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇時(shí)含量較低的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種既能顯著提高培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)的紫杉醇含量，又能縮短紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)周期的專用培養(yǎng)基。本發(fā)明可以通過(guò)以下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基是每升水中含有2.03.5gKN03、75300mgCaCl22H20、62.5250mgMgS047H20、2095mgNaH2P042H20、2.510mgKI、10270mgH3B03、1050mgMnS04H20、6lOOmgZnS047H20、0.0050.05mgNa2Mo042H20、0.110mgCuS045H20、0.110mgCoCl26H20、50200mg肌醇、0.0010.5mg煙酸、0.55mg維生素B6、0.0010.5mg維生素B"120mgNAA、0.2lmg6_BA、0.2lmgGA3、3060g碳源、0.843.34mg硝酸銀、0.110mg水楊酸、0.110mg殼聚糖、11.244.9mg甲基茉莉酮酸、0.62.4g擰檬酸三銨、50585.6mg谷氨酰胺、0.110mgLa2(S04)3'9H20、150mg苯丙氨酸、150mg氨基乙酸、150mg色氨酸和150mg賴氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是專用培養(yǎng)基是每升水中含有2.75gKN03、150mgCaCl2*2H20、125mgMgS04*7H20、42.5mgNaH2P04*2H20、5mgKl、90mgH3B03、30mgMnS04*H20、80mgZnS047H20、0.OlmgNa2Mo042H20、lmgCuS045H20、lmgCoCl26H20、lOOmg肌醇、0.01mg煙酸、lmg維生素Be、0.01mg維生素Bp8mgNAA、0.5mg6_BA、0.5mgGA^45g碳源、1.67mg硝酸銀、lmg水楊酸、lmg殼聚糖、22.4mg甲基茉莉酮酸、1.2g檸檬酸三銨、292.8mg谷氨酰胺、2mgLa2(S04)3'9H20、10mg苯丙氨酸、10mg氨基乙酸、15mg色氨酸和10mg賴氨酸。所述的碳源是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖中的一種或兩種及其兩種以上的物質(zhì)。本發(fā)明的專用培養(yǎng)基與B5培養(yǎng)基進(jìn)行基本成分對(duì)比生產(chǎn)時(shí)，在B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)36天后紫杉醇最高含量為3.5mg/L，在專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)36天后紫杉醇最高含量為14.6mg/L，專用培養(yǎng)基中紫杉醇的含量是Bs培養(yǎng)基4.2倍，效果顯著，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11;在專用培養(yǎng)基中接入高密度紅豆杉植物細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中添加硝酸銀、水楊酸、殼聚糖、甲基茉莉酮酸、檸檬酸三銨、硫酸鑭、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸、和賴氨酸進(jìn)行組合試驗(yàn)，可以進(jìn)一步提高紫杉醇的含量，并縮短細(xì)胞生產(chǎn)周期，細(xì)胞培養(yǎng)31天后紫杉醇含量最高為285.15mg/L，是B5培養(yǎng)基中紫杉醇含量的81倍，并且生產(chǎn)周期縮短了5天，實(shí)現(xiàn)通過(guò)專用培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞高效率生產(chǎn)紫杉醇，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但其不代表為本發(fā)明的唯一實(shí)施方式。實(shí)施例一培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基是每升水中含有2.0gKN03、75mgCaCl2*2H20、62.5mgMgS04*7H20、20mgNaH2P04*2H20、2.5mgKI、10mgH3B03、10mgMnS04*H20、6mgZnS047H20、0.005mgNa2Mo042H20、0.lmgCuS045H20、0.lmgCoCl26H20、50mgJ3Jl醇、0.001mg煙酸、0.5mg維生素B6、0.OOlmg維生素BplmgNAA、0.2mg6_BA、0.2mgGA3、30g葡萄糖或果糖或者是麥芽糖、0.84mg硝酸銀、0.lmg水楊酸、0.lmg殼聚糖、11.2mg甲基茉莉酮酸、0.6g檸檬酸三銨、50mg谷氨酰胺、0.lmgLa2(S04)3*9H20、lmg苯丙氨酸、lmg氨基乙酸、lmg色氨酸和lmg賴氨酸。實(shí)施例二培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基是每升水中含有3.5gKN03、300mgCaCl2'2H20、250mgMgS04'7H20、95mgNaH2P04*2H20、lOmgKl、270mgH3B03、50mgMnS04*H20、lOOmgZnS047H20、0.05mgNa2Mo042H20、10mgCuS045H20、10mgCoCl26H20、200mgJ3Jl醇、0.5mg煙酸、5mg維生素B6、0.5mg維生素B"20mgNAA、lmg6-BA、lmgGA3、60g蔗糖或乳糖或者是半乳糖、3.34mg硝酸銀、10mg水楊酸、10mg殼聚糖、44.9mg甲基茉莉酮酸、2.4g檸檬酸三銨、585.6mg谷氨酰胺、lOmgLa2(S04)39H20、50mg苯丙氨酸、50mg氨基乙酸、50mg色氨酸和50mg賴氨酸。實(shí)施例三培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基是每升水中含有2.75gKN03、150mgCaCl2'2H20、125mgMgS04*7H20、42.5mgNaH2P04'2H20、5mgKI、90mgH萬(wàn)、30mgMnS04*H20、80mgZnS047H20、0.OlmgNa2Mo042H20、lmgCuS045H20、lmgCoCl26H20、lOOmg肌醇、0.01mg煙酸、lmg維生素Be、0.01mg維生素Bp8mgNAA、0.5mg6_BA、0.5mgGA^45g碳源、1.67mg硝酸銀、lmg水楊酸、lmg殼聚糖、22.4mg甲基茉莉酮酸、1.2g檸檬酸三銨、292.8mg谷氨酰胺、2mgLa2(S04)3'9H20、10mg苯丙氨酸、10mg氨基乙酸、15mg色氨酸和10mg賴氨酸。碳源是蔗糖與葡萄糖及果糖，碳源也可以是麥芽糖與乳糖及半乳糖；蔗糖、葡萄糖與果糖可以是任意質(zhì)量比，麥芽糖、乳糖與半乳糖也可以是任意質(zhì)量比。本發(fā)明的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的試驗(yàn)1、紅豆杉植物細(xì)胞來(lái)源和種子繼代培養(yǎng)條件供試材料為實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)篩選并繼代培養(yǎng)保存的中國(guó)紅豆杉細(xì)胞株，以B5為基本培養(yǎng)基，添加lmg/LNAA、0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺作為繼代培養(yǎng)基。繼代時(shí)采用1000ml三角瓶?jī)?nèi)裝400ml繼代培養(yǎng)基，接入繼代培養(yǎng)14天的紅豆杉植物細(xì)胞，然后將三角瓶置于2226t:恒溫室內(nèi)的搖床上，以120rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)14天后作為種子來(lái)做正交優(yōu)化試驗(yàn)。2、含有紫杉醇的紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)液樣品的測(cè)定方法2.1培養(yǎng)液中紫杉醇含量的測(cè)定取10ml培養(yǎng)液加入10ml二氯甲烷，萃取3次，合并萃取液，減壓回收二氯甲烷，干物質(zhì)用甲醇溶解定容后，用HPLC檢測(cè)。2.2紫杉醇含量的HPLC測(cè)定方法采用WatersHPLC，分離柱是反相硅膠柱，反相硅膠柱為Nova-PakC184iim150mmX3.9mm，流動(dòng)相為甲醇乙腈水體積比為29:27:44，反相硅膠柱溫度35°C，流速lml/min，洗脫時(shí)間llmin，在227nm處用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，紫杉醇定量采用外標(biāo)法，每次進(jìn)樣量為5iiL，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品為SIGMA公司生產(chǎn)。3、專用培養(yǎng)基優(yōu)化方法100ml培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)基根據(jù)選取的正交試驗(yàn)表配方配制，其中維生素C、谷氨酰胺、檸檬酸三銨、甲基茉莉酮酸、水楊酸、硫酸鑭、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和賴氨酸采用0.22Pm濾膜無(wú)菌過(guò)濾后加入，繼代培養(yǎng)14天的中國(guó)紅豆杉細(xì)胞種子用80目不銹鋼過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾后接入培養(yǎng)基中，在2327°C、120rpm搖床轉(zhuǎn)速及黑暗下進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加硫酸鑭、硝酸銀、甲基茉莉酮酸、殼聚糖、檸檬酸三銨、谷氨酰胺、水楊酸、硫酸鑭、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第3040天收獲，取樣檢測(cè)紫杉醇含量。4、專用培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)100ml培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶?jī)?nèi)，以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配方，根據(jù)表1和表2的L18(37)正交試驗(yàn)表配制出不同成分的生產(chǎn)培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖、8mg/LNAA和0.5mg/L6-BA，并無(wú)菌過(guò)濾加入100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺，無(wú)菌過(guò)濾接入相當(dāng)于9.3g/L干重的繼代培養(yǎng)14天的中國(guó)紅豆杉植物細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第21天時(shí)，添加La2(S04)3*9H20、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第38天收獲，取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中紫杉醇試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2:比較合適的培養(yǎng)基成分為大于3g/LKN03、0mg/L(NH4)2S04、150mg/LCaCl22H20、45g/L蔗糖、3050mg/LMnS04H20、0.25lmg/LCuS045H20、2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L賴氨酸。初步優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為3.Og/LKN03、250mg/LMgS047H20、170mg/LNaH2P04'2H20、0mg/L(NH4)2S04、150mg/LCaCl2*2H20、lOmg/LMnS04*H20、3.75mg/LKl、3mg/LH3B03、2.5mg/LZnS047H20、0.25mg/LNa2Mo042H20、0.025mg/LCoCl26H20、0.025mg/LCuS045H20、100mg/L維生素C、100mg/L肌醇、lmg/L維生素B^O.lmg/L維生素B6、0.lmg/L煙酸、8mg/LNAA、0.5mg/L6_BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L賴氨酸、27.8mg/LFeS04*7H20、37.3mg/LNa2-EDTA21120，定容后調(diào)pH5.8。表1L18(37)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表1中I、II和III為水平序號(hào)；其中A表示K冊(cè)3，濃度分別為3g/L、l.5g/L和Og/L;B表示(朋4)2504，濃度分別為536mg/L、134mg/L和Omg/L;C表示CaCl21120，濃度分別為300mg/L、150mg/L和75mg/L;D表示蔗糖，濃度分別為30g/L、45g/L和60g/L;E表示MnS04!120，濃度分別為50mg/L、30mg/L和20mg/L;F表示CuS0451120，濃度分別為1.Omg/L、0.25mg/L和0.05mg/L;G表示硫酸鑭、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和賴氨酸的不同濃度組合，組合1含有O.2mg/LLa2(S04)39H20、5mg/L苯丙氨酸、5mg/L氨基乙酸、5mg/L色氨酸、5mg/L賴氨酸；組合2含有2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L賴氨酸；組合3含有10mg/LLa2(S04)3'9H20、50mg/L苯丙氨酸、50mg/L氨基乙酸、50mg/L色氨酸、50mg/L賴氨酸。表2正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注1表2中1、2和3為水平序號(hào)；2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。5、專用培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)采用250ml三角瓶，以步驟4初步優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為基本培養(yǎng)基，內(nèi)裝100ml根據(jù)表3和表4的L27(313)正交試驗(yàn)表所配制出的不同成分生產(chǎn)培養(yǎng)基，無(wú)菌過(guò)濾加入lOOmg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺，無(wú)菌過(guò)濾接入相當(dāng)于4.6g/L、6.9g/L和2.5g/L干重的繼代培養(yǎng)14天的中國(guó)紅豆杉植物細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第21天時(shí)，添加2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和lOmg/L賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第31天收獲，取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中紫杉醇含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4:比較合適的培養(yǎng)基成分為3g/LKN03、125500mg/LMgS04*7H20、85340mg/LNaH2P04*2H20、27.8mg/LFeS04*7H20、37.3mg/LNa2_EDTA*2H20、2.25mg/LKI、大于9mg/LH萬(wàn)、大于6mg/LZnS047H20、0.250.75mg/LNa2Mo042H20、小于0.5mg/LGA3、50200mg/L肌醇、0.25mg/LCoCl26H20。繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基為3.Og/LKN03、250mg/LMgS047H20、170mg/LNaH2P042H20、0mg/L(NH4)2S04、150mg/LCaCl22H20、lOmg/LMnS04H20、2.25mg/LKI、9mg/LH3B03、6mg/LZnS047H20、0.25mg/LNa2Mo042H20、0.25mg/LCoCl26H20、0.025mg/LCuS045H20、100mg/L維生素C、100mg/L肌醇、lmg/L維生素B^O.lmg/L維生素B6、0.lmg/L煙酸、8mg/LNAA、0.5mg/LGA3、0.5mg/L6_BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/LLa2(S04)3*9H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L賴氨酸、27.8mg/LFeS047H20、37.3mg/LNa2_EDTA21120，定容后調(diào)pH5.8。表3LJ313)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表3中1、1I和III為水平序號(hào)，其中A表示KN()3，濃度分別為3g/L、6g/L和9g/L;B表示MgS04*7H20，濃度分別為125mg/L、250mg/L和500mg/L;C表示NaH2P04*2H20，濃度分別為85mg/L、170mg/L和340mg/L;D表示鐵鹽，濃度分別為2.5ml/L、5.Oml/L和10ml/L，相當(dāng)于FeS04'7H20與Na2-EDTA*21120的濃度分別為13.9mg/L+18.7mg/L、27.8mg/L+37.3mg/L和55.6mg/L+74.6mg/L;E表示KI，濃度分別為0.75mg/L、2.25mg/L和6.75mg/L;F表示H3B03，濃度分別為3mg/L、6mg/L和9mg/L;G表示ZnS047H20，濃度分別為2mg/L、6mg/L和18mg/L;H表示Na2Mo042H20，濃度分別為0.25mg/L、0.75mg/L和2.25mg/L;1表示GA3，濃度分別為Omg/L、0.5mg/L和2mg/L;J表示肌醇，濃度分別為50mg/L、lOOmg/L和200mg/L;K表示CoCl26H20，濃度分別為0.025mg/L、0.25mg/L和2.5mg/L;L表示誤差項(xiàng)；M表示接種量，接種密度分別為鮮重56.5g/L，相當(dāng)于干重為4.6g/L;鮮重84.7g/L，相當(dāng)于干重為6.9g/L;鮮重24.5g/L，相當(dāng)于干重為2.lg/L。表4正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注1表4中1、2和3為水平序號(hào)；2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。6、專用培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)采用250ml三角瓶，以步驟5繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為基本培養(yǎng)基，內(nèi)裝100ml根據(jù)表5和表6的k(37)正交試驗(yàn)表所配制出的不同成分生產(chǎn)培養(yǎng)基，并無(wú)菌過(guò)濾加入100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺，無(wú)菌過(guò)濾接入相當(dāng)于5.Og/L干細(xì)胞的繼代培養(yǎng)14天的中國(guó)紅豆杉植物細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第21天時(shí)，添加2mg/LLa2(S04)3'9H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第27天收獲，取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中紫杉醇含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6:比較合適的培養(yǎng)基成分為2.03.5g/LKN03、3.45mg/LFeS047H20、4.66mg/LNa2_EDTA2H20、0.lmg/L煙酸、lmg/L維生素B6、lmg/L維生素0.010.25mg/LNa2Mo0421120、鮮重接種量大于113.6g/L，相當(dāng)于干重大于9.3g/L。繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基為2.75g/LKN03、250mg/LMgS047H20、170mg/LNaH2P042H20、0mg/L(NH4)2S04、150mg/LCaCl22H20、10mg/LMnS04H20、2.25mg/LKI、9mg/LH萬(wàn)、6mg/LZnS047H20、0.0lmg/LNa2Mo042H20、0.25mg/LCoCl26H20、0.025mg/LCuS045H20、100mg/L維生素C、100mg/L肌醇、lmg/L維生素B丄、lmg/L維生素B6、0.lmg/L煙酸、8mg/LNAA、0.5mg/LGA3、0.5mg/L6_BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L賴氨酸、3.45mg/LFeS047H20、4.66mg/LNa2_EDTA21120，定容后調(diào)pH5.8。表5LJ37)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表5中I、n和III為水平序號(hào)，其中A表示KN03，濃度分別為2.5g/L、3.Og/L和3.5g/L;B表示鐵鹽，濃度分別為0.625ml/L、l.25ml/L、2.5ml/L，相當(dāng)于FeS047H20與N2-EDTA2H20的濃度分別為3.48mg/L+4.67mg/L、6.95mg/L+9.35mg/L和13.9mg/L+18.7mg/L;C表示煙酸，濃度分別為0.lmg/L、lmg/L和lOmg/L;D表示維生素B6，濃度分別為O.lmg/L、lmg/L和10mg/L;E表示維生素B!，濃度分別為0.lmg/L、lmg/L和lOmg/L;F表示Na2Mo0421120，濃度分別為0.01mg/L、0.05mg/L和0.25mg/L;G表示接種量，接種密度分別為鮮重59.5g/L，相當(dāng)于干重為4.5g/L;鮮重86.6g/L，相當(dāng)于干重為7.2g/L;鮮重113.6g/L，相當(dāng)于干重為9.3g/L。表6正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注1表6中1、2和3為水平序號(hào)；2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。7、專用培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)采用250ml三角瓶，以步驟6繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為基本培養(yǎng)基，內(nèi)裝100ml根據(jù)表7和表8的LJ37)正交試驗(yàn)表所配制出的不同成分生產(chǎn)培養(yǎng)基，100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾后加入，無(wú)菌過(guò)濾接入繼代培養(yǎng)14天的中國(guó)紅豆杉植物細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第21天時(shí)，添加2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第27天收獲，取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中紫杉醇試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8:比較合適的培養(yǎng)基成分為lmg/LCuS045H20、lmg/LCoCl2*H20、90mg/LH萬(wàn)、0mg/LFeS047H20、0mg/LNa2_EDTA2H20、0.Olmg/L維生素B^O.Olmg/L煙酸、45g/L蔗糖、100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺。繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基為2.75g/LKN03、250mg/LMgS047H20、85mg/LNaH2P042H20、0mg/L(NH4)2S04、150mg/LCaCl22H20、lOmg/LMnS04H20、2.25mg/LKI、90mg/LH萬(wàn)、6mg/LZnS047H20、0.Olmg/LNa2Mo042H20、lmg/LCoCl26H20、lmg/LCuS04*5H20、100mg/L維生素C、100mg/L肌醇、0.Olmg/L維生素lmg/L維生素B6、0.Olmg/L煙酸、8mg/LNAA，0.5mg/LGA3、0.5mg/L6_BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/LLa2(S04)39H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L賴氨酸、0mg/LFeS047H20、0mg/LNa2_EDTA21120，定容后調(diào)pH5.8。表7LJ37)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表7中I、II和III為水平序號(hào)，其中A表示接種量，接種密度分別為干重11.07g/L、15.65g/L和6.63g/L;B表示CuS045H20，濃度分別為lmg/L、2.5mg/L和5mg/L;C表示CoCl26H20，濃度分別為0.Img/L、0.3mg/L和0.9mg/L;D表示鐵鹽、維生素C和谷氨酰胺，濃度分別為Omg/L;0.5ml/L鐵鹽相當(dāng)于2.73mg/LFeS047H20和3.78mg/LNa2-EDTA*2H20;100mg/LVc+292.8mg/L谷氨酰胺；E表示煙酸和維生素B"濃度分別為Omg/L+Omg/L、0.Olmg/L+0.Olmg/L禾P0.05mg/L+0.05mg/L;F表示H3B03，濃度分別為90mg/L、180mg/L和270mg/L;G表示蔗糖，濃度分別為35g/L、40g/L和45g/L。表8正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注1表8中1、2和3為水平序號(hào)，21代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。8、專用培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)采用250ml三角瓶，以步驟7繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為基本培養(yǎng)基，內(nèi)裝100ml根據(jù)表8和表9Lg(34)正交試驗(yàn)表所配制出的不同成分生產(chǎn)培養(yǎng)基，100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺采用無(wú)菌過(guò)濾后加入，無(wú)菌過(guò)濾接入繼代培養(yǎng)14天的中國(guó)紅豆杉植物細(xì)胞，接種量為287g/L，相當(dāng)于13.7g/L干重，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第21天時(shí)，添加2mg/LLa2(S04)3*9H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第27天收獲，取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中紫杉醇含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10:比較合適的培養(yǎng)基成分為80mg/LZnS047H20、5mg/LKI、125mg/LMgS047H20、42.5mg/LNaH2P042H20。繼續(xù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基為2.75g/LKN03、125mg/LMgS047H20、42.5mg/LNaH2P04'2H20、0mg/L(NH4)2S04、150mg/LCaCl22H20、lOmg/LMnS04*H20、5mg/LKI、90mg/LH3B03、80mg/LZnS047H20、0.Olmg/LNa2Mo042H20、lmg/LCoCl26H20、lmg/LCuS045H20、100mg/L維生素C、100mg/L肌醇、0.Olmg/L維生素lmg/L維生素B6、0.Olmg/L煙酸、8mg/LNAA、0.5mg/LGA3、0.5mg/L6-BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/LLa2(S04)3*9H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L賴氨酸、0mg/LFeS04*7H20、0mg/LNa2-EDTA21120，定容后調(diào)pH5.8。表9LJ34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注表9中I、II和III為水平序號(hào)，其中A表示ZnS04*71120，濃度分別為20mg/L、40mg/L和80mg/L;B表示KI，濃度分別為2.25mg/L、5mg/L和lOmg/L;C表示MgS04*7H20，濃度分別為62.5mg/L、125mg/L和250mg/L;D表示NaH2P042H20，濃度分別為170mg/L、42.5mg/L禾口85mg/L。表10正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注1表10中1、2和3為水平序號(hào)，21代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。9、專用培養(yǎng)基基本成分和B5培養(yǎng)基對(duì)比試驗(yàn)以步驟8優(yōu)化出的生產(chǎn)培養(yǎng)基配方作為最終的生產(chǎn)培養(yǎng)基配方，即專用生產(chǎn)培養(yǎng)基，與B5培養(yǎng)基做對(duì)比試驗(yàn)，采用250ml三角瓶?jī)?nèi)裝100ml專用培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基各10瓶，100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺采用無(wú)菌過(guò)濾加入，無(wú)菌過(guò)濾接入繼代培養(yǎng)14天的紅豆杉植物細(xì)胞，接種量為鮮重274.8g/L，相當(dāng)于干重為13.7g/L，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第21天時(shí)，添加2mg/LLa2(S04)3'9H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第38天收獲，從20天開(kāi)始取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中紫杉醇含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11:經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的專用培養(yǎng)基比B5培養(yǎng)基更有利于紫杉醇的積累，在B5培養(yǎng)基培養(yǎng)到36天時(shí)，紫杉醇含量最高為3.5mg/L，在專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)到36天時(shí)，紫杉醇含量最高達(dá)到14.6mg/L，采用專用培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中紫杉醇含量是85培養(yǎng)基4.2倍。表11專用培養(yǎng)基與B5培養(yǎng)基培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的含量對(duì)比結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>10、專用培養(yǎng)基和促進(jìn)劑組合試驗(yàn)采用250L通氣攪拌式不銹鋼發(fā)酵罐，內(nèi)裝200L根據(jù)步驟8所優(yōu)化出的專用培養(yǎng)基，接種量為150g/L鮮重細(xì)胞，相當(dāng)于干重為13.Og/L，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，通氣量0.2vvm，培養(yǎng)溫度2325°C，無(wú)菌過(guò)濾加入100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺，培養(yǎng)的前30天加入lmg/L水楊酸、1.67mg/L硝酸銀、lmg/L殼聚糖、22.4mg/L甲基茉莉酮酸、1.2g/L擰檬酸三銨、2mg/LLa2(S04)3*9H20、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L賴氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)到第31天時(shí)胞內(nèi)外紫杉醇含量總和為285.15mg/L，是B5培養(yǎng)基中紫杉醇最高含量的81倍，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。表12專用培養(yǎng)基和促進(jìn)劑組合試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求一種培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基，其特征在于專用培養(yǎng)基是每升水中含有2.0～3.5gKNO3、75～300mgCaCl2·2H2O、62.5～250mgMgSO4·7H2O、20～95mgNaH2PO4·2H2O、2.5～10mgKI、10～270mgH3BO3、10～50mgMnSO4·H2O、6～100mgZnSO4·7H2、0.005～0.05mgNa2MoO4·2H2O、0.1～10mgCuSO4·5H2O、0.1～10mgCoCl2·6H2O、50～200mg肌醇、0.001～0.5mg煙酸、0.5～5mg維生素B6、0.001～0.5mg維生素B1、1～20mgNAA、0.2～1mg6-BA、0.2～1mgGA3、30～60g碳源、0.84～3.34mg硝酸銀、0.1～10mg水楊酸、0.1～10mg殼聚糖、11.2～44.9mg甲基茉莉酮酸、0.6～2.4g檸檬酸三銨、50～585.6mg谷氨酰胺、0.1～10mgLa2(SO4)3·9H2O、1～50mg苯丙氨酸、1～50mg氨基乙酸、1～50mg色氨酸和1～50mg賴氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基，其特征在于專用培養(yǎng)基是每升水中含有2.75gKN03、150mgCaCl22H20、125mgMgS047H20、42.5mgNaH2P04*2H20、5mgKl、90mgH3B03、30mgMnS04'H20、80mgZnS04*7H2、0.OlmgNa2Mo04*2H20、lmgCuS045H20、lmgCoCl26H20、100mg肌醇、0.Olmg煙酸、lmg維生素B6、0.Olmg維生素V8mgNAA、0.5mg6_BA、0.5mgGA3、45g碳源、1.67mg硝酸銀、lmg水楊酸、lmg殼聚糖、22.4mg甲基茉莉酮酸、1.2g檸檬酸三銨、292.8mg谷氨酰胺、2mgLa2(S04)3冊(cè)20、101^苯丙氨酸、10mg氨基乙酸、15mg色氨酸和10mg賴氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基，其特征在于碳源是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖中的一種或兩種及其兩種以上的物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基，以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配方，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)得到用于培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的專用培養(yǎng)基。本發(fā)明的專用培養(yǎng)基與B5培養(yǎng)基進(jìn)行基本成分對(duì)比生產(chǎn)時(shí)，專用培養(yǎng)基中紫杉醇的含量是B5培養(yǎng)基4.2倍；當(dāng)接入高密度紅豆杉植物細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中添加硝酸銀、水楊酸、殼聚糖、甲基茉莉酮酸、檸檬酸三銨、硫酸鑭、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和賴氨酸進(jìn)行組合試驗(yàn)，能進(jìn)一步提高紫杉醇的含量，縮短細(xì)胞生產(chǎn)周期，細(xì)胞培養(yǎng)到第31天時(shí)，紫杉醇的含量最高為285.15mg/L，是B5培養(yǎng)基中紫杉醇最高含量的81倍，實(shí)現(xiàn)采用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞來(lái)高效率生產(chǎn)紫杉醇。文檔編號(hào)C12P17/02GK101696436SQ200910193549公開(kāi)日2010年4月21日申請(qǐng)日期2009年10月30日優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日發(fā)明者侯云屏,古志淵,張京維,曹德,李干雄,肖華,駱雪蘭,黃巧明申請(qǐng)人:梅州市杉維生物醫(yī)藥工程研究有限公司;