專利名稱：一種根瘤菌科的基因及多肽和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物固氮技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種根瘤菌科的基因，以及具有所述基 因序列的多肽，所述基因與多肽在生物固氮方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)氮肥的制造是一個高耗能的過程，而生物固氮可以在常溫常壓下利用固氮酶 將空氣中的氮氣固定成氨，作為生命體系的氮素來源，既節(jié)省能源，又對環(huán)境友好。生物固 氮體系本身就是一座小化肥廠，原料來自空氣，取之不盡。在當(dāng)前能源日益緊張和環(huán)境日益 惡化的情況下，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究方法的進步，克隆生物固氮的相關(guān)的酶和它編 碼的基因，進行遺傳工程操作，使固氮酶基因在原核生物和植物組織內(nèi)表達，為節(jié)約能源、 改善環(huán)境和促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。生物固氮所涉及的固氮菌有三種類型，第一類是自生固氮菌，如藍(lán)細(xì)菌；第二類是 聯(lián)合固氮菌，如植物體內(nèi)的內(nèi)生固氮菌，巴西在甘蔗生產(chǎn)中使用聯(lián)合固氮體系，可為甘蔗提 供60%的氮素來源；第三類是共生固氮菌。共生固氮現(xiàn)象從1887年發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有120多年，世界各國的科學(xué)家花費了大量 的時間和精力對它進行研究，目前取得了不少進展，加深了我們對生物固氮的認(rèn)識和理解。 共生固氮菌的固氮效率高，但僅局限于豆科等少數(shù)植物。且共生固氮菌的共生基因、結(jié)瘤基 因、固氮基因和植物-根瘤菌的信號識別基因調(diào)控關(guān)系復(fù)雜。傳統(tǒng)的固氮酶基因家族大多是多個基因相互作用共同完成固氮過程，單個基因編 碼的多肽通常不能夠獨立進行固氮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種根瘤菌科的基因。本發(fā)明的另一個目的是提供具有上述根瘤菌科編碼基因的新的具固氮功能的多 肽。本發(fā)明還有一個目的是提供所述基因和多肽的應(yīng)用。所述新的固氮多肽及其編碼 的基因來源于原核生物根瘤菌科，不同于傳統(tǒng)的固氮酶基因家族有多個基因相互作用共同 完成固氮過程，單個基因編碼的多肽能夠獨立進行固氮。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)提供一種根瘤菌科的基因，具有SEQ ID NO 2所示序列。所述根瘤菌科的基因的擴增方法是(1)基因片段擴增設(shè)計正向引物和反向引物正向引物HnifF，5'-TGA CCC CAA GGC CGA CC-3'；反向引物HnifR，5' -GTG CCA TCA TCT CGC C_3'。對根瘤菌科的菌株進行PCR擴增，獲得了約1. 4kb的序列SEQ ID N01。
(2)使用反向PCR (inverted PCR)技術(shù)擴增根瘤菌科的菌株Ag 39序列SEQ ID NO 1片段兩端的序列獲得約3. 3kb的序列SEQ ID NO 2 ；(3)對序列SEQ ID NO 2進行生物信息學(xué)分析，獲得該基因的閱讀框架核苷酸序列 SEQ ID NO 3 ；同時獲得了該基因的氨基酸序列SEQ ID NO 4 ；(4)設(shè)計正向引物和反向引物，從根瘤菌中擴增SEQ ID NO 3所示基因；正向引物0rfF，5'-ATCG AAT TCCTC TCC TCG GTC GAT CGCCCA-3 ‘(含 EcoRI 酶切位點)；反向引物0rfR，5'-GCCA AGC TTCA TCC GTG TCC GTC CTTTCT G_3'(含 Hind III酶切位點)。本發(fā)明同時提供了一種新型多肽基因，將上述步驟⑷的PCR產(chǎn)物酶切后，克隆到 原核表達載體pET-32a-c (+)中，獲得轉(zhuǎn)化子，編號3_4，采用異丙基-口 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導(dǎo)，獲得了所述固氮多肽的表達，具有SEQ ID N03所示核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。采用乙炔還原法、總氮含量測定(凱氏定氮法)和15N2同位素標(biāo)記方 法進行檢驗和確定，證實所述多肽能夠固氮。本發(fā)明提供了所述基因和多肽在生物固氮方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種新的根瘤菌科的基因及具固氮功能的新型多肽，所述多肽不同 于傳統(tǒng)的固氮酶基因家族需要多個基因相互作用共同完成固氮過程，所述單個基因編碼的 多肽能夠獨立進行固氮，并可以在常溫常壓下利用固氮酶將空氣中的氮氣固定成氨，作為 生命體系的氮素來源，既節(jié)省能源，又對環(huán)境友好。


圖1本發(fā)明多肽電泳2對照樣將乙炔還原為乙烯的氣相色譜儀測定結(jié)果圖3樣品3-4將乙炔還原為乙烯的氣相色譜儀測定結(jié)果
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實施例11.新型多肽基因的獲得(1)基因片段擴增設(shè)計正向引物和反向引物正向引物HnifF，5'-TGA CCC CAA GGC CGA CC-3'；反向引物HnifR，5'-GTG CCA TCA TCT CGC C-3'。本發(fā)明人從內(nèi)蒙古響水灣沙漠中的Psammochloa villosa植物中分離到的一株固 氮菌，采用常規(guī)的苯酚_氯仿抽提方法提取總DNA，乙醇沉淀和洗滌，所用試劑為常規(guī)的分 子生物學(xué)試劑，對根瘤菌科的菌株的基因組進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系
10XPCR Buffer2. 5 u LdNTPmix (2. 5mmol. I71)0. 5 u LHnifF(25uM)0. 5 u LHnifR(25uM)0. 5 u LDNA 模板0. 5 ii LTaq 酶(4U/ u L)0. 5 u Ldd H2020 u L_反應(yīng)總體積25iiLPCR反應(yīng)條件(32個循環(huán))94°C 預(yù)變性4min94°C 變性 lmin60°C 復(fù)性 45s72°C 延伸 lmin30s72°C 延伸 lOmin電泳檢測，獲得了約1. Okb的序列SEQ ID NO 1。(2)使用反向PCRGnverted PCR)技術(shù)擴增上述序列的側(cè)翼序列根瘤菌科的菌株 Ag39基因組DNA的酶切將基因組DNA分別用4種常用的限制性內(nèi)切酶(EC0RI、HindIII、BamHI、PStI)進
行酶切反應(yīng)，酶切體系基因組DNA約 300ng限制性內(nèi)切酶酶2iiL限制性內(nèi)切酶buffer5u L10% BSA0. 2u L滅菌的超純水適量_總體積50iiL取5 u L進行核酸電泳檢測酶切是否完全，各酶切產(chǎn)物純化后，加入T4DNA liagase 分別進行DNA的自身環(huán)化。在酶切體系中加入4. 5 ii L的乙酸鈉(pH = 5. 2)及150 y L的 無水乙醇沉淀，12000rpm，離心lOmin，用70 %乙醇漂洗，真空干燥，復(fù)溶于38 y L無菌水中
待連接。(3)酶切產(chǎn)物自身環(huán)化(連接反應(yīng))連接體系10 XT4 連接 buffer 2. 5 u LT4DNA 連接酶1 P L酶切純化產(chǎn)物12iiL_滅菌的超純水to 20 U L12°C保溫16h，此基因組自身環(huán)化產(chǎn)物作為反向PCR模板。
(4)反向PCR反應(yīng)根據(jù)已知的IOOObp基因序列，設(shè)計引物HniHcF和HniHcR，序列分別為HniHcF 5' CAAGGCGAGATGATGGC-3‘
HniHcR 5' -CGTTGGTCGGCCTTGGG-3‘以基因組DNA自身環(huán)化的產(chǎn)物作為反向PCR反應(yīng)的模板進行反向PCR擴增。反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10XPCR Buffer2. 5 μ LdNTP mix (2. 5mmol. L-1) 0. 5 μ LHniHcF (25 μ Μ)0. 5 μ LHniHcR(25yM)0. 5 μ LDNA模板(連接產(chǎn)物)2 μ LTaq 酶(4U μ Γ1)0. 5 μ LddH2018. 5 μ L_反應(yīng)總體積25 μ LPCR反應(yīng)條件(32個循環(huán))95°C 預(yù)變性5min95°C 變性30s68°C 復(fù)性40 s72°C 延伸4min72°C 延伸IOmin_反向PCR擴增出序列SEQ ID NO 1片段兩端的序列，450bp和900bp，將反向PCR 得到的基因片段同已知的IOOObp基因片段用DNAStar中的Seqman軟件進行正確的拼接獲 得約3. 3kb的序列SEQ ID NO 2 ；(5)對序列SEQ ID NO 2經(jīng)DNAStar中ORF和MapDraw分析獲得該基因的閱讀框 架核苷酸序列SEQ ID NO 3。通過生物信息軟件序列處理在線工具包(The Sequence ManipulationSuite)中 的核苷酸序列與氨基酸序列轉(zhuǎn)換，將之前得到的核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列。序列分析 后即得該基因的氨基酸序列SEQ ID NO 4 ；(6)設(shè)計正向引物和反向引物，從根瘤菌屬中菌株土壤農(nóng)桿菌Ag39擴增SEQ ID NO 3所示基因；正向弓丨物0rfF,5' -ATcg aat tcctc tcc tcg gtc gat cgc cca_3'(含EcoRI 酶切位點)；反向引物0rfR，5'-GCCA AGC TTCA TCC GTG TCC GTC CTTTCT G-3'(含 Hind III酶切位點)。2.固氮基因片段的克隆用正向引物OrfF和反向引物OrfR進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN GmbH, Germany)純化，純化產(chǎn)物用于下面連接
反應(yīng)采用QIApr印 Spin Miniprep Kit 提取 pET32a(+)質(zhì)粒 DNA，試劑盒為 QIAGEN GmbH, Germany生產(chǎn)，按試劑盒說明書操作提取pET32a⑴質(zhì)粒DNA ；所述載體質(zhì)粒 pET32a(+) (Novagen)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的牛學(xué)峰博士饋贈。(3)將質(zhì)粒 pET32a (+)和 PCR 產(chǎn)物用 EcoRI 和 Hindi 11 雙酶切DNA 純化產(chǎn)物 10 ii l/pET32a(+)7 u L10 XH Buffer2 u LEcoRI1 u L10% BSA0. 2u L_ddH20to 20 u L37°C保溫2h后加入10 XM Buffer 3 u LHindlll1 u L_ddH20to 30載體37°C保溫2h，PCR產(chǎn)物保溫4h后，取5iiL電泳檢測確定酶切是否完全，在酶 切體系中加入3 y L的乙酸鈉(pH = 5. 2)及100 u L的無水乙醇沉淀，12000rpm,離心lOmin， 用70%乙醇漂洗，真空干燥，復(fù)溶于10 y L無菌水中待連接。(4)連接體系10 X連接緩沖液 2. 5iiLT4DNA 連接酶liiLDNA0.06pmol-0. 3pmol載體0. 03pmol_ddH20to 20 u L(5) 14°C連接過夜(大概14h左右)，連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化或保存于-20°C。(6)從-70°C冰箱中取200 u L感受態(tài)細(xì)胞懸液(DH5 a )，室溫下使其解凍，解凍后 立即置冰上，加入10 y L連接液，輕輕搖勻，冰上放置30min后42°C水浴中熱擊90秒，熱擊 后迅速置于冰上冷卻3 5min，向管中加入500 u L LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母 浸膏5g/L，NaCl 10g/L，用NaOH調(diào)節(jié)pH值7. 5，高壓滅菌；不含氨芐青霉素(Amp))，混勻后 37°C振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Amp+)，將 上述菌液搖勻后取100 u L涂布于含Amp的LB平板上；(7)待轉(zhuǎn)化子長出后鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，用下述方法鑒定陽性克隆子A快速鑒定挑取單菌落，涂圈于平板，培養(yǎng)8h，刮取菌落少許于50PL 2 X Cracking gel Buffer (0. 2N NaOH，0. 5 % SDS，20 %蔗糖)，振蕩，室溫 5min，加入 4 ii L lmol I^KCl，溴酚藍(lán)(0. 25% ) (3 1)混合液，冰上5min，離心5min,電泳檢測。B菌落PCR快速鑒定刮取菌落少許進行PCR擴增，反應(yīng)體系中引物為載體的通用引物M13，反應(yīng)循環(huán)數(shù)減少，其余同目的基因擴增；PCR完畢后用2%的瓊脂糖電泳鑒定。C酶切鑒定提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI雙酶切。酶切產(chǎn)物用2%的 瓊脂糖電泳鑒定。(8)選取鑒定好的轉(zhuǎn)化子命名為3-4，應(yīng)用Sanger雙脫氧終止法進行雙鏈DNA的 核苷酸序列測定，測序工作由上海Invitrogen公司完成。(9)序列分析即獲得序列SEQ ID NO 1。(10)通過生物信息軟件序列處理在線工具包(The SequenceManipulation Suite)中的核苷酸序列與氨基酸序列轉(zhuǎn)換，將之前得到的核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列。 序列分析后即得該基因的氨基酸序列SEQID N02。本發(fā)明實施例雖然采用從內(nèi)蒙古響水灣沙漠中的Psammochloavillosa植物中分 離到的固氮菌菌株的基因組進行PGR擴增獲得所述基因，但實際應(yīng)用中的基因序列的獲得 與菌株沒有關(guān)系，可采用現(xiàn)有的基因合成儀器人工合成所述基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可 以從其它類似的菌株里克隆到所述基因。3.基因片段的克隆分別將重組質(zhì)粒3-4和載體質(zhì)粒pET32a(+) (Novagen)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中， 方法同上述轉(zhuǎn)化方法。所述大腸桿菌BL21由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的牛學(xué)峰博士饋贈。鑒定后進行下面的目的基因的表達。表達步驟為(1)分別挑取大腸桿菌BL21(3-4)及BL21 (pET32a (+))單菌落，在含有100ug mL—1 的氨芐青霉素的5mL的LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取上述過夜菌液lmL轉(zhuǎn)至100mL LB (含100ug ml/1 Ml Amp)培養(yǎng)液中，37°C， 200rpm繼續(xù)培養(yǎng)2 3h至0D6(1(1值為0. 6左右；(3)加入IPTG至終濃度為0. 4mM,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3h ；(4)收集細(xì)胞菌體；(5)用PBS緩沖液洗菌體兩次，4倍上樣緩沖液裂解細(xì)胞，使其終濃度為150mg mL—1，放入95°C下加熱lOmin，并以4000rpm離心2min?？芍苯由蠘舆MSDS-PAGE檢測表達 情況4.新型多肽樣品的純化(1)分別挑取大腸桿菌BL21 (3-4)及BL21 (pET32a(+))單菌落，在含有100ug mL—1 的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；(2)將過夜培養(yǎng)的菌液按照1 100接種到新的LB (含lOOug mL^Amp)培養(yǎng)液中， 37°C，180rpm培養(yǎng)至0D600 = 04 0. 8，加入IPTG至終濃度為0. 4mmol I^JSt繼續(xù)培養(yǎng) 3h ；(3)收集菌體，用滅菌的超純水洗菌體兩遍，棄盡上清，按照lOmLg—1菌體的比例加 入磷酸緩沖液(50mm 的磷酸緩沖液，PH = 7. 4 即:81mL0. 2mmol I71 的 Na2HP04,19mL 0. 2mol L—1的NaH2P04用超純水定容到400mL)；(4)充分懸浮細(xì)胞，用JG-IA高壓細(xì)胞破碎機破碎細(xì)胞；(5)收集破碎液，4°C，13000rpm離心30min，轉(zhuǎn)移上清，用0. 22um的濾膜過濾； BL21(pET32a(+))表達后的過濾濾液記為對照，以備BL21 (3_4)表達的濾液純化。(6)取BL21 (3-4)表達后過濾濾液加2M咪唑溶液，使終濃度為20mM，純化前用5 IOmL平衡緩沖液平衡預(yù)裝柱(His SpinTrap Kit(GEHealthCare))然后取濾液以0.5mL HiirT1上樣，分管收集；用15mL平衡緩沖液(同上50mm的磷酸緩沖液含有20mM咪唑)洗去未吸附的樣 品，流速1 2mL miiT1，分管收集；用15mL洗滌緩沖液洗(同上50mm的磷酸緩沖液含有40mM咪唑)去未吸附的樣 品，流速1 2mL miiT1，分管收集；用5mL洗脫緩沖液洗(同上50mm的磷酸緩沖液含有500mM咪唑)洗脫樣品，流速 1 2mL mirT1，分管收集；此樣品即為純化的多肽樣品3_4。最后用5mL平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉，以備下次使用。實施例2乙炔還原法測定固氮酶活性以大腸桿菌BL21為對照樣，分別取對照樣和和轉(zhuǎn)化子3-4各3mL，接入膠塞試管 中，向試管中注入1/10體積的乙炔氣體，37°C恒溫箱培養(yǎng)24h后用氣相色譜測定固氮酶活 性，轉(zhuǎn)化子能夠?qū)⒁胰策€原為乙烯；用氣相色譜儀測定各反應(yīng)液中的乙烯的生成，對照樣和 樣品3-4的還原結(jié)果分別見附圖2和附圖3，其中，附圖2為對照樣的還原結(jié)果，附圖3為 樣品3-4的還原結(jié)果，附圖2和附圖3中，曲線1代表甲烷，曲線2代表乙烯，曲線3代表乙 炔。由附圖2和附圖3可知，編號3-4的轉(zhuǎn)化子可成功有效地將乙炔還原為乙烯，另外還伴 隨了甲烷的生成。實施例3分別取上述對照和轉(zhuǎn)化子3-4樣品各3mL，接入膠塞試管中，用膠塞封口，37°C恒 溫箱培養(yǎng)24h后取樣用流動注射分析儀采用納什試劑比色法直接進樣測定NH4+濃度，結(jié)果 見下表1 表1對照與樣品中的NH4+濃度 注表中數(shù)值為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差；同一行中標(biāo)有小寫英文字母表示Duncan多重 比較差異顯著(P <0.05)；以下表中出現(xiàn)的字母具有相同含義。由表1中可見，轉(zhuǎn)化子樣品3-4中NH4+濃度顯著增加，說明轉(zhuǎn)化子3_4能將空氣中 的N2,轉(zhuǎn)化為NH4+。實施例4直接提取轉(zhuǎn)化子編號3-4的新型多肽，經(jīng)過His SpinTrap Kit (GEHealthCare)柱 純化后，得到純化后的新型多肽，將該新型多肽0. 5mg加入5mL 50mM pH6. 8的磷酸鹽緩沖 液中，于37°C放置24小時，水浴加熱30分鐘，使多肽失活作對照，按3 1的H2 15N2比 例，充入15N2標(biāo)記的混合氣體5mL。用質(zhì)譜儀分析各反應(yīng)液中15N豐度，結(jié)果見下表2
表2各樣品中的15N豐度 由表2中可見，新型多肽液中，15N豐度atm%比對照明顯增加，說明該多肽能將空 氣中的15n2，轉(zhuǎn)化為15nh4+。sequence listing<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120> 一種根瘤菌科的基因及多肽和應(yīng)用<130><160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1041<212>dna<213>人工序列<400>1
0178]tgaccccaaggccgaccaacggtgaagaccatacccgccgtgacgagcaacgccgaaacc600179]atgcggcttttttttgctgaaacacctacgctcatcatcgtcctcataacgccaaaatcc1200180]tgcaaaccacctgaacaggtggaaactaaggcaccccgcttcgaagaaagttcagcgtct1800181]ccacgaacgaggccttacaaatcaacgcctcaaagcaagccaagcgaaattgaacgatcg2400182]cgacgcgcttcaggacggaaagcaccatcgctctaatccagtcccacccgaactgcaatc3000183]ctcagaaccgccgctcccgcggcggacaagcaaagtttcatcaaacgaaattttcagcaa3600184]aaacaggttgaccaaagacccgcggttcgtatagtccgccgcataccaaccgacacgctt4200185]cggagttgcccctttggcggaattggtagacgcgcctgactcaaaatcaggttccgaaag4800186]gagtgctggttcgattccggcaaggggcaccaataaatttctccagtaccgaaaacgctg5400187]ttcattcactgtttccgattgtgtttcggtggaagcctgaaaaggcattttgatttggac6000188]gccgatctaacataaatcacaaaaaacagcaggatatacgccgaggacagtgaatgccca6600189]ccatcagtatcggactacccgtctataatggaggggatcatctcaagacatgcctggaat7200190]cgatactagcgcagagctttcaagacttcgaagtcttcatttctgataactcttcgacgg7800191]ataacacgcaacaaatttgcgagcatttcgcgcggattgataatcgtatcacgtatgtca8400192]ggcaacctgacaatattggcgcagcgagcaactttcggtttgtgttcgaacgaacatcat9000193]caccactgttcaagtggatggctcacgacgactggatagacgatgattggctttcccagc9600194]ttgtacctgcagcaataaaagagcaagcaatcgtcttcggccatctccaaatgataacgt10200195]atcaaggcgagatgatggcac1041 <210>2
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一種根瘤菌科的基因，其特征在于具有SEQ ID NO 2所示序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于是設(shè)計正向引物和反向引物，通 過PCR方法進行固氮基因的擴增得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述正向引物和反向引物為 正向引物:Hnif F，5' -TGA CCC CAA GGC CGA CC_3'；反向引物:Hnif R，5' -GTG CCA TCA TCT CGC C_3'。
4.一種多肽基因，其特征在于具有SEQ ID NO 3所示序列。
5.一種權(quán)利要求4所述多肽基因的獲取方法，其特征在于是對權(quán)利要求1所述基因進 行生物信息學(xué)分析，獲得其閱讀框架核苷酸序列。
6.一種多肽，其特征在于具有SEQ ID NO 4所示多肽序列。
7.—種權(quán)利要求6所述多肽的表達方法，其特征在于是設(shè)計正向引物和反向引物，擴 增SEQ ID NO 3所示基因；將擴增產(chǎn)物酶切后克隆到原核表達載體中，獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)和純化得到。
8.—種權(quán)利要求6所述多肽的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的生物固氮。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述多肽是將空氣中的N2固定還原為NH4+ 應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根瘤菌科的基因及多肽和應(yīng)用。所述根瘤菌科的基因具有如SEQ ID NO 2所示DNA序列；所述多肽基因具有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示氨基酸序列。本發(fā)明采用乙炔還原法、總氮含量測定(凱氏定氮法)和15N2同位素標(biāo)記方法進行檢驗和確定，證實所述多肽具有固氮酶活性，能夠?qū)⒖諝庵械腘2固定，還原為NH4+，可作為生物固氮的新技術(shù)應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/70GK101875939SQ20091019421
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者何玉梅, 彭桂香, 譚志遠(yuǎn) 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)