專利名稱：利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸
和蛋白飼料添加劑的方法。
背景技術(shù)：
微藻中含有脂肪酸、蛋白質(zhì)和碳水化合物等多種營養(yǎng)成分，是一種很好的可再生 資源。隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)中脂肪酸含量可高達(dá)50 %左右，二十二碳六烯 酸(DHA)的含量可占到脂肪酸含量的50%左右。提取脂肪酸的藻渣中蛋白質(zhì)含量大幅提 高，高達(dá)46%左右，同時(shí)還有殘存的多不飽和脂肪酸，是一種很好的蛋白質(zhì)飼料資源。隱甲 藻(Crypthecodinium cohnii)制備脂肪酸以及藻體作為水產(chǎn)餌料的安全性已經(jīng)被廣泛認(rèn) 可。如何最大限度的利用發(fā)酵生產(chǎn)微藻中的多不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)資源是一個(gè)需要解決 的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法，本發(fā)明方法不僅可以生產(chǎn)多不飽 和脂肪酸以及DHA，而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣，具有經(jīng)濟(jì)可行性，而且可以變藻 渣為寶，實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的清潔生產(chǎn)。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn) —種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法，包括如下步驟
(1)低溫保存的隱甲藻經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)制得微藻種子液；將微藻種子液接種到滅菌后 的發(fā)酵培養(yǎng)基，在20 3(TC下發(fā)酵，通氣量為0. 5 1. 5vvm，當(dāng)糖濃度低于5g/L時(shí)，終止 發(fā)酵，得到發(fā)酵液； (2)分離步驟(1)得到的發(fā)酵液后，洗滌并干燥不溶物，得到藻體； (3)將藻體進(jìn)行壓榨提取，得到粗品油，經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪
酸精煉油； (4)壓榨后的藻渣粉碎后作為飼料添加劑。 步驟(1)所述擴(kuò)大培養(yǎng)是將低溫保存的隱甲藻經(jīng)試管和搖瓶逐級放大，在20 3(TC條件下，分別培養(yǎng)24 60小時(shí)，制得微藻種子液。試管和搖瓶培養(yǎng)階段均采用和發(fā)酵 培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基，制得微藻種子液；
步驟(1)所述發(fā)酵是在氣升式反應(yīng)器中進(jìn)行。 步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)基采用Porphyridium培養(yǎng)基，組成如下人造海水500mL， 蒸餾水400mL，土壤水lOOmL，胰蛋白胨lg/L，酵母粉lg/L g，葡萄糖30g/L。
所述的人造海水組成如下NaCl 18g/L， MgS04 7H20 2. 44g/L， KC1 0. 6g/L， NaN03l. 00g/L， CaCl2 2H20 0. 3g/L， KH2P040 . 05g/L， Tris 1. 00g/L， NH4C1 0. 267g/L， VB12 1. 5 X 10—7g/L，金屬離子溶液10mL，螯合鐵離子溶液3mL。
所述的金屬離子溶液組成如下H3B03 0 . 3 2 46g/100mL， CoCl2 6H20 1. 215X 10—4g/100mL， MnCl2 6H20 4. 320 X 10—5g/100mL， ZnCl2 3. 150 X 10—3g/100mL，濃硫酸 lmL， (NH4)6Mo7024 4H20 3. 119X 10—3g/100mL。所述的螯合鐵離子溶液組成如下0. lmol/L HC1 50mL， FeCl3 6H20
0. 081g/100mL，蒸餾水50mL， Na2EDTA 1. 000g/100mL。 步驟(1)所述接種的接種量為5 10%。 步驟(2)所述分離為采用離心分離或板框壓濾。 步驟(2)所述干燥為采用噴霧干燥或冷凍干燥。 步驟(2)所述洗滌為洗滌不溶物3 5次。 步驟(1)所述的滅菌是將發(fā)酵培養(yǎng)基在115t:下滅菌30分鐘。步驟(1)所述的低溫為4。C、-20。C、-8(TC或-196。C。 步驟(1)所述發(fā)酵時(shí)，當(dāng)糖濃度低于10g/L時(shí)，將碳源以及氮源以流加方式進(jìn)行補(bǔ)
加，延長了藻類對數(shù)生長期，可以有效地提高藻體濃度，降低下游工藝的生產(chǎn)成本。 步驟(1)所述的隱甲藻為Crypthecodinium cohnii。例如ATCC30556或者其馴化菌株。 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果 1.利用一種異養(yǎng)微藻，隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)在氣升式反應(yīng)器中發(fā) 酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，可以降低機(jī)械攪拌反應(yīng)器的剪切力對藻生長和產(chǎn)脂肪酸的影響， 具有設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單、節(jié)能和節(jié)省投資等優(yōu)點(diǎn)。 2.采用流加工藝，延長藻類對數(shù)生長期，可以有效地提高藻體濃度，降低下游工藝 的生產(chǎn)成本。 3.通過壓榨進(jìn)行多不飽和脂肪酸的提取，工藝簡單可行。
4.壓榨后的藻渣經(jīng)粉碎后可以用作蛋白質(zhì)飼料添加劑。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例所用培養(yǎng)基采用Porphyridium培養(yǎng)基，組成如下人造海水500mL， 蒸餾水400mL，土壤水lOOmL，胰蛋白胨lg/L，酵母粉lg/Lg，葡萄糖30g/L。
人造海水組成如下:NaCl 18g/L， MgS04 7H20 2. 44g/L， KC1 0. 6g/L，關(guān)03 1. 00g/L， CaCl2 2H20 0. 3g/L， KH2P04 0. 05g/L， Tris 1. 00g/L， NH4C1 0. 267g/L， VB12 1. 5X 10—7g/L，金屬離 子溶液lOmL，螯合鐵離子溶液3mL。 金屬離子溶液組成如下:H3B03 0. 3246g/100mL， CoCl2 6H20 1. 215 X 10—4g/100mL， MnCl2 *6H20 4. 320X 10—5g/100mL， ZnCl2 3. 150X 10—3g/100mL，硫酸lmL， (NH4)6Mo7024 *4H203. 119X 10—3g/100mL。 螯合鐵離子溶液組成如下0. lmol/L HC1 50mL， FeCl3 6H20 0. 081g/100mL，蒸餾 水50mL， Na2EDTA 1. 000g/100mL。
實(shí)施例1 利用微藻在氣升式反應(yīng)器中發(fā)酵同時(shí)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的 方法，具體如下 (1)微藻種子液制備-80。C保存的隱甲藻Crypthecodinium cohnii (ATCC30556)經(jīng)試管和搖瓶逐級放大，采用Porphyridium培養(yǎng)基，在2(TC條件下，試管和搖瓶階段分別 培養(yǎng)48小時(shí)，制得微藻種子液； (2)發(fā)酵10L氣升式反應(yīng)器中加入5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Porphyridium培養(yǎng)基)， 在115t:下滅菌30分鐘，冷卻至25t:，將制好的微藻種子液以5%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng) 基，控制溫度25°C，通入無菌空氣0. 5vvm，發(fā)酵60小時(shí)后，當(dāng)葡萄糖濃度低于10g/L時(shí)， 分兩次加入總量為500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和蛋白胨，120小時(shí)藻體含量達(dá)到 35. 3g/L，當(dāng)糖濃度低于5g/L時(shí)，終止發(fā)酵，得到發(fā)酵液； (3)藻體收集和干燥對發(fā)酵液進(jìn)行離心分離、洗滌不溶物3次，收集不溶物，將收 集的藻體進(jìn)行噴霧干燥，得到186克干燥藻體； (4)將多次發(fā)酵收集所得的干燥藻體約1000克進(jìn)行壓榨提取，經(jīng)堿煉、脫色和脫 臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油352克，含DHA 36. 5% ; (5)壓榨后的藻渣632.5克，蛋白質(zhì)含量46. 1 % ，經(jīng)粉碎可以作為蛋白質(zhì)飼料添加 劑。 實(shí)施例2 利用微藻在氣升式反應(yīng)器中發(fā)酵同時(shí)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的 方法，具體如下 (1)微藻種子液制備-196 。C保存的隱甲藻Crypthecodinium cohnii (ATCC30556)經(jīng)試管和搖瓶逐級放大，采用Porphyridium培養(yǎng)基，在25。C條件下，試 管和搖瓶階段分別培養(yǎng)40小時(shí)，制得微藻種子液； (2)發(fā)酵10L氣升式反應(yīng)器中加入5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Porphyridium培養(yǎng)基)， 在115t:下滅菌30分鐘，冷卻至28t:，按照5%接種量接入種子液，控制溫度28t:，通入無 菌空氣1. Ovvm，發(fā)酵54小時(shí)后，當(dāng)葡萄糖濃度低于10g/L時(shí)，分兩次補(bǔ)加500g/L碳源以及 100g/L酵母抽提物和蛋白胨，108小時(shí)藻體含量達(dá)到34. 2g/L，當(dāng)糖濃度低于5g/L時(shí)，終止 發(fā)酵； (3)藻體收集和干燥對發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，并洗滌不溶物5次，收集不溶物藻 體，將收集的藻體進(jìn)行噴霧干燥，得到179克干燥藻體； (4)將多次發(fā)酵收集所得的干燥藻體約1000克進(jìn)行壓榨提取，經(jīng)堿煉、脫色和脫 臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油338克，含DHA 33. 4% ; (5)壓榨后的藻渣約632克，蛋白質(zhì)含量約47.2%，經(jīng)粉碎可以作為蛋白質(zhì)飼料添 加劑。 實(shí)施例3 利用微藻在氣升式反應(yīng)器中發(fā)酵同時(shí)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的 方法，具體如下 (1)微藻種子液制備4。C保存的隱甲藻Crypthecodinium cohnii (ATCC30556)經(jīng) 試管和搖瓶逐級放大，采用Porphyridium培養(yǎng)基，在3(TC條件下，試管和搖瓶階段培養(yǎng)24 小時(shí)，制得微藻種子液； (2)發(fā)酵10L氣升式反應(yīng)器中加入5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Porphyridium培養(yǎng)基)， 在115t:下滅菌30分鐘，冷卻至30°C ，按照10%接種量接入種子液，控制溫度30°C ，通入無 菌空氣1. 5vvm，發(fā)酵48小時(shí)后，分兩次加入總量為500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和
5蛋白胨，84小時(shí)藻體含量達(dá)到36. 2g/L，當(dāng)糖濃度低于5g/L時(shí)，終止發(fā)酵； (3)藻體收集和干燥對發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，并洗滌不溶物3次，收集不溶物藻
體。將收集的藻體進(jìn)行噴霧干燥，得到191克干燥藻體； (4)將多次發(fā)酵收集所得的干燥藻體約1000克進(jìn)行壓榨提取，經(jīng)堿煉、脫色和脫 臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油308克，含DHA 28. 5% (5)壓榨后的藻渣約667克，蛋白質(zhì)含量約45.5%，經(jīng)粉碎可以作為蛋白質(zhì)飼料添 加劑。
權(quán)利要求
一種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)低溫保存的隱甲藻經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)制得微藻種子液；將微藻種子液接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基，在20～30℃下發(fā)酵，通氣量為0.5～1.5vvm，當(dāng)糖濃度低于5g/L時(shí)，終止發(fā)酵，得到發(fā)酵液；(2)分離步驟(1)得到的發(fā)酵液后，洗滌并干燥不溶物，得到藻體；(3)將藻體進(jìn)行壓榨提取，得到粗品油，經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油；(4)壓榨后的藻渣粉碎后作為飼料添加劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的隱甲藻為 Crypthecodiniumcohnii 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述擴(kuò)大培養(yǎng)是將低溫保存的 隱甲藻經(jīng)試管和搖瓶逐級放大，在20 3(TC條件下，分別培養(yǎng)24 60小時(shí)，制得微藻種子 液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述發(fā)酵是在氣升式反應(yīng)器中進(jìn)行。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)基采用 Porphyridium培養(yǎng)基，組成如下人造海水500mL，蒸餾水400mL， 土壤水lOOmL，胰蛋白胨 lg/L，酵母粉lg/Lg，葡萄糖30g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述接種的接種量為5 10%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述分離為采用離心分離或板框 壓濾。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述干燥為采用噴霧干燥或冷凍 干燥。
9. 據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述洗滌為洗滌不溶物3 5次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用隱甲藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑的方法。本發(fā)明利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)在氣升式生物反應(yīng)器中發(fā)酵同時(shí)生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和蛋白飼料添加劑，包括微藻種子液制備、發(fā)酵、藻體收集和干燥、多不飽和脂肪酸的提取幾個(gè)步驟。本發(fā)明方法得到的精煉油中DHA含量達(dá)36.5％，提取多不飽和脂肪酸后微藻渣(干)蛋白質(zhì)含量達(dá)到46.3％，本發(fā)明方法不僅可以生產(chǎn)多不飽和脂肪酸以及DHA，而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣，具有經(jīng)濟(jì)可行性，而且可以變藻渣為寶，實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的清潔生產(chǎn)。
文檔編號C12P7/64GK101717800SQ20091019373
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者朱明軍, 梁世中, 王菊芳, 郭星 申請人:華南理工大學(xué);江西泰成生物科技有限公司