專利名稱：甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，具體涉及利用基因工程技術(shù)獲得一種甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(LAPPT)基因啟動子，并將其應(yīng)用于水稻胚乳轉(zhuǎn)基因操作和遺傳改良。
背景技術(shù)：
胚乳是作物種子中重要的淀粉和和蛋白質(zhì)儲藏的組織類型，世界糧食生產(chǎn)中60%的能量和蛋白質(zhì)均來源于作物的胚乳。在作物轉(zhuǎn)基因研究過程中，相對于其它表達(dá)器官和組織類型，應(yīng)用作物的胚乳作為異源基因或蛋白表達(dá)的平臺具有成本低、易于控制、產(chǎn)量大、生產(chǎn)過程安全等諸多優(yōu)勢(Takaiwa et al， 2007， Endosperm tissue is a goodproduction platform for artificial recombinant proteins intransgenic rice.Plant Biotechnol J，5，84_92. ;Wu et al，2007，0ral immunization withtransgenicrice seeds expressing VP2 protein of infectious bursal disease virusinducesprotective immune responses in chickens. Plant Biotechnol J. 5，570-578)。 目前，通過遺傳修飾的方式對作物胚乳中的產(chǎn)物組成進(jìn)行修飾是目前重要的研究方向，也取得了 一定的研究成果(Bajaj and Mohanty， 2005， Recent advances inricebiotechnology__towards genetically superior transgenic rice. Plant BiotechnolJ， 3 (3) ，275-307)。然而，在以往應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方式改良作物胚乳的研究中，由于缺乏有效的胚乳特異啟動子使得相關(guān)研究進(jìn)展十分緩慢。因此，篩選和克隆新的胚乳特異啟動子類型并將外源基因特異表達(dá)在作物的胚乳中將是今后有關(guān)作物遺傳改良研究的熱點之一。
在以往的作物遺傳改良過程中，重復(fù)的使用同樣的啟動子類型是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因？冗默的主要原因(Bhullar et al，2003， Strategies for development offunctionallyequivalent promoters with minimum sequence homology for transgeneexpression inplants :cis—elements in a novel DNA context versus domain swapping.Plant Physiol, 132,988-998)。為了達(dá)到多基因轉(zhuǎn)化的目的，需要在作物的遺傳改良中開發(fā)一系列具有組織特異型和高效表達(dá)的啟動子類型。在前期的研究過程中，研究者已經(jīng)陸續(xù)從水稻、小麥、玉米和大麥中篩選到了一些胚乳特異啟動子(Rasmussen and Donaldson,2006， Investigation of the endosperm—specific sucrosesynthase promoter fromrice using transient expression of reporter genes in guar seedtissue. PlantCell R印，25，1035—1042 ;Qu and Takaiwa，2004，Evaluation of tissuespecificity andexpression strength of rice seed component gene promoters intransgenic rice ;Plant Biotechnol J，2，113-125山amacchia et al，2001，Endosperm-specific activityof a storage protein gene promoter in transgenic wheatseed.J Exp Bot，52，243—250 ;Wiley et al， 2007， Promoter analysis andimmunolocalisation show thatpuroindoline genes are exclusively expressed instarchy endosperm cells ofwheat grain. Plant Mol Biol， 64，125—136 ; Russell andFromm 1997， Tissue—specificexpression in transgenic maize of four endospermpromoters from maize and rice.Transgenic Research, 6， 157-168)。然而，從實際的應(yīng)用效果上來看，目前可以成功應(yīng)用作物遺傳改良的啟動子類型依然十分有限，而且無法有效的針對作物重要的儲藏器官——種子進(jìn)行定向的修飾和改良。 以往在種子胚乳特異啟動子克隆過程中，主要是針對碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)酶類進(jìn)行研究，而忽略了以脂肪代謝酶為基礎(chǔ)克隆啟動子。甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移醇(l_acyl_sn_glycerol_3_P acyltransferase， LPAAT)是在Kennedy途徑中——禾中作用于脂肪酰磷脂酸(LPA)sn-2位置乙酰化產(chǎn)生磷脂酸PA(Phosphatidicacid)的關(guān)鍵酶。磷脂酸在磷脂酸磷酸酶作用下，水解釋放出無機(jī)磷酸，而轉(zhuǎn)變?yōu)楦视投?，再通過進(jìn)一步的酯化反應(yīng)生成甘油三酯(0kazaki et al. 2006， Thesignificance of C16 fattyacids in the sn_2 positions of glycerolipids in th印hotosynthetic growth ofSynechocystis sp. PCC6803. Plant Physiol， 141， 546-556)。目前，甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因被證明在甘油脂肪酸的分布上起重要作用(Coleman and Lee， 2004， Enzymes oftriacylglycerol synthesis and their regulation. Prog Lipid Res，43，134—176 ;Nathet al，2009， Increasing erucic acid content throughcombination of endogenouslow polyunsaturated fatty acids alleles with Ld_LPAAT+Bn_fael transgenes inrapeseed(Brassica napus L).Theor Appl Genet，118，765-773)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有植物胚乳特異型啟動子及其應(yīng)用中所存在的不足，提
供一種從椰子中提取的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因啟動子區(qū)序列。 本發(fā)明的另一目的在于提供上述甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子在作物胚乳轉(zhuǎn)
基因操作和遺傳改良中的應(yīng)用方法。 本發(fā)明還有一個目的在于提供一種從椰子中提取制備得到脂肪酸代謝途徑相關(guān)的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子的制備方法。 本發(fā)明甘油磷酸酯酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列來源于椰子，在原有的序列基礎(chǔ)上進(jìn)行甲基化、基因添加或缺失等修飾后，啟動子的作用效果有所改變。具體地，本發(fā)明上述目的通過如下方案予以實現(xiàn) 首先，本發(fā)明從椰子中提取制備得到了甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子，具體步驟如下 (1)以椰子基因組DNA及椰子脂肪酸代謝酶為基礎(chǔ)，設(shè)計特異引物，引物序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示； (2)通過染色體步行法擴(kuò)增引物，得到甘油磷酸酯酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列。 以往作物中胚乳啟動子的克隆都是基于儲藏蛋白和碳水化合物相關(guān)基因的基礎(chǔ)
上進(jìn)行的，獲得的啟動子類型也是與此類蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)，而本發(fā)明以脂肪
酸代謝途徑中的酶類為基礎(chǔ)，克隆獲得的胚乳特異性啟動子將在代謝途徑的控制、表達(dá)部
位和表達(dá)量上均有與以往發(fā)現(xiàn)的啟動子類型有明顯不同，在使用范圍和效果上也有不同。
因此，本發(fā)明啟動子是以椰子基因組DNA和甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物的。
4
上述制備過程中，所用的染色體步行法為本領(lǐng)域中的常用技術(shù)。
獲得甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列經(jīng)過植物啟動子分析軟件PlantCARE (http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)，分析證明該序列具有典型的植物組織特異性啟動子特征，如1個TATA box(位于-4) 、6個CAATbox(分別位于-878、-877、-842、-356、-335和+18)和4個5' UTR胞嘧啶含量豐富區(qū)(分別位于-170、 -216、 -276和-326);另外，還含有一個重要的胚乳特異表達(dá)的順式作用元件Skn-1基序(位于-127)。該啟動子序列如SEQ IDNO :1所示。 本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列特異性表達(dá)于作物胚乳中，可用于制備轉(zhuǎn)基因作物。 更進(jìn)一步地，本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列通過啟動gus基因在水稻胚乳中的表達(dá)來制備轉(zhuǎn)基因植株。 本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中的應(yīng)用，包括如下步驟 (1)將甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子插入啟動子驗證表達(dá)載體pBIlOl. 3，啟動gus報告基因的表達(dá)； (2)將上述表達(dá)載體用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物愈傷組織轉(zhuǎn)基因研究，通過植物愈傷組織誘導(dǎo)、浸染、共培養(yǎng)、篩選、生根獲得轉(zhuǎn)基因植株。 為了驗證甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子在作物胚乳中的表達(dá)控制效果，本發(fā)明通過引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增獲得了 3種5'端缺失的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子序列，缺失位置分別為-896、-817和_453。用上述三種缺失片段插入啟動子驗證表達(dá)載體。81101.3啟動gus報告基因的表達(dá)，將未插入任何片段的pBIlOl. 3空載體作為后期研究的對照載體。 將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)基因研究。將獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植物轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)后收獲的種子用于啟動子功能的表達(dá)驗證。通過對收獲種子的GUS表達(dá)分析證明在轉(zhuǎn)基因水稻的種子中，3種缺失片段的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子序列不同程度的啟動了 gus基因在水稻種子胚乳中的表達(dá)，但在葉片、花序、根、莖干和葉鞘中未檢測到gus基因的表達(dá)。同時，3種不同缺失片段亦表現(xiàn)出不同的表達(dá)量，預(yù)示著在5'端缺失的過程中，特殊作用元件Skn-l基序在最終的表達(dá)效果上起了重要作用。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 (1)本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子能夠特異的啟動目的基因在胚乳組織細(xì)胞中的表達(dá)，為作物遺傳改良中提供了新的啟動子類型，有很高的穩(wěn)定性和可操作性；
(2)本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子與其他已有的啟動子之間的同源性很小，不會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象； (3)本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子以椰子基因組DNA和脂肪酸代謝途徑中的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶為基礎(chǔ)設(shè)計引物，獲得的啟動子可用于脂肪酸代謝途徑調(diào)控中。


圖1為甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子表達(dá)載體構(gòu)建方式，其中A為不同5'端缺
5失片段和gUS基因連接方式；B為連接位點的編碼信息； 圖2為甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因啟動子轉(zhuǎn)入水稻種子及其它組織類型的gus染色效果。其中，1為無啟動子的空載體PBI101. 3 (對照)轉(zhuǎn)化；2為缺失片段1構(gòu)建載體(pBIlOl. 3-L1)轉(zhuǎn)化；3為缺失片斷2構(gòu)建載體(pBIlOl. 3_L2)轉(zhuǎn)化；4為缺失片段3構(gòu)建載體(pBIlOl. 3-L3)轉(zhuǎn)化；5為轉(zhuǎn)基因植株根染色效果；6為轉(zhuǎn)基因植株葉鞘染色效果；7為轉(zhuǎn)基因植株花染色效果；8為轉(zhuǎn)基因植株葉片染色效果；9為轉(zhuǎn)基因植株莖干染色效果。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。 實施例l椰子基因組DNA的抽提 高質(zhì)量的椰子基因組DNA通過CTAB法從幼嫩葉片中提取。材料液氮研磨后取0. lg加600 ii L CTAB提取液(含4% P -巰基乙醇)，繼續(xù)研磨使其懸浮均勻，置65。C水浴45min ;加700 y L苯酚:氯仿:異戊醇，37。C水浴鍋溫浴10min。 12000rpm離心10min ;取上清，加60ii L 5M NaCl， lmL冷凍無水乙醇，冰凍30min沉淀DNA ;10000rpm離心5min，棄酒精后風(fēng)干。風(fēng)干后的DNA加入TE，37。C水浴15-30min至DNA完全溶解，加700iiL氯仿異戊醇(24 : 1)，顛倒15min， 12000rpm離心5min ;取上清液，加30 ii L 5M NaCl， lmL冷凍無水乙醇-20。C沉淀30min， 10000rpm離心3min，棄上清；加70%酒精，10000rpm離心3min后棄上清，風(fēng)干；加100iiL，TE充分溶解后，加5iiL Rnase， 37。C水浴lh。再加200 y L氯仿異戊醇(24 : 1)，顛倒15min， 12000rmp離心5min ;取上清液，加30 ii L 5M NaCl， lmL冷凍無水乙醇，輕輕顛倒后-2(TC沉淀30min， 10000rpm離心3min ;棄酒精，加70X酒精浸泡，2h換一次，后浸泡過夜；8000rpm離心3min后棄酒精，風(fēng)干；加100 y L TE充分溶解。將獲得的DNA樣品稀釋1000倍后用分光光度計分別測定260nm和280nm處吸光值。應(yīng)用兩處的吸光值的比值計算樣品的純度，并通過260nm處吸光值計算樣品中的DNA含量。
實施例2 LPAAT基因上游啟動子序列的克隆和分析 甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因上游啟動子序列的克隆參照Universal GenomeWalkerKit(Clontech)的操作手冊進(jìn)行?；蚪MDNA先用4種平端內(nèi)切酶(EcoRI，Pvu II，Dra I，Stu I)分別酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后與特定接頭進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用于第一輪的巢式PCR反應(yīng)，甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因特異引物核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，接頭特異引物核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。PCR反應(yīng)程序為94°C 25s， 72°C 3min， 7個循環(huán)94°C 25s，67°C 3min，32個循環(huán)；67°C 7min。第二輪的PCR以第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為底物，應(yīng)用相同的擴(kuò)增程序，引物核苷酸序列分別如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接在pMD18-T(TaKaRa)上并進(jìn)行序列分析(TaKaRaBiotechnology Company, Dalian,China)。測序結(jié)果用植物啟動子專用分析軟件PlantCARE，進(jìn)行分析，在分析的基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步功能驗證。 實施例3植物表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化 為了驗證獲得啟動子區(qū)序列在組織特異性表達(dá)控制中的效果，三種不同5'端缺失的啟動子片段類型被用于植物表達(dá)載體的構(gòu)建。缺失片段分別插入啟動子驗證表達(dá)載體pBIlOl. 3，分別命名為pBIlOl. 3-L3， pBIlOl. 3_L2， pBI101.3_Ll。 3個片段缺失的位點分
6別為-896， -817和-453。 PCR擴(kuò)增引物兩端分別添加了 8個堿基的酶切位點HindIII和BamHI。相關(guān)引物序列分別為
plOHL核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示
pl01-2L核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示
pl01-3L核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示
plOl-R核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后用兩種酶分別酶切(HindIII and BamHI)并連入pBIlOl. 3載體中。相關(guān)操作均按照分子克隆實驗指南提供的方案進(jìn)行。未插入任何啟動子片斷的pBI101.3載體被作為陰性對照，連接后的載體用PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)行驗證，引物核苷酸序列分別如SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11所示。
實施例4轉(zhuǎn)基因操作及表達(dá)驗證 4種帶有不同甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子片斷的表達(dá)載體pBI101.3-Ll、pBIlOl. 3-L2、 pBIlOl. 3-L3和pBIlOl. 3_L0通過電擊轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105中水禾舀品禾中Zhonghimll(Oryza sativa L ssp.Japonica)，愈傷組織誘導(dǎo)及遺傳轉(zhuǎn)化的操作按照相關(guān)文獻(xiàn)提供的操作程序進(jìn)行，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株移栽至溫室進(jìn)行培養(yǎng)，直至種子完全成熟。 分別收取不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻植株的種子、葉片、葉鞘、莖干、花序和根進(jìn)行GUS染色，染色方法參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，染色結(jié)果在體式顯微鏡下觀察并拍照(圖2)。 甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中的應(yīng)用序列表
SEQUENCE LISTING
〈110>海南大學(xué) 〈120〉甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中的應(yīng)用
〈130〉
〈160〉 11 〈170>PatentIn version 3. 2
〈210>1
〈211>946
〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1gattecg皿ttcgagctcggtecccggggatcctctegagattectetegggcacgcgtg60gtcgacggcccgggctggteggragtgattttggaaccac120tec皿teggcctgatctettacggtgattttcagteatcactgccateggtteggtcatt180ctcactecacgcccagcccaccttettttggttttcctctttcgagcactctctctccct240cctctccaccgccagteagctcctcctcctctctccctcctctccaccatcagagcgctc300atccccggcatccctcgaccggccctgcctcctctttcttcctegccagcgctgcctcca360cccctgcctcctccttcttccttgactgaccccacctcctacttcttcctcggtcggccc420tecattctccttcttcctcgactegcctcacctcctgcttcttttttgatcggccctecc■
accttcccca cctccttctttcttgaccga cctcgcctccctctttttcg actggccttg540cctccagtct tgcctccttttttctcgacc agccctacctcctccctcactcctttttcc600ccaatcggcc ccatcttctctctctttctc tttctctcctctcttccattggccagaccc660actgcagccc cctcagcctttcttctctct cactccttctgtctctctcttcctgctttc720tcttatctat cactctctctcttctctctt tctctetttg gtctgcactctegaatcttc780tctttcttct ctctccaccaagaacccate gaatttgttcgttgctggattccgattccg840acctettcgc cagttccctactcggaaccc tcaaccctttacgtegtcctcgtttgcctt■tcttgctcgt ggtettggtggtggg皿gtg ggggatetetagtcct946〈210〉2〈211〉28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ttcggttggg acatcccgaagctcgctt28〈210>3〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>3gteatecgac tcactetegggc22〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gaacttgccc ctgaagcatccateggac28〈210>5〈211>19甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中的應(yīng)用序列表〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉5actatagggc acgcgtggt19〈210>6〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ataagcttgg cacgcgtggt cgacgg26
8
〈210>7〈211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>7ataagcttcc tgatctattacggtga〈210>8〈211>26 [o川]〈212>DNA 〈213〉人工序列〈400>8ataagcttcc ttctttcttgaccgac〈210>9〈211〉32〈212>DNA〈213〉人工序列<400>9atggatccag gact;atatatcccccacttc cc〈210>10〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10ggacacttta tgcttccggctc〈210>11〈211>21〈212>DNA<213>人工序列〈400〉11attccacagt tttcgcgatcc
權(quán)利要求
甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于所述甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列如SEQ ID NO1所示，該啟動子特異性表達(dá)于作物胚乳中，用于制備作物遺傳改良。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中 的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟(1) 將甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子插入啟動子驗證表達(dá)載體PBI101. 3，啟動gus 報告基因的表達(dá)；(2) 將上述表達(dá)載體用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物愈傷組織轉(zhuǎn)基因研究，通過植物愈傷 組織誘導(dǎo)、浸染、共培養(yǎng)、篩選、生根獲得轉(zhuǎn)基因植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良 中的應(yīng)用，其特征在于所述甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列來源于椰子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中 的應(yīng)用，其特征在于所述甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列的制備方法包括如下步 驟(1) 以椰子基因組DNA及椰子脂肪酸代謝酶為基礎(chǔ)，設(shè)計特異引物，引物序列如SEQ ID NO :2禾P SEQ ID NO :3所示；(2) 通過染色體步行法擴(kuò)增引物，得到甘油磷酸酯酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改 良中的應(yīng)用，其特征在于所述甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子序列含有1個TATA盒、6個 CAAT盒、4個5UTR胞嘧啶含量豐富區(qū)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中 的應(yīng)用，其特征在于所述甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子序列還含有一個胚乳特異表達(dá)的 順式作用原件Skn-l基序。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中 的應(yīng)用，其特征在于所述TATA盒位于-4， 6個CAAT盒分別位于-878、-877、-842、-356、-335 和+18， 4個5' UTR胞嘧啶含量豐富區(qū)分別位于-170、 -216、 -276和-326。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子區(qū)序列在作物遺傳改良中 的應(yīng)用，其特征在于所述順式作用元件Skn-1基序位于-127。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因啟動子區(qū)序列及其在作物遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子序列如SEQID NO1所示，該甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子在作物遺傳改良中的應(yīng)用方法為如下步驟(1)將甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶基因啟動子插入啟動子驗證表達(dá)載體pBI101.3，啟動gus報告基因的表達(dá)；(2)將上述表達(dá)載體用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物愈傷組織轉(zhuǎn)基因研究，通過植物愈傷組織誘導(dǎo)、浸染、共培養(yǎng)、篩選、生根獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明基因啟動子來源于椰子，能夠特異的啟動目的基因在胚乳組織細(xì)胞中的表達(dá)，為今后作物遺傳改良中提供了新的啟動子類型，具有很高的穩(wěn)定性和可操作性，不會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。
文檔編號C12N15/82GK101705242SQ200910193929
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者李東棟, 林擁軍, 鄭育聲 申請人:海南大學(xué)